超高壓時間對膠原明膠化及成品明膠品質的影響

黃丹丹，馬 良，2，周夢柔，劉 軼，張宇昊，2，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶400715）

超高壓時間對膠原明膠化及成品明膠品質的影響

黃丹丹1，馬 良1，2，周夢柔1，劉 軼1，張宇昊1，2，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶400715）

以1%（w/v）HCl溶液為傳壓介質，研究不同時間（0～45min）的超高壓（300MPa）處理對膠原的熱穩定性及成品明膠的分子量分布、凝膠強度、流變學特性等的影響，以分析超高壓時間在膠原明膠化過程中的作用及其對明膠品質的影響。結果顯示：經5～45min的超高壓處理的明膠化膠原的熱穩定性高于傳統酸處理組，但是低于未處理組（超高壓時間為0min）；結合前期工藝研究結果，可以發現超高壓處理組膠原的熱穩定性較低、明膠提取率較高，說明超高壓處理能夠破壞鏈間氫鍵、松散膠原三螺旋結構，有利于膠原明膠化；且超高壓組明膠的亞基組分（α、β）得到很好的保留，而傳統酸法明膠亞基組分相對含量很低（小于10%），超高壓明膠中高分子量組分（亞基組分）使超高壓明膠組明膠具有較好的膠凝特性和粘彈性能。

超高壓，時間，膠原，明膠，品質

明膠是一種重要的天然高分子化合物，以其良好的乳化性、持水性、成膜性、膠凝性等特點而廣泛應用于食品、醫藥及化工等領域[1]。明膠來源于動物結締組織中的膠原蛋白，膠原蛋白屬于不溶性蛋白，其分子單位稱為原膠原，每個原膠原分子由3條α-肽鏈組成，α-肽鏈自身為α螺旋結構，3條α-肽鏈則以平行、右手螺旋形式纏繞成“草繩狀”3股螺旋結構[2]。膠原的明膠化是指破壞維系和穩定膠原三螺旋結構的非共價鍵和共價交聯，松散膠原的三螺旋結構、破壞非螺旋結晶區，以利于后期熱處理過程中膠原亞基分子的釋放[3-4]。目前大規模應用于生產的明膠制備方法是傳統的酸堿法，即先采用酸、堿預處理膠原原料，使之明膠化，再通過加熱破壞氫鍵和一些共價鍵，使膠原三螺旋結構解體，轉變成可溶性明膠[5]。隨著環境保護和清潔生產日益受重視，傳統酸堿誘導明膠化過程中周期長、能耗大、環境污染嚴重等諸多弊端日益顯現。此外，酸堿作用還會導致肽鍵的非正常斷裂，破壞膠原亞基的完整性，進而影響成品明膠的品質[2，5-6]。因此探索清潔高效的膠原明膠化誘導方法，以改進明膠傳統生產工藝，對我國明膠產業的健

康發展具有重大現實意義。

近年來超高壓技術被廣泛應用于蛋白改性方面的研究中，這些研究表明高壓會影響維系蛋白質空間結構的氫鍵、疏水作用、靜電作用、范德華力等非共價作用，破壞蛋白質的非共價鍵平衡，并且可以增強蛋白的水化作用，改善蛋白溶解性[7-11]。這些作用與酸堿誘導膠原明膠化作用相一致，因此推測超高壓能夠誘導膠原明膠化。國內外已有少數學者應用超高壓誘導膠原明膠化制備明膠的報道，例如Gómez-Guillén等[12]及本課題組[13]曾應用超高壓技術改進多佛箬鰨魚和巴沙魚魚皮明膠的常規酸法制備工藝，結果均顯示適當的超高壓預處理可增加明膠提取率，且超高壓條件的改變會影響產品品質，但對相關機理未作進一步報道。由于目前世界明膠市場仍以哺乳動物源明膠為主，本課題組進一步優化了超高壓制備豬皮明膠工藝，發現超高壓協同低濃度的鹽酸可有效誘導豬皮膠原明膠化，短時間的超高壓處理可顯著提高明膠的提取率和凝膠強度，但是隨著超高壓時間的延長，提取率趨于穩定，而凝膠強度呈降低趨勢，對于相關機理尚未明確[14]。

