錦州筆架山海域海產品中副溶血弧菌的分子流行病學調查

樊曉琳，張德福，付緒磊，劉雪飛，孫嘉營，白鳳翎，勵建榮

（渤海大學食品科學研究院，渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州121013）

錦州筆架山海域海產品中副溶血弧菌的分子流行病學調查

樊曉琳，張德福，付緒磊，劉雪飛，孫嘉營，白鳳翎，勵建榮*

（渤海大學食品科學研究院，渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州121013）

為了解錦州筆架山周邊海域海產品中副溶血弧菌的污染狀況，實驗室隨機采集了藍圓鲹等共103份常見的海產品，按照GB/T 4789.7-2008及PCR方法對副溶血弧菌進行了分子流行病學調查。結果顯示，隨機抽檢的103份樣品中，檢測出含副溶血弧菌的樣品38份，檢出率為37%。這表明，錦州筆架山周邊海域常見海產品受副溶血弧菌污染十分嚴重，具有極大的食品安全隱患。

海產品，副溶血弧菌，食源性疾病，分離鑒定，流行病學調查，PCR

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性菌，呈短桿狀或弧狀，是一種常見的嗜鹽菌，廣泛地分布于近海岸海水、海底沉積物和魚、蝦、蟹等海洋生物中[1-2]。人們多因食用被該菌污染的海產品而引發食物中毒，患者可出現腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等典型的腸胃炎癥狀，重者甚至危及生命[3-5]。據我國食源性疾病監測網數據顯示，在我國沿海城市，副溶血弧菌引起的食物中毒已經高居微生物性食物中毒的首位[6]。

隨著經濟的增長和人們生活水平的提高，海產品的消費量日益增加，隨之而來的由副溶血弧菌所引起的食源性疾病時常出現。本實驗室對2013年6月～9月錦州筆架山海域的海產品進行了隨機取樣調查，采用生理生化和分子生物學的方法對樣品中分離的副溶血弧菌進行鑒定，以充分了解錦州筆架山海岸海產品受副溶血弧菌的污染狀況，為防治副溶血弧菌所引起的食源性疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血弧菌標準菌株ATCC 17802 購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，由本實驗室保存；實驗樣品 2013年6～9月采自于錦州市筆架山沿岸多個地點的藍圓鲹10份、多春魚13份、鋸緣青蟹10份、四角蛤蜊20份、鮑魚15份、青柳蛤15份和縊蟶20份，共103份樣品；3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；科瑪嘉弧菌顯色培養基

上海科瑪嘉微生物技術有限公司；副溶血弧菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組柱式DNA小量制備試劑盒、DNA Marker、瓊脂糖、rTaqm ix 2×、引物 上海生工生物工程有限公司合成；革蘭氏染色液、1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液（用前配制）、1%α-萘酚-乙醇溶液、靛基質試劑、液體石蠟、甘油等 由本實驗室配制。

Mastercycler pro梯度PCR儀 德國艾本德股份有限公司；Thermo Micro 17R臺式冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；FA1004型精密電子天平 鄭州寶晶電子科技有限公司；Nikon EcLipse 80i型顯微鏡 日本尼康株式會社；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 東聯哈爾（北京）儀器制造有限公司；MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌器 三洋電機（廣州）有限公司；SPX 150型智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集與處理 在錦州筆架山海岸多個地點采集新鮮的藍圓鲹等海產品共103份。將其中的魚類樣品用75%乙醇對其體表消毒，然后無菌操作取出其內臟、腮和魚肉；貝類樣品先用清水沖去表面的污泥，然后用鑷子撬開外殼，取出全部的貝肉和內臟。將取出的樣品放在無菌培養皿上，用無菌剪刀剪碎后稱取25g加入到有225m L APW的錐形瓶中，37℃培養12h。

1.2.2 細菌的分離培養 取培養12h后的混合物，挑取1環接種于TCBS瓊脂培養基上37℃培養12～14h。挑取TCBS上的綠色單菌落接種于科瑪嘉弧菌顯色培養基上37℃培養12～14h。挑取科瑪嘉弧菌顯色培養基上的紫紅色單菌落經過3代純化后進行后續實驗并于-80℃保存。

1.2.3 革蘭氏染色和生理生化實驗 挑取上述科瑪嘉弧菌顯色培養基上的紫紅色單菌落進行革蘭氏染色，并于1000×光學顯微鏡下觀察菌落形態并記錄。

對革蘭氏染色后確定為革蘭氏陰性，呈弧狀或桿狀的細菌進行生理生化實驗。先進行初篩實驗，包括氧化酶實驗、動力實驗和嗜鹽性實驗；后進行復篩實驗，包括H2S實驗、V-P實驗、靛基質實驗、糖發酵實驗和氨基酸脫羧酶實驗。同時用副溶血弧菌標準菌株ATCC17802做對照，觀察各實驗中的現象并記錄。

