HPLC法檢測海藻糖的研究

趙偉，段瑩瑩，張曰輝，曹大鵬，周生民，馮文紅

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

HPLC法檢測海藻糖的研究

趙偉，段瑩瑩，張曰輝*，曹大鵬，周生民，馮文紅

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

建立了一種利用高效液相色譜法檢測葡萄糖、麥芽糖和海藻糖混合溶液中海藻糖的方法。采用Xbridge-NH2色譜柱，流動相為乙腈/水=4∶1加0.1%的氨水，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，該條件下葡萄糖、麥芽糖、海藻糖能完全分開，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的質(zhì)量濃度在0.1～4.0 g/100 mL范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60%，回收率為98.2%～99.4%。

高效液相色譜法；檢測；海藻糖；混合溶液

海藻糖是一種被稱為生命之糖的非還原性二糖，有使細胞膜及蛋白質(zhì)等生物大分子穩(wěn)定的作用[1]，能使干燥脫水后的生物體以極低乃至停止新陳代謝的形式被保護，一旦環(huán)境許可，生物體即能復(fù)活，而不損害生命物質(zhì)[2]。海藻糖能保護酵母菌的胞吞作用不受其產(chǎn)生的酒精的抑制[3]，海藻糖的強表達能提高在高滲透壓下大腸桿菌的生長能力[4]，海藻糖在食品、醫(yī)藥、保健、化妝品以及農(nóng)作物育種方面也有廣泛的應(yīng)用[5]。海藻糖的生物合成方法有利用生物自然合成[6-8]和酶法合成[9-13]。海藻糖合成酶是由NISHIMOTO T等[13]從脂肪桿菌屬（Pimelobacter sp.）R48和水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中最早發(fā)現(xiàn)并提純的。國際上，日本等國以淀粉為原料，通過酶法反應(yīng)成功進行了海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)，為其的進一步應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)[2]。海藻糖轉(zhuǎn)化酶能夠?qū)Ⅺ溠刻寝D(zhuǎn)化為海藻糖[10]。有很多方法可以對海藻糖的含量進行測量，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-12]、蒽酮-硫酸法[13]、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[14]等，但是這些方法不能簡便準(zhǔn)確的測定溶液中海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的含量。為了對海藻糖轉(zhuǎn)化酶的反應(yīng)條件進行優(yōu)化，需要測定海藻糖轉(zhuǎn)化率，本研究用示差折光檢測器和氨基柱的高效液相色譜法對溶液中海藻糖所占比例進行測定，該方法能夠準(zhǔn)確測定混合溶液中海藻糖，麥芽糖和葡萄糖各自的含量，比其他方法更加簡便準(zhǔn)確，以期為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻糖、麥芽糖、葡萄糖：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；氨水：萊陽市康德化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20 AT型HPLC色譜儀（配Waters515泵、Waters 2414型示差折光檢測器、N2000雙通道色譜工作站、柱溫控制系統(tǒng)）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XBridgeTMNH2（3.5 μm×4.6 μm×250 mm）；柱溫：35℃；流動相：V乙腈∶V水=4∶1，配好后加0.1%氨水；流速：1.0 mL/min；檢測器溫度：40℃。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取葡萄糖、麥芽糖、海藻糖各1.000 0 g，將這三種糖定容至100 mL容量瓶中，搖勻后超聲混勻20 min，進樣前用0.22 μm的濾膜過濾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用超純水分別配制質(zhì)量濃度分別為0.1 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.4 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.6 g/100 mL、3.2 g/ 100mL、4.0g/100mL葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的確定

文獻中測定海藻糖一般用氨基柱，流動相為V乙腈∶V水為4∶1，流速為1 mL/min，但是本試驗用Xbridge-NH2色譜柱時測得的麥芽糖和海藻糖均為駝峰，在流動相中加入0.1%的氨水后，駝峰消失，峰型良好，由于氨水易揮發(fā)，不會對儀器設(shè)備產(chǎn)生影響，因此本試驗選用其作為胺修飾劑，葡萄糖、麥芽糖和海藻糖的分離效果好，能夠準(zhǔn)確的測量各糖的含量，滿足分析溶液中海藻糖的含量。

2.2 組分的定性定量分析

分別進1%的葡萄糖、麥芽糖和海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)保留時間定性分析，根據(jù)外標(biāo)法進行定量分析，然后進混合標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果分離度良好，混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standards

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

以糖質(zhì)量濃度（x，g/100 mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖、麥芽糖及海藻糖HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，相關(guān)系數(shù)與回歸方程見表1。

由表1可知，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的質(zhì)量濃度為0.1～4.0 g/100 mL時與峰面積呈良好線性，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9。

2.4 精密度試驗

對海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品所配溶液連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，結(jié)果見表2。

圖2 葡萄糖(A)、麥芽糖(B)及海藻糖(C)的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for HPLC analysis of glucose(A),maltose(B) and trehalose(C)

表1 相關(guān)系數(shù)與線性方程Table 1 Correlation coefficient and linear equation

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of precision test

由表2可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.60%，在5.0%誤差范圍內(nèi)，說明該方法精密度良好。

2.5 回收率試驗

取三份樣品分別加葡萄糖、麥芽糖、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，回收率結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，這三種糖的回收率為98.2%～99.4%，符合回收率在95%～105%的標(biāo)準(zhǔn)，說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

本試驗建立了用Xbridge-NH2色譜柱測定海藻糖的HPLC方法，同時摸索出使葡萄糖、麥芽糖、海藻糖三種混合物完全分離的測定方法，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.60%，回收率為98.2%～99.4%。該法簡單快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于研究或生產(chǎn)海藻糖的含量測定。

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Determination of trehalose by HPLC

ZHAO Wei,DUAN Yingying,ZHANG Yuehui*,CAO Dapeng,ZHOU Shengmin,FENG Wenhong
(Shangdong Fuyang Biotechnology Co.,Ltd.,Dezhou 253100,China)

A HPLC method for the detection of trehalose in the mix solution of glucose,maltose and trehalose was established.The sample was separated by Xbridge-NH2chromatographic column,using acetonitrile:water=4∶1 supplemented with 0.1%NH4OH as the mobile phase,the flow rate 1.0 ml/min,the column temperature 35℃.Under this condition,glucose,maltose,and trehalose were completely separated.When the concentration of glucose,maltose,trehalose was in the range of 0.1-4.0 g/100 ml,the concentration and the peak area had a good linear relationship,R2was 0.999 8-0.999 9,relative standard deviation was 1.60%,and the recovery rate was 98.2%-99.4%.

HPLC;detection;trehalose;mixed solution

O657.7

A

0254-5071（2014）10-0148-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.036

2014-09-01

趙偉（1979-），女，工程師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：張曰輝（1987-），女，工程師，碩士，研究方向為微生物與酶技術(shù)。