可見，超高壓技術可應用于制備高品質明膠，但目前尚無相關機理的系統研究報道。本實驗首先從熱力學層面及分子層面研究超高壓誘導膠原明膠化過程中超高壓時間對膠原結構變化的影響，進而研究超高壓時間對明膠凝膠特性和流變學特性等品質的影響，并結合膠原明膠化過程中分子結構變化分析影響產生機制。以期有效闡明超高壓時間在誘導膠原明膠化中的作用及其對明膠品質的影響機理，為超高壓技術在明膠產業化中應用乃至明膠清潔生產工藝的建立奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬皮 購于重慶市北碚區天生麗街永輝超市，原料獲取后洗凈，刮除表層脂肪，95℃下預蒸8m in后，切成約2mm×3mm的小塊，混勻，凍藏于冰箱中備用；十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris、過硫酸銨（APS）、β-巰基乙醇（2-ME）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍R-250 BIO BASIC公司；30%丙烯酰胺（丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺質量比為29∶1） 北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸（Glycine）、溴酚藍（BPB） 生工生物工程（上海）有限公司；標準蛋白（分子量10～200ku） Fermentas公司。

JA3003B型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；PHS-25型數顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠；DZ600/2S型真空包裝機 上海人民包裝股份有限公司（原上海人民儀表廠）；HPP.L3型超高壓處理設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；8002型溫控水浴鍋 北京永光明醫療儀器廠；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器、CJ-78-1型磁力攪拌器 上海將任實驗設備有限公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；101-4-S型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；JYL-C022型九陽料理機 九陽股份有限公司；HX-1005型恒溫循環器 鄭州長城科工貿有限公司；TA.XT2i型物性測定儀 英國Stable M icro System公司；S-300N型DSC（差示掃描量熱儀） 德國耐馳儀器制造有限公司；DHR-1型流變儀TA公司；Power PacTM型基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司；G：BOX EF型凝膠成像系統 英國Syngene公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統酸法誘導豬皮膠原明膠化提取明膠的工藝 首先依照GB/T 14772-2008[15]對豬皮進行脫脂處理；再采用質量分數為1%NaCl溶液浸泡以去除雜蛋白（浸泡攪拌6h，每2h換一次液）；接著按1∶10的比例加入質量分數為1%HCl溶液浸泡20h，期間間斷攪拌，浸泡完后洗滌至接近中性以備提膠；然后按1∶3的比例加去離子水，調節pH至4.5，于60℃水浴振蕩提取6h，過濾，膠液于10000r/min離心20min，收集上清液于烘箱中70℃烘干，粉碎，得到傳統酸法明膠。

1.2.2 超高壓誘導豬皮膠原明膠化提取明膠的工藝 將去除雜蛋白后的樣品按1∶1.5添加質量分數為1%的HCl溶液、真空包裝后在300MPa下分別進行0、5、15、30、45m in的超高壓處理，然后洗滌至接近中性，隨后進行熱力提膠，提膠條件同1.2.1。

1.3 分析方法

1.3.1 明膠化膠原的熱穩定性分析 按照豬皮提膠的明膠化處理工藝處理豬皮，由于豬皮已經過脫脂、除雜蛋白，其中的干物質主要是膠原，故以所得樣品作為明膠化膠原樣品。分別取經0～45m in超高壓處理的明膠化膠原進行DSC測定，并同傳統酸處理的明膠化膠原對比，分析超高壓處理時間對膠原熱穩定性的影響。測定方法如下：稱取樣品約20mg，用鋁坩鍋封存，放入DSC儀，在氮氣氣氛下，以5℃/m in的速率從15℃升溫至120℃，記錄吸熱曲線。

1.3.2 明膠組分分析 采用SDS-PAGE垂直電泳分析超高壓明膠和傳統酸法明膠的亞基組成和分子量分布。6%的分離膠，5%的濃縮膠；電泳緩沖液為10×Tris-Glycine緩沖液（含0.25mol/L Tris、1.92mol/L Glycine、10g/L SDS，稀釋10倍作內槽電泳液）；5×樣品緩沖液（含250mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.1g/m L SDS、5mg/m L BPB、0.5m L/m L甘油、0.05m L/m Lβ-巰基乙醇）；考馬斯亮藍R-250染色液（含1g/L考馬斯亮藍R-250、450m L/L甲醇）；考馬斯亮藍染色脫色液（含100m L/L冰醋酸、100m L/L甲醇）。配制1.5mg/m L的明膠溶液，按4∶1添加5×樣品緩沖液，沸水浴5min，冷卻后上樣，上樣量為15μL（Marker上樣量為10μL）。15mA恒流電泳，待溴酚藍跑到分離膠中后，電流調至25mA，電泳時間約1.5h?？捡R斯亮藍染色2h后用脫色液脫色，多次更換脫色液直至背景脫凈，然后用凝膠成像系統拍攝電泳圖譜，用（Version 2003.02）軟件分析圖譜。