1.2.4 分子生物學鑒定

1.2.4.1 PCR擴增groEL特異性基因 挑取生化鑒定后的可疑菌株接種于APW的培養基中，37℃培養12h，取培養后的菌液1m L按照細菌基因組柱式DNA小量制備試劑盒的操作說明，提取DNA。根據Hossain[7]的報道，選取副溶血弧菌的groEL特異性基因的引物及PCR反應體系，對初步鑒定的疑似副溶血弧菌進行分子生物學鑒定。

1.2.4.2 16S rDNA檢測及同源性分析 以1.2.4.1中提取的DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物[8]（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTG TTACGACTT）進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL， PCR反應條件為：94℃預變性2m in，94℃變性1m in，60℃退火1min，72℃延伸95s，30個循環，延伸10min。擴增后的產物經割膠回收后，送往上海生工生物工程有限公司測序。

測序后的結果用NCBI在線數據庫中的BLAST程序分析，并應用MEGA 5.0.5軟件，采用Neighbour-Joining方法構建副溶血弧菌的系統進化樹，對分離細菌的同源性進行比較。

2 結果與討論

2.1 副溶血弧菌的分離

副溶血弧菌在TCBS上的典型菌落為綠色或藍綠色、圓形、半透明、邊緣整齊、濕潤且有粘稠感，在科瑪嘉弧菌顯色培養基上的典型菌落為紫紅色菌落。采集的103份樣品中，69份樣品在TCBS上呈綠色或藍綠色單菌落；這69份樣品中有42份在科瑪嘉弧菌顯色培養基上呈紫紅色。

由上述實驗結果可以看出，在用TCBS選擇培養基分離細菌的同時，還應該增加科瑪嘉弧菌顯色培養基的分離步驟，這樣可以提高結果的準確性。這主要是由于，盡管TCBS是一種選擇性培養基，但是在這種培養基上不只是副溶血弧菌會出現綠色或藍綠色菌落，其他的一些海洋弧菌，如創傷弧菌、霍利斯弧菌和擬態弧菌也會呈現綠色或藍綠色菌落[9]，但是這三種海洋弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養基上的顏色分別是綠色、乳白色和綠色[10]，可以與副溶血弧菌的紫紅色明顯區分開[11]。可見，在檢測副溶血弧菌時，增加科瑪嘉弧菌顯色培養基分離的步驟可以排除其他一些弧菌的干擾。

2.2 革蘭氏染色和生理生化實驗

將得到的42份可疑菌株進行革蘭氏染色，結果顯示，42份樣品在顯微鏡下觀察均為革蘭氏陰性細菌且呈短桿狀或弧狀，不規則分布。

鏡檢后的42份可疑樣品經過初篩實驗，其結果表明，42份樣品在氧化酶實驗中均為陽性即先呈現粉紅色后變為鮮藍色，這與副溶血弧菌標準菌株實驗結果相符合。副溶血弧菌標準菌株在無NaCl的胰胨水中不生長，而在含NaCl濃度為3%、6%和10%的胰胨水中均生長，且在3%和6%的NaCl的胰胨水中生長較旺盛；在3%NaCl三糖鐵瓊脂中的反應為分解葡萄糖，產酸不產氣，不發酵乳糖，有動力。經過嗜鹽性實驗和動力學實驗的42份樣品中，有2份樣品在含NaCl濃度為10%的胰胨水中不生長，有2份樣品在3% NaCl三糖鐵瓊脂實驗中產H2S，不分解乳糖和葡萄糖。經過初步鑒定實驗，可以排除4份樣品，初步篩選出38份可疑樣品。對初篩后的38份可疑樣品進行復篩實驗其結果顯示，除V-P實驗（+/-為31/7）和蔗糖發酵實驗（-/+為28/10）外，其他結果均與副溶血性弧菌標準株ATCC17802相符合，根據復篩實驗結果并結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]可知，38份可疑樣品均為副溶血弧菌。復篩菌株的生化鑒定結果與標準副溶血弧菌的對比見表1。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 PCR擴增groEL特異性基因 經生化鑒定后的

38份副溶血弧菌樣品經PCR鑒定均能擴增出約500bp的目的條帶（見圖1），表明分離得到的38份樣品均為副溶血弧菌。

圖1 部分副溶血弧菌分離株的PCR擴增結果Fig.1 PCR products of partial V.paraheamolyticus

表1 分離菌株的生化鑒定結果與標準副溶血弧菌對比Table 1 Comparison of Vibrio paraheamolyticus seafood isolatswith type strain in biochemistry tests

