花生粕雙菌液態發酵的工藝研究

張春雨，陳曉丹，毛曉宇，林思敏，賴建平，周勇強，曾慶祝

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

花生粕雙菌液態發酵的工藝研究

張春雨，陳曉丹，毛曉宇，林思敏，賴建平，周勇強，曾慶祝*

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

以水解度（DH）為指標，對米曲霉AS3.951與枯草芽孢桿菌1.398混合液態發酵熱榨花生粕的各種影響因素進行了研究，確定了最優的發酵工藝條件：溫度為30℃，接種比例米曲∶枯草為3∶1，接種量為固態物料的10%，固態物料中花生粕含量為70%、麩皮為30%，兩菌種接種時間差為3h，發酵培養基料液比為1∶16，發酵的時間為56h。本工藝條件的水解度達37.11%，氮溶解指數高達92.52%，制得的發酵液具有純正的發酵風味及鮮味，且無苦味。

花生粕，液態發酵，水解度，混菌發酵

我國花生的加工和綜合利用主要用于榨取花生油，且大部分企業采用的是傳統的高溫機械壓榨提取，故產生大量的副產物花生粕。但由于花生粕中的蛋白質過度變性，通常被作為飼料、有機肥料等使用[1]，嚴重限制了花生蛋白在食品等領域的利用價值，導致花生蛋白資源的大量浪費。目前，國內外對花生粕開發利用的研究主要通過氨基酸和多肽分子的酶催化蛋白質的結構修飾改性，開發易消化吸收肽的應用，常用的方法有化學法、微生物法及酶法。化學法反應劇烈且易產生有害物質，酶解營養價值不易破壞，但風味差且成本高，而微生物發酵法不但成本低且可提高營養價值和改善風味，另外，花生粕發酵食品應用范圍廣泛，如生產酸奶、干酪、醋、醬油和發酵火腿等[2-3]。有研究表明，微生物發酵能使豆粕中的蛋白質發生一定程度的分解，有效降低大、中分子蛋白質的含量，提高低分子蛋白質的含量，而且還積累多種活性因子[4-7]；另外枯草芽孢桿菌與米曲霉均可產生蛋白酶、淀粉酶等多種酶類，兩菌混合發酵能顯著提高豆粕的小肽及氨基酸等小分子的含量[8-10]，故本文從目前研究較為成熟的豆粕發酵工藝出發，選取米曲霉與枯草芽孢桿菌發酵花生粕，探索其最佳工藝條件，提高花生粕的營養價值和利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱榨花生粕；米曲霉AS3.951 廣東省微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌1.398 上海市工業微生物研究所；麩皮 市場購買；種子培養基 麩皮∶花生粕=9∶1，水分含量64%；PDA培養基，營養瓊脂培養基。

ZSD-1270生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；ZHJH-1112垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；HZQ-X 100恒溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；PHS-25數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程

1.2.2 斜面培養及種子培養

1.2.2.1 米曲霉AS3.951 PDA斜面保藏菌種培養：28℃恒溫培養4d，于4℃冰箱保存。

a.一級斜面種子：刮取一環保藏菌種接種于PDA斜面上培養4d。

b.二級三角瓶種曲：用9m L滅菌生理鹽水將一級斜面的菌種的孢子完全沖洗至90m L的滅菌生理鹽水中，移取0.10m L接種到到裝料量為30g/250m L三角瓶中，28℃恒溫培養60h。

擴大培養：稱取0.10g三角瓶種曲于裝料量為30g/250m L三角瓶中，28℃恒溫培養60h。

1.2.2.2 枯草芽孢桿菌1.398 營養瓊脂斜面保藏菌種培養：30℃恒溫培養24h，于4℃冰箱保存。

a.一級斜面種子：刮取一環保藏菌種接種一營養瓊脂斜面上培養24h。

b.二級三角瓶種曲：用9m L滅菌生理鹽水將一級斜面的菌種的孢子完全沖洗至90m L的滅菌生理鹽水中，移取1.00m L接種到到裝料量為30g/250m L三角瓶中，30℃恒溫培養60h。

