基于響應(yīng)面法的蠶蛹蛋白降血脂肽的酶解條件優(yōu)化

楊玉英，王 偉，張 玉，張一帆，鄔應(yīng)龍

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021）

基于響應(yīng)面法的蠶蛹蛋白降血脂肽的酶解條件優(yōu)化

楊玉英1，王 偉2，*，張 玉2，張一帆2，鄔應(yīng)龍1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021）

基于響應(yīng)面法對(duì)中性蛋白酶降解蠶蛹蛋白制備降血脂肽的酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到制備蠶蛹蛋白降血脂肽的最佳酶解條件為：酶量5.1%（w/w），酶解時(shí)間5h，酶解溫度52℃，酶解pH=7.0，底/水比（w/v）=3.9%。在此條件下，蠶蛹蛋白降血脂肽對(duì)3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）的抑制率為45.24%。建立了基于蠶蛹蛋白降血脂肽酶解條件的優(yōu)化模型。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)97.31%。

響應(yīng)面，酶解，蠶蛹蛋白，降血脂肽

蠶蛹在我國(guó)資源豐富，是一種富含18種氨基酸的高質(zhì)量蛋白。在中國(guó)，食用蠶蛹具有悠久的歷史，同時(shí)，中醫(yī)也認(rèn)為蠶蛹具有鎮(zhèn)靜、生津止渴等療效。蠶蛹也被中國(guó)衛(wèi)生部確認(rèn)為一種新的食物資源[1]。大量研究證實(shí)，高蛋白食品的功效多源于其中經(jīng)生物蛋白酶降解而來(lái)的特定功能性肽段。在所有的生物活性肽種類中，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）抑制肽因其具有良好的降低血脂的效果而備受關(guān)注。

HMGR是目前已知的降血脂藥物設(shè)計(jì)的最好靶標(biāo)，已先后有8種HMGR抑制劑（他汀類藥物）獲準(zhǔn)上市。但是，他汀類藥物有一定潛在副作用。所以對(duì)新型安全的HMGR抑制劑的需求十分迫切[2-4]。周菊香[5]曾報(bào)道蠶蛹多肽具有降低血清膽固醇作用，能使小鼠高膽固醇降到正常范圍，并具有抗氧化作用，這說(shuō)明蠶蛹酶解肽中存在降低血脂功能活性，值得進(jìn)一步深入研究。

生物活性肽是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。蠶蛹蛋白生物活性肽研究以我國(guó)的研究和報(bào)道為主，楊安樹(shù)等[6]通過(guò)酶解蠶蛹獲得免疫活性肽，吳瓊英等[7]、賈俊強(qiáng)等[8]酶解蠶蛹得到了ACE抑制肽。肖燕平等[9]、李高揚(yáng)等[10]、趙鐘興等[11]均以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，研究了蠶蛹蛋白酶解制備抗氧化肽的最優(yōu)條件。在已報(bào)道的蠶蛹活性肽研究中，未見(jiàn)蠶蛹蛋白制備降血脂肽酶解條件優(yōu)化研究的相關(guān)報(bào)道。本文基于響應(yīng)面優(yōu)化法，擬對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，為蠶蛹蛋白制備降血脂肽的綜合利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹蛋白粉 南通福爾生物制品有限公司；中

性蛋白酶（100AU/g） 上海源葉生物科技有限公司；HMG-CoA還原酶（HMGR）（濃度≥90%）、HMG-CoA（濃度≥90%）、辛伐他?。舛取?7%）、美伐他?。舛取?5%） Sigma公司；NADPH 濃度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉等 均為分析純。

Dionex UltiMate 3000型加壓毛細(xì)管色譜儀 美國(guó)Dionex公司；KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH.S21CR4型電熱恒溫水浴鍋 上海錦屏儀器儀表有限公司；EZ-2型真空離心濃縮儀 英國(guó)Genevac公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-5-A型離心機(jī) Anke公司；SHZ-82A型水浴恒溫振蕩器 國(guó)旺儀器。