2.3.2 16S rDNA檢測及同源性分析 分離得到的38份副溶血弧菌樣品根據本研究室的命名規則分別命名為：分離自藍圓鲹的IFS13001～IFS13003、多春魚的為IFS13004～IFS13008、鋸緣青蟹的為IFS13009～IFS13011、四角蛤蜊的為IFS13012～IFS13021、鮑魚的為IFS13022～IFS13025、青柳蛤的為IFS13026～IFS13031、縊蟶的為IFS13032～IFS13038。

圖2 部分副溶血弧菌分離株的16S rDNA擴增結果Fig.2 16S rDNA PCR products of partial V.parahaemolyticus isolates

上述38份分離株經16S rDNA檢測均能擴增出約1100bp的目的條帶（見圖2）。測序結果與NCBI上的副溶血弧菌序列對比，結果顯示分離得到的38份樣品與現有的副溶血弧菌序列普遍具有較高的同源性。用MEGA 5.0.5軟件（http：//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.htm l，http：//www.megasoftware.net/）中的Neighbour-Joining方法構建了副溶血弧菌的系統進化樹（見圖3）。可以看出38株副溶血弧菌樣品大致可以分為兩組，其中同源性較高的樣品主要有：ISF13020和ISF13034、ISF13011和ISF13028、ISF13014和 ISF13024、ISF13023和 ISF13035、ISF13009和ISF13015等。

圖3 基于16S rDNA序列的副溶血弧菌分離株系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of V.parahaemolyticus isolates based on 16S ribosomal DNA sequences

2.4 副溶血弧菌的檢出率

從103份海產品中檢出38株副溶血弧菌，其中藍圓鲹3株、多春魚5株、鋸緣青蟹3株、四角蛤蜊10株、鮑魚4株、青柳蛤6株和縊蟶7株，總檢出率高達37%，各樣品的檢出率見表2。

從表2中7種海產品的檢出率來看，貝類產品受副溶血弧菌的污染最為嚴重，其中四角蛤蜊的檢出率高達50%，青柳蛤檢出率達40%。因此，消費者在食用這類產品時，切忌生食，一定要充分煮熟后食用。

本文采集樣品的時間是6～9月，正是副溶血弧菌生長繁殖旺盛期，因此極具代表性。本研究結果顯示副溶血弧菌的檢出率為37%，與張蘭榮等[13]報道的通州區超市、菜市場海產品中副溶血弧菌檢出率為35%相近，高于趙雪琴等[14]報道的2010年杭州市下城區副溶血弧菌24%的檢出率，低于江艷華等[15]報道的青島市售貝類副溶血弧菌的檢出率57.3%。與國外文獻報道的檢出率也存在一定的差異，如Paydar等[16]報道在馬來西亞海產品零售市場和大型綜合超市副溶血弧菌的檢出率為29%，Abd-Elghany等[17]報道在埃及曼蘇拉城市采集的120份海產品中副溶血弧菌的檢出率為16.7%。這可能是由于樣品采集的時間、地點和種類不同，導致檢出率的差異。

Molecular epidemiological investigation of Vibrio parahaemolyticus inseafoods surrounding coast of Bijiashan，Jinzhou

FAN Xiao-lin，ZHANG De-fu，FU Xu-lei，LIU Xue-fei，SUN Jia-ying，BAI Feng-ling，LI Jian-rong*
（Research Institute of Food Science，Bohai University，College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center ofFood Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

In order to investigate the Vibrio paraheamolyticus pollution status in seafoods of Bijiashan surroundingcoast，Jinzhou，one hundred and three seafoods were randomly sampled and then V. parahaemolyticus wereidentified according to the method of GB/T 4789.7-2008 combined with a PCR assay. Thirty-eight strains ofV. parahaemolyticus were isolated from samples with a detection rate of 37% ，which demonstrated thatseafoods of Bijiashan surrounding coast were seriously polluted by V. parahaemolyticus and the consumersmight encounter huge food safety hazards.

seafood ； Vibrio paraheamolyticus ； foodborn disease ； isolation and identification ； epidemiologicalinvestigation；PCR

TS201.6

：A

：1002-0306（2014）16-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.001

2013-12-19 *通訊聯系人

樊曉琳（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食源性病原微生物的檢測、控制及致病機理。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點實驗室開放課題（LNSAKF2013018，LNSAKF2011040）；渤海大學博士科研啟動項目（BSQD022）。