酶電極法快速測(cè)定黃原膠中乙醇含量

楊瑛

（廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，河北廊坊065001）

酶電極法快速測(cè)定黃原膠中乙醇含量

楊瑛

（廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，河北廊坊065001）

采用酶電極法對(duì)市售黃原膠中乙醇含量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)優(yōu)化了儀器進(jìn)樣條件及樣品前處理?xiàng)l件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用酶電極法測(cè)定乙醇，該方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.9994；方法的檢出限為0.02%；儀器檢測(cè)速度為20s；測(cè)得不同濃度下方法的回收率為83.3%～93.3%；精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在3%以下，穩(wěn)定性好。該方法操作簡(jiǎn)單，能滿足對(duì)黃原膠產(chǎn)品中的乙醇含量的快速檢測(cè)。

酶電極法，黃原膠，乙醇，快速檢測(cè)

黃原膠是野油菜黃單胞菌以玉米淀粉為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)的一種多糖產(chǎn)品[1-3]，根據(jù)美國(guó)藥典中對(duì)有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)-溶劑殘留限量的要求，產(chǎn)品中乙醇?xì)埩粝蘖繎?yīng)不得高于0.05%[4]。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)黃原膠產(chǎn)品中的乙醇含量還沒(méi)有出具相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，這給企業(yè)對(duì)黃原膠產(chǎn)品的乙醇控制帶來(lái)一定難度。結(jié)合黃原膠產(chǎn)品的粘性，需要開(kāi)發(fā)出一種便捷的乙醇速測(cè)方法，以滿足企業(yè)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)需要。

痕量乙醇的測(cè)定方法主要包括化學(xué)氧化法[6]、分光光度法[7]、重鉻酸鉀比色法[8-9]、頂空氣相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12-17]、酶電極法[18-20]等。其中化學(xué)氧化法操作過(guò)程復(fù)雜，且因?yàn)閮x器和人為因素干擾會(huì)使測(cè)定結(jié)果與實(shí)際值存在一定誤差；分光光度法和重鉻酸鉀比色法受樣品顏色干擾較為嚴(yán)重；頂空氣相色譜法和氣相色譜法價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、大大提高了企業(yè)的檢測(cè)成本，故在指導(dǎo)生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用中受到較大限制。酶電極法對(duì)于乙醇的測(cè)定，目前有一些相關(guān)報(bào)道[18-20]，但對(duì)于黃原膠產(chǎn)品中的乙醇檢測(cè)還沒(méi)有相應(yīng)的方法的報(bào)道。

酶電極法利用了酶催化反應(yīng)特異性原理，乙醇氧化酶在有氧條件下催化乙醇的氧化反應(yīng)，生成乙酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫電極接觸產(chǎn)生電流（該電流值和乙醇的濃度呈線性比例），在SBA生物傳感器顯示屏上顯示一個(gè)數(shù)值，根據(jù)此讀數(shù)值計(jì)算可得乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)優(yōu)化儀器進(jìn)樣條件以及前處理?xiàng)l件，建立一種快捷、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的酶電極速測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃原膠產(chǎn)品中乙醇的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇 色譜純，純度為99.9%，SIGMA-ALORICH公司；乙醇酶膜專用緩沖劑 山東省科學(xué)院生物研究所，一袋可配制500m L緩沖溶液，純度為99.9%；緩沖溶液 將一袋乙醇酶膜專用緩沖劑充分溶解于水中，后轉(zhuǎn)移定容至500m L容量瓶中，搖勻，過(guò)0.25μm水系濾膜，pH7.2±0.1；黃原膠 市售；分析用水 符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水規(guī)格。

SBA生物傳感器 內(nèi)置檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換裝置，山東省科學(xué)院生物研究所；乙醇氧化酶膜 山東省科學(xué)院生物研究所，應(yīng)在0～4℃條件下保存，有效期1年；XS204電子天平（0.1mg） 瑞士梅特勒公司；電動(dòng)攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