1.2 蠶蛹蛋白降血脂肽的制備

蠶蛹蛋白粉10g（其中蛋白質(zhì)含量為75%，以純蛋白7.5g計(jì)），加入250m L具塞三角瓶中，加入200m L去離子水，攪拌均勻，90℃水浴加熱10m in使蛋白質(zhì)適度變性，然后冷卻至45℃，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)pH至中性蛋白酶的最適pH 7.0，然后加入蠶蛹蛋白粉質(zhì)量2%的中性蛋白酶，置于45℃、150r/min的恒溫振蕩器中酶解5h，快速升溫至90℃并保溫10m in進(jìn)行滅酶。冷卻后4000r/m in離心15m in，收集上清液，得蠶蛹蛋白肽，待測(cè)定HMGR抑制率活性。

1.3 HMGR抑制率的測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件 Symmetry?C18色譜柱（5μm，4.6mm× 250mm）。流動(dòng)相為：V（K2HPO4-KH2PO4）∶V（甲醇）= 85∶15，pH=7.2，等度洗脫，流速1.0m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)337nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫25℃。

1.3.2 反應(yīng)體系步驟 反應(yīng)中各種組分的加入量及順序如表1所示，反應(yīng)溫度37℃水浴20m in，反應(yīng)完成后加入200μL 0.5mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，按1.3.1的色譜條件測(cè)量樣品中NADPH的濃度。

表1 反應(yīng)體系組成成分Table 1 The ingredientof reaction system

1.3.3 抑制率的計(jì)算

HMG-CoA+2NADPH+2H+MVA+H SCoA+2NADP+

加入抑制劑后，HMG-CoA還原酶的活性受到抑制，底物反應(yīng)的量減少。因此，可以利用HPLC測(cè)定反應(yīng)前后NADPH量的變化來(lái)評(píng)價(jià)抑制劑對(duì)HMG-CoA還原酶的抑制率。計(jì)算公式為：

R（%）=（S抑制劑-S對(duì)照）（/S空白-S對(duì)照）×100

式中，R為抑制率（%）；S空白、S對(duì)照和S抑制劑分別為空白組、酶對(duì)照組和抑制劑組中NADPH的峰面積（mAU·m in）。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 酶用量對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響 按1.2蠶蛹蛋白降血脂肽制備方法，蛋白酶用量以1%、2%、3%、4%、5%處理樣品。按底/水比為7.5g/200m L，酶解溫度為45℃，時(shí)間為5h，pH為7.0操作，分析不同酶用量對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響。

1.4.2 酶解時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響 按1.2蠶蛹蛋白降血脂肽制備方法，酶解時(shí)間分別為3、4、5、6、7h。按底/水比為7.5g/200m L，酶解溫度為45℃，酶用量為2%，pH為7.0進(jìn)行酶解，分析不同酶解時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響。

1.4.3 酶解pH對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響 按1.2蠶蛹蛋白降血脂肽制備方法，酶解體系的pH分別調(diào)節(jié)為5.5、6.0、7.0、8.0、8.5，按底/水比為7.5g/200m L，酶解溫度為45℃，時(shí)間為5h，酶用量為2%進(jìn)行酶解，分析不同酶解pH對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響。

1.4.4 酶解溫度對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響 按1.2蠶蛹蛋白降血脂肽制備方法，酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃。按底/水比為7.5g/200m L，酶用量為2%，時(shí)間為5h，pH為7.0進(jìn)行酶解，分析不同酶解溫度對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響。

1.4.5 底/水比對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響 按1.2蠶蛹蛋白降血脂肽制備方法，以1.5%、2.5%、3.75%、5%、7.5%、10%的底/水（w/v）比處理樣品。按酶用量為2%，酶解溫度為45℃，時(shí)間為5h，pH為7.0進(jìn)行酶解，分析不同底/水比對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化法的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)中對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率影響最顯著的因素為響應(yīng)因子，運(yùn)用DESIGN EXPERT 8.0軟件的Central Composite Design進(jìn)行中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率具有顯著影響的3個(gè)因素：底/水比（A）、酶用量（B）和酶解溫度（C），做三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 因素水平編碼Table 2 Code and level of factors chosen