1.3.3 明膠流變學性質測定 采用DHR-1流變儀測定6.67%的超高壓明膠和傳統酸法明膠的粘彈性，分析超高壓時間對明膠粘彈性的影響。設定溫度變化速率為1℃/min，控制變量strain（%）為5，測試夾具40mm A l平板，Peltier溫度控制系統，板間距為1000μm，明膠樣品溶化后于流變儀上溫度由40℃

（或45℃）冷卻到5℃，在5℃下保持10m in，然后由5℃加熱到40℃（或45℃），測定彈性模量G′和粘性模量G″隨溫度掃描的變化，計算相角。

1.4 數據處理

采用Origin 8.0進行實驗數據處理。

2 結果與分析

2.1 超高壓時間對明膠化膠原熱力學性質的影響

DSC技術是在溫度程序的控制下，測量試樣相對于參比物的熱流速度隨溫度變化的一種技術，該技術克服DTA在計算熱量變化的困難，為獲得熱效應的定量數據帶來很大方便。經不同時間超高壓處理的明膠化膠原的DSC圖譜如圖1（a）所示。正如Mu等[16-17]所報道的，豬皮膠原的DSC曲線均呈現兩個吸熱峰，一個位于35～40℃的副吸熱峰（Ts）和一個位于45～75℃間的主吸熱峰（Tm），這可能與“三螺旋結構-纖維形成”有關。三螺旋結構單元（原膠原分子）通過側向和縱向連接形成膠原原纖維和膠原微纖維，三螺旋結構的穩定主要借助其內部多肽鏈分子間的氫鍵作用力，而膠原纖維的穩定則借助三螺旋結構單元之間的氫鍵作用力和共價交聯作用力；穩定膠原纖維的三螺旋之間的氫鍵比引起膠原變性的三螺旋內部的氫鍵更容易斷裂[16]。因此，當溫度加熱至Ts時，首先引起三螺旋之間的氫鍵斷裂，導致三螺旋單體發生解離，但三螺旋內部的氫鍵作用力依然存在；進一步加熱至Tm則引起三螺旋內部肽鏈間氫鍵作用力的減弱，導致三股螺旋解旋為不規則卷曲狀，膠原變性。

圖1 300MPa下超高壓預處理不同時間的豬皮膠原的DSC曲線和峰值溫度Fig.1 DSC curves and temperatures for peak maximum height of collagens from pig skin pressurized at 300MPa for different time

通過Origin 8.0軟件分析得到DSC曲線的峰值溫度如圖1（b）所示。由圖1（b）可知，各時間組的Ts間無顯著差異（p＞0.05），但Tm差異顯著（p＜0.05）。未處理組（超高壓處理時間為0）Tm值最高，超高壓組次之，對照組（傳統酸法明膠）最低，說明三螺旋內部氫鍵被破壞程度：對照組＞超高壓組＞未處理組。對照組膠原經長時間的酸浸泡，充分發生酸溶脹，三螺旋結構被破壞程度最大，鏈間氫鍵作用大幅度減弱[5，18-20]。未處理組膠原僅在除雜蛋白過程中發生輕度溶脹，膠原三螺旋結構被破壞程度最低，鏈間氫鍵作用得以較大程度的保留。超高壓組三螺旋內部總體氫鍵被破壞程度居中，說明超高壓誘導膠原構象的轉變，也能夠松散膠原的三螺旋結構。超高壓降低膠原Tm值的原因在于UHP作用破壞了膠原非共價鍵平衡，導致膠原原始結構伸展，立體結構崩潰，同時促進HCl分子和水分子進入螺旋內部，加速酸與膠原堿性基團的結合作用及水合作用，二者協同作用導致膠原三螺旋結構松散，鏈間的氫鍵作用減弱[11，21]。在超高壓組中，隨著時間的延長Tm總體呈減小趨勢，但降幅不大。原因在于隨著時間延長，高壓協同低濃度HCl作用對膠原的非共價平衡的破壞作用增大，三螺旋結構松散程度增加，鏈間的氫鍵作用減弱，Tm降低。然而由于超高壓破壞鏈間氫鍵的同時一些水合橋接（水分子介導的氫鍵）也會形成，這些水橋具有穩定三螺旋結構的作用，二者綜合作用使得三螺旋結構被松散程度減小，Tm的降幅減小[21-22]。

前期實驗結果表明[14]，5～15m in的超高壓處理組的明膠提取率顯著高于未處理組（p＜0.05），超過15m in后，延長超高壓時間提取率沒有顯著變化（p＞0.05）。結合提取率和熱力學的研究結果，可以推測，5～15m in的超高壓處理即可顯著松散膠原三螺旋結構，促進膠原明膠化，從而提高明膠提取率；延長超高壓時間，未能明顯提高膠原三螺旋結構的松散程度，膠原明膠化程度變化較小。