吸取30μL乙醇于10m L容量瓶中，用蒸餾水準(zhǔn)確

定容至刻度，搖勻，之后吸取上述溶液1m L于25m L容量瓶中，用蒸餾水準(zhǔn)確定容至刻度，搖勻，作為定標(biāo)液。

1.3 樣品預(yù)處理

移取100m L超純水于250m L燒杯中，加入攪拌子后緩緩開(kāi)啟攪拌，稱取0.5g（精確至0.001g）黃原膠樣品，將其緩慢的加入，之后將整個(gè)燒杯口用保鮮膜進(jìn)行密封，將速率檔調(diào)至中部（約800r/min），在攪拌臺(tái)上攪拌0.5h，待攪拌均勻后可直接取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.4 測(cè)定條件

1.4.1 酶膜安裝以及激活 在SBA生物傳感器配備的過(guò)氧化氫電極上安裝乙醇酶膜，之后用乙醇酶膜特定緩沖劑對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行緩沖清洗，開(kāi)機(jī)激活酶膜，等待2h之后進(jìn)行測(cè)定。每次開(kāi)機(jī)儀器會(huì)自動(dòng)清洗一次，進(jìn)樣燈（綠燈）亮并閃動(dòng)，當(dāng)屏幕處于自動(dòng)零狀態(tài)的0值時(shí)，把吸取好的25μL 0.1g/L的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液注入進(jìn)樣口。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)開(kāi)始定標(biāo)，屏幕顯示設(shè)定的標(biāo)值為200，并自動(dòng)清洗反應(yīng)池，反復(fù)測(cè)定乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)儀器穩(wěn)定后，即前后兩針的結(jié)果相對(duì)誤差小于1%時(shí)，儀器便自動(dòng)定好標(biāo)，標(biāo)志是進(jìn)樣燈（綠燈）一直亮但不閃動(dòng)。

1.4.2 定量分析 定標(biāo)完成后對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，首先對(duì)乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，將其配制成0.001、0.002、0.003、0.006、0.013、0.025、0.050、0.100g/L的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)樣，得到生物傳感器面板上相對(duì)應(yīng)的顯示值，此時(shí)以顯示值對(duì)乙醇濃度作圖，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性方程，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)R2≥0.99。

用預(yù)先處理好的試液清洗微量進(jìn)樣器，至少三次。準(zhǔn)確吸取25μL試液，用濾紙擦干針尖外部，注入進(jìn)樣口，20s后讀取顯示值。同一樣品進(jìn)樣測(cè)定三次，將測(cè)定值帶入線性方程計(jì)算試液中的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，測(cè)定過(guò)程中需保證生物傳感器只開(kāi)啟單側(cè)的響應(yīng)開(kāi)關(guān)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)由以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y為黃原膠樣品中乙醇的檢出量，%；C為由線性回歸方程計(jì)算出的樣品中乙醇的質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品加水體積，100m L；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1.1 樣品稱樣量?jī)?yōu)化 由于黃原膠樣品本身具有一定的粘性，前處理過(guò)程中首先要確定其稱樣量以及加水體積，對(duì)不同稱樣量黃原膠樣品處理后進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)，比對(duì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

樣品稱樣量的選取原則，主要是保證樣品稱樣量足夠大，以確保痕量乙醇檢測(cè)的準(zhǔn)確性；加水體積的選取，一方面是考慮加入足夠量的水能夠使樣品充分溶解并且攪拌均勻，另一方面是保證攪拌完成之后能夠用生物傳感儀自帶的50μL進(jìn)樣針吸取后進(jìn)樣。表1中首先嘗試了0.5g的稱樣量，加水50m L攪拌后測(cè)定，由于加水量少導(dǎo)致黃原膠粘度過(guò)大，無(wú)法用進(jìn)樣針吸取進(jìn)樣。后嘗試加水100m L以及200m L攪拌進(jìn)樣，檢測(cè)情況良好，但加入200m L水導(dǎo)致樣品攪拌后過(guò)稀，會(huì)影響檢測(cè)的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。參考了0.5g稱樣量、100m L的加水規(guī)格，以相同的稀釋倍數(shù)選擇稱取了1、2g的黃原膠樣品攪拌測(cè)定，從表1數(shù)據(jù)可知測(cè)得乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)穩(wěn)定性良好。鑒于0.5g的稱樣量能夠滿足檢測(cè)需求，考慮到檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性，確定稱取0.5g樣品，加水100m L做為樣品最終稱樣條件。