1.6 數(shù)據(jù)處理

本研究運(yùn)用DESIGN EXPERT 8.06軟件進(jìn)行中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差以及百分?jǐn)?shù)表示，各組數(shù)據(jù)均數(shù)間用t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性。p＜0.05為顯著性差異，

p＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶用量對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響結(jié)果 由圖1可知，隨著酶用量的變化，蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率也會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)酶用量為4%時(shí)，抑制率最大，為30.60%±2.61%，因此確定4%是酶用量的最佳條件。同時(shí)，隨著酶用量的變化，HMGR抑制率的最大差值為18.08%。由蛋白酶用量和HMGR抑制率的變化趨勢(shì)可見(jiàn)，隨著蛋白酶的用量增加，抑制率隨之增加，說(shuō)明原蛋白中的多個(gè)活性肽段被不斷降解下來(lái)，相應(yīng)的功能性得以逐步體現(xiàn)。然而，在酶用量增大到3%時(shí)，抑制率出現(xiàn)了一定程度下降，可能是由于具有抑制活性的大分子肽段被蛋白酶進(jìn)一步降解，而降解后的肽段不具備HMGR抑制活性或者活性下降而導(dǎo)致的整體測(cè)定活性下降。酶用量的進(jìn)一步增加到4%，使蛋白酶對(duì)底物蛋白的作用位點(diǎn)增多，增加了有活性肽段的得率，但當(dāng)?shù)鞍酌冈黾拥?%時(shí)，HMGR抑制活性顯著從30.60%下降到17.83%，說(shuō)明底物蛋白在大量蛋白酶的作用下，在相同的酶解時(shí)間下會(huì)出現(xiàn)過(guò)度降解，有活性的肽段可能被蛋白酶進(jìn)行二次降解失活。上述分析說(shuō)明，恰當(dāng)?shù)牡鞍酌赣昧繉?duì)HMGR抑制活性具有顯著影響。

圖1 酶用量對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.1 The effectof enzyme dosage on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響結(jié)果 由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的增加，蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率逐漸增加。當(dāng)酶解時(shí)間到達(dá)5h后，抑制率逐漸趨于穩(wěn)定，故選擇5h作為適宜酶解時(shí)間，其蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率為27.99%±0.61%。同時(shí)，隨著酶解時(shí)間的變化，HMGR抑制率的最大差值為8.55%，酶解產(chǎn)物的活性提高了30.10%。在固定的蛋白酶添加量條件下，蛋白酶首先對(duì)底物蛋白的主體結(jié)構(gòu)進(jìn)行降解，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，具有活性的肽段得以逐步解離下來(lái)，HMGR抑制活性逐步增加，但是在底物蛋白的所有位點(diǎn)都基本降解完畢后，底物蛋白受蛋白酶的酶解作用結(jié)束，酶解時(shí)間的延長(zhǎng)將不再影響顯著HMGR抑制活性。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.2 The effectof enzymolysis time on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

2.1.3 酶解pH對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響結(jié)果 由圖3可知，隨著酶解pH的增加，蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率逐漸增加。當(dāng)酶解pH為7.0時(shí)，抑制率最高為30.55%±0.86%；之后則逐漸降低，為此選擇7.0作為酶解pH的最佳條件。同時(shí)，隨著酶解pH的變化，HMGR抑制率從11.41%到30.55%，最大差值達(dá)到19.14%，酶解產(chǎn)物的活性提高了62.65%。在固定的酶用量和酶解時(shí)間等條件下，pH對(duì)HMGR抑制率影響明顯，但是本研究采用的是中性蛋白酶，從圖3中可見(jiàn)，只有pH在中性范圍內(nèi)，HMGR抑制率的抑制活性最高，這與蛋白酶活性的最適pH條件有關(guān)。