2.2 超高壓時間對明膠亞基組成及分子量分布的影響

應用SDS-PAGE電泳檢測明膠的亞基組成及分子量分布，結果如圖2（a）所示。可以看出，傳統酸法明膠的蛋白帶主要分布在70ku以下，α、β等亞基組分對應的條帶不易辨出，這可能是由于長時間的酸處理在破壞非共價鍵平衡的同時，也破壞了膠原分子的共價鍵（包括肽鍵），導致膠原亞基降解。超高壓組明膠的平均分子量明顯高于傳統酸處理（TG），主要由100～120ku之間兩條α帶和大于200ku的β帶組成。這是因為超高壓主要破壞膠原非共價鍵平衡，而介質酸的短時間作用又不足以破壞膠原分子的共價鍵，故亞基組分得到較大程度的保留。Gómez-Guillén等[12]報道稱高壓提取的明膠含有更多的高分子量組分，這與本研究的結果相一致。

經Phoretix 1D軟件分析得到各明膠中α、β等高分子量組分所占比例如圖2（b）所示?？梢?，超高壓明膠的α、β等亞基組分的相對含量明顯高于傳統酸法明膠（p＜0.05），說明超高壓作用對共價鍵特別是肽鍵的破壞作用較小，能夠較好的保持亞基的完整性。

隨超高壓處理時間由0m in延長至30m in，高分子量組分含量略有升高，至45m in時有一定下降。這可能是因為短時間的超高壓作用可以促進蛋白亞基的聚凝[23]，使得所提明膠的高分子量組分含量增大；超高壓時間延長至45min時，對于增進蛋白聚合的貢獻已經很小，而酸對共價鍵的破壞作用增加，高分子量組分含量降低?？傮w而言，0～45min的超高壓處理對亞基組分的降解作用均較小。

圖2 明膠的SDS-PAGE電泳圖譜和亞基組分的相對含量Fig.2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and the relative amountof subunit components of gelatins prepared from pig skin

凝膠強度是明膠的重要功能特性，它受氨基酸組成、平均分子量與分子量分布、膠凝環境等多種因素影響[24-25]。凝膠是明膠分子在水溶液中聚集形成的三維網絡結構[2]。凝膠化過程中，肽鏈間相互交聯形成有序的類三螺旋結構，并進一步聚集構成網絡，高分子量組分能夠參與形成長三螺旋結構，有利于單位體積內交聯節點的增加，從而使凝膠結構強化，凝膠強度提高；而低分子量組分的存在可能阻礙亞基間的聯結，且其自身需要更多的交聯來形成網絡，故不利于凝膠網絡的形成與穩定，導致凝膠強度降低[25-30]。

前期實驗結果表明[14]，傳統酸法明膠的凝膠強度較低，明顯低于超高壓組（p＜0.05），這與高分子量組分相對含量呈正相關，說明超高壓作用通過影響明膠的分子量分布而影響明膠的凝膠強度。然而，隨著超高壓時間的延長，凝膠強度呈減小趨勢[14]，與亞基組分相對含量的變化趨勢不一致。這可能是由于隨著超高壓時間延長，亞基組分相對含量變化不大，而膠原內部酸殘留量增大，導致中和洗酸過程延長，成品明膠中NaCl殘留量增加，這就阻礙了短范圍的靜電相互作用，影響肽鏈間的交聯[31]。綜上所述，明

膠凝膠強度主要受分子量分布的影響，同時也受離子強度等膠凝環境條件的影響。

圖3 明膠的儲能模量（G′）、損耗模量（G″）和相角（δ）Fig.3 Elasticmodulus（G′），viscousmodulus（G″）and phase angle（δ）of gelatins

2.3 超高壓時間對明膠流變學特性的影響

流變學特性是明膠的另一個重要性質，好的流變性能（高的膠凝/熔化溫度等）能夠拓展明膠的應用范圍[2]。圖3顯示6.67%的明膠在由40℃（或45℃）冷卻至5℃和隨后由5℃加熱至40℃（或45℃）過程中儲能模量（G′：彈性成分）、損耗模量（G″：黏性成分）和相角（δ）的變化情況。各樣品冷卻曲線的變化趨勢相似，但膠凝溫度存在差異。隨著溫度降低，G′和G″值快速增加，表明明膠分子間交聯的快速形成、凝膠結構強化，明膠迅速由溶液轉變成凝膠。各超高壓組明膠凝膠的G′和G″值開始升高的溫度較TG高，說明超高壓明膠凝膠起始溫度高于傳統酸法明膠。這是因為傳統酸法中存在較高含量的低分子量組分，它們高溫下分散度較大，不利于交聯區的快速形成；而超高壓明膠的亞基組分得到較好的保留，這些高分子量組分的活動性較差，在較高溫度下也能快速形成交聯區[25-30]。5℃時，所有樣品的相角都很?。é模?°），表明形成了較好的明膠凝膠。后續的加熱曲線顯示各樣品的熔化溫度存在差異，但均表現出快速的轉變。加熱過程中，超高壓明膠凝膠的G′和G″值開始降低的溫度較傳統酸法明膠高，顯示出較高的熱穩定性，說明高分子量亞基間不僅能快速形成交聯區，且單位體積內交聯節點更多，形成的凝膠網絡更穩定，這與凝膠強度的結論相一致。