表1 樣品稱樣量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)Table 1 The optimization experiment forweightmeasurement of sample

2.1.1.2 樣品攪拌時(shí)間優(yōu)化 樣品測(cè)定中需要在一定速率下進(jìn)行攪拌，稱取黃原膠0.5g，加水100m L，對(duì)其攪拌時(shí)間的比對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 樣品攪拌時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)Table 2 The optimization experiment formixing time of sample

從表2可知，樣品攪拌0.5h后測(cè)得黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定，說(shuō)明樣品攪拌0.5h即可攪拌均勻，此優(yōu)化條件極大的縮短了批量測(cè)定中的前處理時(shí)間，方便了測(cè)定。

2.1.2 儀器條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)前期的文獻(xiàn)查閱，對(duì)于生物傳感器進(jìn)樣反應(yīng)時(shí)間以及清洗時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，生物傳感器廠家推薦最短清洗時(shí)間為25s。

稱取黃原膠0.5024g，加水100m L，對(duì)反應(yīng)時(shí)間從5s開(kāi)始進(jìn)行了考察，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 儀器條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)Table 3 The optimization experiment for instrument condition

由表3可知，儀器反應(yīng)20s之后再延長(zhǎng)儀器反應(yīng)時(shí)間，在清洗時(shí)間40s之后，黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定。在廠家推薦清洗時(shí)間為25s的條件下，測(cè)得乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，繼續(xù)延長(zhǎng)清洗時(shí)間為40s乃至更長(zhǎng)，此時(shí)黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定。分析原因?yàn)椋瑥S家推薦清洗時(shí)間是針對(duì)非粘性的溶液，但黃原膠樣品粘性大，25s的清洗時(shí)間并不能徹底清洗反應(yīng)腔，可能會(huì)有一定黃原膠殘留。但生物傳感儀中反應(yīng)腔的體積是固定的，黃原膠的殘留會(huì)導(dǎo)致樣品進(jìn)樣量降低，從而導(dǎo)致乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低。綜合以上數(shù)據(jù)可知，儀器反應(yīng)為20s，清洗時(shí)間為40s，即可將單個(gè)反應(yīng)進(jìn)行完全，整個(gè)測(cè)定時(shí)間控制在1m in。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次取平均值，進(jìn)而可計(jì)算黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)樣10針后需要進(jìn)行1次定標(biāo)。

2.2 線性回歸方程與方法定量限

在優(yōu)化條件下，考察了乙醇標(biāo)液的線性范圍，以乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以生物傳感器面板上相對(duì)應(yīng)的顯示值測(cè)定三次的平均值為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.003～0.1g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9994，同時(shí)計(jì)算了方法的最低檢出限（S/N=3）為0.02%，方法的定量限（S/N=10）為0.07%。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇線性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The linear standard curve of ethyl alcohol

2.3 方法的回收率

按照標(biāo)品濃度為1、2、5倍定量限的原則，在黃原膠樣品中添加三個(gè)不同濃度的乙醇標(biāo)液，測(cè)得不同添加濃度下的回收率在83.3%～93.3%之間，結(jié)果見(jiàn)表4，說(shuō)明前處理過(guò)程中損失或沾污較少，樣品前處理方法可靠。

表4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery experimentof themeasured results

2.4 方法的精密度與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用本方法測(cè)定了兩批黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平行測(cè)定5次，同時(shí)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表5。表5數(shù)據(jù)顯示兩批樣品的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)平行性較好，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.74%和2.32%。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)Table 5 Precision experimentof themeasured results

2.5 方法的穩(wěn)定性

采用本方法對(duì)同一批樣品在不同天數(shù)的酶電極法測(cè)定情況進(jìn)行了考察，平行測(cè)定5次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表6。從結(jié)果可知，7d測(cè)定的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較穩(wěn)定，說(shuō)明此方法對(duì)樣品測(cè)定的穩(wěn)定性較好。