圖3 酶解pH對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.3 The effectof pH value on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

圖4 酶解溫度對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.4 The effectof temperture on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

2.1.4 酶解溫度對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響結(jié)果 由圖4可知，隨著酶解溫度的增加，蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率逐漸增加。當(dāng)酶解溫度到達(dá)50℃時(shí)，抑制率最高為36.07%±1.14%；之后則

逐漸降低，為此選擇50℃作為酶解溫度的最佳條件。同時(shí)，隨著酶解溫度的變化，HMGR抑制率從9.59%到36.07%，最大差值為26.48%，酶解產(chǎn)物的活性提高了73.41%。每一種蛋白酶都有其最適活性溫度，本研究采用的中性蛋白酶，在50℃時(shí)，蛋白酶活性最強(qiáng)，酶解活性肽的得率最高。

2.1.5 底/水比對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響結(jié)果 由圖5可知，隨著底/水比的增加，蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率逐漸增加。當(dāng)?shù)?水比到達(dá)3.75%時(shí)，抑制率最高為34.14%±1.22%；之后則逐漸降低，為此選擇3.75%作為底/水比的最佳條件。同時(shí)，隨著酶解底/水的變化，HMGR抑制率從8.64%到34.14%，最大差值為25.5%，說(shuō)明酶解產(chǎn)物的活性提高了74.69%。恰當(dāng)?shù)牡孜锏鞍诐舛仁前l(fā)揮蛋白酶最佳酶解能力的關(guān)鍵，底物濃度過(guò)低，蛋白酶與蛋白底物的酶切位點(diǎn)作用機(jī)會(huì)減少，酶解產(chǎn)物得率低。本研究在底/水比低于3.75%時(shí)，抑制率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明底物濃度增加的同時(shí)即增加了蛋白酶與酶切位點(diǎn)作用幾率，活性肽段得率隨之增加。當(dāng)濃度高于3.75%時(shí)，活性隨之下降，說(shuō)明一方面蛋白酶與酶切位點(diǎn)的作用幾率增加，會(huì)出現(xiàn)過(guò)度降解現(xiàn)象，有活性的肽段可能被降解為無(wú)活性組分。另外，由于底物濃度繼續(xù)增加，蛋白酶在酶解體系中對(duì)底物的作用區(qū)域受限，可能成為活性肽段得率降低的原因之一。

圖5 底/水比對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.5 The effectofsubstrate/water ratio on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

由以上的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，酶解溫度、酶解的底/水比在單因素影響下，HMGR抑制率的最大差值已超過(guò)20%，而酶解pH和酶用量也接近20%，在本研究的蛋白酶種類選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶等多個(gè)蛋白酶，比較其酶解蠶蛹蛋白所得活性肽對(duì)HMGR抑制活性抑制率時(shí)，中性蛋白酶所得酶解肽的活性最強(qiáng)，而其最佳pH由于蛋白酶特性關(guān)系，在中性附近活性比較好，故pH本研究響應(yīng)面中不作為關(guān)鍵因子，而將酶用量作為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因子。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化法的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4的方差分析結(jié)果可知，模型的R2=0.9690，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與中心點(diǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相吻合，擬合模型：

Y（%）=45.49+2.73A+2.12B+3.18C-2.70A2-7.43B2-2.16C2-1.59AB-1.71AC+0.94BC

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface analysis test

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA results of central composite test

采用Design-Expert 8.06軟件作圖，各因素對(duì)HMGR抑制率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖6。由圖6的三維曲面圖，可以直觀地反應(yīng)兩個(gè)因素之間對(duì)響應(yīng)值的交互作用。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出，在所選擇的因素取值區(qū)間內(nèi)存在極值。從底/水比與酶用量的交互作用曲面圖可知，隨著蛋白酶用量的增加，HMGR抑制率呈現(xiàn)增加后降低的趨勢(shì)。在固定的酶用量條件下，隨著底/水的增加，HMGR抑制率也呈現(xiàn)增加后逐漸降低的趨勢(shì)比較三個(gè)因素的兩兩交互作用圖，A（底/水比）與B（酶用量）以及A（底/水比）與C（酶解溫