由相角的快速變化可以判斷明膠的膠凝/熔化溫度[31]。一般以tan（δ）=1作為膠凝和熔化的轉折點，其對應的溫度即為膠凝/熔化溫度[32]，由此得出各樣品的膠凝/熔化溫度如圖4所示。由于明膠凝膠在熔化過程中會吸收能量，故熔化溫度高于膠凝溫度。各超高壓組明膠的膠凝/熔化溫度明顯高于傳統酸法明膠（p＜0.05），這可能是由分子量及分子量分布的差異引起的。傳統酸法明膠亞基的降解程度較大，高分子量組分含量較低，形成的凝膠網絡穩定較差，粘彈性能不佳；而超高壓明膠的亞基得到較好保持，高分子量組分含量較高，形成的凝膠網絡更穩定，粘彈性較好[2，28]。此外，隨著時間延長，膠凝/熔化溫度基本呈現減小趨勢，與高分子量組分相對含量的變化趨勢不一致，可能和凝膠強度一樣，也是受離子強度（NaCl殘留程度）等膠凝環境的影響[33]。

圖4 明膠凝膠的膠凝溫度和熔化溫度Fig.4 The gelling andmelting points of gelatin gels

3 結論

本實驗通過分析超高壓時間對膠原結構變化的影響，進而研究超高壓時間對明膠凝膠特性和流變學特性等品質得出，短時間的超高壓處理即能顯著破壞鏈間氫鍵、松散膠原三螺旋結構，促進膠原明膠化；超高壓具有誘導膠原聚合的作用，對膠原的共價鍵特別是肽鍵影響較小，因而超高壓明膠的高分子量組分含量較高；較高的高分子量有利于凝膠網絡的形成與穩定，所以超高壓明膠的凝膠強度、膠凝/熔化溫度等品質指標均高于商品明膠。但隨著進一步延長時間至45m in，超高壓處理未能明顯提高膠原三螺旋結構的松散程度；且酸對肽鍵的破壞作用增加，導致明膠亞基組分相對含量有所降低；隨時間的延長，品質指標與高分子量組分含量變化趨勢也沒有明顯的一致性，所以明膠的膠凝性還會受到膠凝環境等其他因素的影響。

壓力以及傳壓介質的種類和濃度對膠原明膠化及成品明膠品質的影響機制尚需進一步明確。

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Effects of pressure level on collagen gelatinizing and propertiesof extracted gelains

HUANG Dan-dan1，MA Liang1，2，ZHOU Meng-rou1，LIU Yi1，ZHANG Yu-hao1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center，Southwest University，Chongqing 400715，China）

The effects of ultra-high pressure （UHP） （300MPa） pretreatment on collagen gelatinizing and thequality of resultant gelatin was investigated in different times（from 0 to 45 minutes） with 1%（w/v） hydrochloricacid as transmission medium. With the study of collagen thermal stability and the finished gelatin’s molecularweight distribution，viscoelastic properties and rheological properties. The results showed that the pressurizedcollagens were more thermostable than the one pretreated at ordinary pressure，but less than the untreated（theUHP time was 0）. While in the foregoing study，the UHP pretreatment found lower thermal stability，high extractionrate of gelatin，which showed ultra-high pressure could disrupt hydrogen bonds between chains，loose collagentriple helix collagen gelatin and contribute to gelatinizing. The pressurized collagens gelatin preserved subunitcomponent （α，β） than the traditional method （less than 10%） ，and the well-preserved subunit made thepressurized collagens owned good high pressure gelling properties and viscoelastic properties.

ultra-high pressure；time；collagen；gelatin；quality

TS209

：A

：1002-0306（2014）16-0109-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.015

2013－12－19 *通訊聯系人

黃丹丹（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學與工程。

國家自然科學基金項目（31301425）；中央高校基本科研業務費重點項目（XDJK2011B001）。