2.6 方法的重現(xiàn)性

將同一黃原膠樣品放置30、60d之后采用本方法對(duì)乙醇測(cè)定情況進(jìn)行了考察，每個(gè)樣品測(cè)定5次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表7。從結(jié)果可知，測(cè)定的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.42%，說(shuō)明此方法對(duì)同一樣品在放置一段時(shí)間之后測(cè)定的條件下重現(xiàn)性較好。

2.7 與氣相色譜法的比對(duì)

應(yīng)用FCCV[21]中黃原膠產(chǎn)品揮發(fā)性氣體檢測(cè)方法蒸餾提取-氣相色譜法對(duì)黃原膠中的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)，此方法以叔丁醇作為內(nèi)標(biāo)物，配制乙醇標(biāo)

準(zhǔn)曲線；前處理對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾，蒸餾環(huán)節(jié)稱取0.5g樣品后加入300m L的水，邊攪拌邊加熱蒸餾提取1h，之后往蒸餾瓶中加入4m L叔丁醇進(jìn)行乙醇提取；進(jìn)樣環(huán)節(jié)設(shè)定進(jìn)樣口及檢測(cè)器溫度為200℃，柱溫為165℃，取樣0.5μL進(jìn)行檢測(cè)分析。同時(shí)用酶電極法檢測(cè)，同一樣品測(cè)定三次，兩方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)結(jié)果并沒(méi)有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表8。

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 6 Stability of themeasured results

表7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 7 Reproducibility experimentof themeasured results

表8 同氣相色譜法比對(duì)結(jié)果Table 8 Result comparison with gas chromatography

蒸餾提取-氣相色譜法操作復(fù)雜，檢測(cè)所用的色譜柱昂貴，前處理以及上機(jī)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)成本高。相對(duì)而言，酶電極法前處理簡(jiǎn)單，上機(jī)檢測(cè)時(shí)間短，所需的耗材為乙醇酶膜，價(jià)格比較便宜，此檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)顯著。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了酶電極法對(duì)黃原膠產(chǎn)品中的乙醇的快速檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)優(yōu)化了儀器的進(jìn)樣條件和樣品的前處理?xiàng)l件，實(shí)現(xiàn)了樣品檢測(cè)的及時(shí)性，取得了較好的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示：乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為0.9994，方法檢出限為0.02%；在黃原膠產(chǎn)品中添加一定量的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液后，測(cè)得其不同濃度下的添加回收率在83.3%～93.3%之間，其精密度實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定5次得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在3%以下，以上數(shù)據(jù)均說(shuō)明方法的可行性較高。此方法可作為一種較低成本的檢測(cè)方法在企業(yè)中進(jìn)行推廣應(yīng)用，且前處理簡(jiǎn)單、快速、回收率高、精密度好，由于乙醇酶膜本身的特異性響應(yīng)，雜質(zhì)的存在不會(huì)影響乙醇的定量分析，極大的保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。酶電極法作為測(cè)定黃原膠產(chǎn)品中乙醇的一種簡(jiǎn)單快速的生物傳感儀速測(cè)方法，對(duì)于企業(yè)具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Rapid determination for ethyl alcohol in xanthan gum byenzyme electrode

YANG Ying
（Meihua BioTech（Langfang）Co.，Ltd.，Langfang 065001，China）

The ethyl alcohol in xanthan gum was determined by enzyme electrode，the instrument conditions andthe pre-treatment conditions were further optimized. The results showed that this method had excellent linearrelationship with the correlation coefficient of 0.9994 and the detection limit of the method was 0.02% . Thedetection rate of instrument was 20s. The recovery rates were 83.3%～93.3% and the relative standard deviationwere all below 3%. This developed method was easy，sensitive and reliable，which could be used to analyzeethyl alcohol in xanthan gum.

enzyme electrode；xanthan gum；ethyl alcohol；rapid detection

TS207.3

：A

：1002-0306（2014）16-0082-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.009

2013－11－20

楊瑛（1987-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全。