度）的交互作用對(duì)HMGR抑制率的影響較大，表現(xiàn)為曲面比較陡，而在選定的取值區(qū)間內(nèi)，C（酶解溫度）和B（酶用量）的交互對(duì)HMGR抑制率的影響不明顯，曲面圖表現(xiàn)為相對(duì)平緩，曲面響應(yīng)值變化小。這與模型方差分析結(jié)果的AC與AB兩項(xiàng)p＞F值均小于0.05，具有顯著性意義吻合。

通過(guò)模型預(yù)測(cè)的最佳提取條件為底/水比3.9%，酶用量5.1%，酶解溫度52℃；該預(yù)測(cè)模型的最佳HMGR抑制率為46.49%。按模型預(yù)測(cè)的最佳條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際抑制率平均值為45.24%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果的吻合率達(dá)97.31%，以同樣的檢測(cè)方法，具有降血脂作用的藥物辛伐他汀和美伐他汀分別在濃度為0.2mg/m L時(shí)，HMGR抑制率分別為78%和27%。此時(shí)底物的水解度為60.12%。王偉等[12]在利用蠶蛹蛋白通過(guò)雙酶水解制備抗氧化肽的研究中，所得最優(yōu)條件下的水解度為73.29%，說(shuō)明同一蛋白底物在不同的蛋白酶作用下，所得產(chǎn)物所具有的生物活性不同，最優(yōu)條件下的底物水解度也不相同。

圖6 各因素交互作用對(duì)蠶蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影響Fig.6 Effectof the interactions between various factors on HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide

3 結(jié)論

蠶蛹多肽具有諸多生物功效，不同酶解條件下所得多肽活性具有顯著差異。本研究選擇中性蛋白酶，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面中心點(diǎn)組合實(shí)驗(yàn)，逐步優(yōu)化了蠶蛹蛋白降血脂肽的酶解條件。其最佳酶解條件為底/水比3.9%，酶用量5.1%，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間5h，酶解pH=7.0。在此條件下，蠶蛹蛋白降血脂肽的HMGR平均抑制率為45.24%。此外，還建立了基于蠶蛹蛋白降血脂肽酶解條件的優(yōu)化模型。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)97.31%。采用優(yōu)化的酶解條件酶解蠶蛹蛋白降血脂肽，其HMGR抑制率較單因素實(shí)驗(yàn)得到了提高。

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Enzymatic hydrolysis condition optimization of cholesterol-loweringsilkworm pupa protein peptides based on response surface methodology

YANG Yu-ying1，WANG W ei2，*，ZHANG Yu2，ZHANG Yi-fan2，WU Ying-long1

（1.College of Food Science，Sichuan University，Ya’an 625014，China；2.InstituteofQualityand Standard forAgricultureProducts，ZhejiangAcademyofAgriculturalScience，Hangzhou310021，China）

Optimization of the hydrolysis conditions of cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptides byresponse surface methodology was performed. The optimized conditions were as follows ：enzyme dosage5.1%，hydrolyzing 5 hours at the enzymolysis temperature 52℃ and pH=7.0 with a ratio of substrate/water（w/v）3.9% ，the HMGR inhibitory rate of cholesterol -lowering silkworm pupa protein peptide reached 45.24% . Aresponse surface optimized model based on the cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide extractionconditions was established. The verified test results showed the model with a 97.31% accurate rate.

response surface methodoly；enzymatic hydrolyzing；silkworm pupa protein；cholesterol-lowering peptidespep tides

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.031

2013－12－05 *通訊聯(lián)系人

楊玉英（1988-），女，碩士研究生，研究方向：生物功能肽開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31101390）；浙江省自然科學(xué)基金（LY13C200015，LQ13C200005）。