擴大培養：稱取1.00g三角瓶種曲于裝料量為30g/250m L三角瓶中，30℃恒溫培養60h。

1.2.3 單因素實驗 單因素實驗的基本發酵條件：自然pH下，發酵溫度為30℃，接種量為固態物料的10%，接種比例（米曲霉∶枯草芽孢桿）為1∶1，花生粕為固態物料的70%，麩皮30%，接種時間差為3h（米曲霉先接），料液比1∶10（mg/m L），裝料量3g固態物料/ 150m L三角瓶，發酵時間為72h。依次改變發酵條件的溫度、接種量、接種比、花生粕含量、接種時間差、料液比和發酵時間，以水解度為指標進行研究和分析。各因素研究的水平分別為：溫度：22、26、30、34、38℃；接種量：1%、4%、7%、10%、13%；接種比：1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1；花生粕含量：100%、90%、80%、70%、60%；接種時間差：0、3、6、9、12h；料液比：1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶19；發酵時間：48、56、64、72、80、88h。

1.2.4 正交實驗 在上述單因素實驗的基礎上，固定發酵條件中的花生粕含量為發酵培養基中固態物料的70%、麩皮為30%，兩菌種接種時間差為3h，發酵時間為56h，選擇對發酵液水解度有顯著影響的四個因素：溫度、接種比例、接種量和固液比，以發酵液的水解度為指標進行正交實驗，正交實驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 因素水平表Table 1 Orthogonal factor in the level of table

1.3 測定方法

1.3.1 水解度（DH）測定 甲醛滴定法[11]。

1.3.2 粗蛋白含量的測定 GB 5009.5-2010-分光光度法[12]。

1.3.3 氮溶解指數（NSI）測定 氮含量的測定采用GB 5009.5-2010-分光光度法。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對水解度的影響 由圖1可知，溫度對枯草芽孢桿菌與米曲霉混合發酵花生粕的水解度的影響比較明顯。低于30℃時，水解度隨發酵溫度的增加而呈明顯的直線上升趨勢；在30℃時，水解度到達最大值；30℃以后，水解度呈下降趨勢。這是由于30℃為兩菌種合適的培養溫度，溫度偏低時，菌種生長緩慢，從而產酶周期延長，產酶量低；當培養溫度高于30℃時，雖然發酵前期微生物生長速度較快，但是菌絲生長期和產酶期到達頂峰的時間也快，從而發酵后期基本停止生長，另外溫度過高也易于滋生雜菌，進而影響了發酵的效果，故選取30℃為最適發酵溫度。

圖1 溫度對混合發酵過程中水解度的影響Fig.1 Effectof different fermentation temperature on DH in the mixed fermentation process

2.1.2 接種量對水解度的影響 由圖2可知，接種量為1%到7%時，水解度隨接種量增大而增大，接種量高于7%后，水解度隨接種量的增加變化不大。原因可能是接種量過大時，菌體生長所需的營養相對缺失，使得菌體老齡化加劇，導致產酶率降低，進而導致了水解度變化不大，故選取接種量為7%。

圖2 接種量對混合發酵過程中水解度的影響Fig.2 Effect of inoculation size on DH in the mixed fermentation process

2.1.3 接種比例對水解度的影響 由圖3可以看出，菌種混合比例對枯草芽孢桿菌與米曲霉混合發酵花生粕的水解度的影響較為明顯。隨著米曲霉比例的增加，水解度先呈增加的趨勢，并于米曲霉∶枯草芽孢桿菌=2∶1時達到最高點。原因可能是枯草芽孢桿菌在發酵初始階段吸收營養及繁殖能力強于米曲霉，其含量較高時，會先于米曲霉快速生長發育從而對米曲霉的生長有明顯的抑制作用，導致米曲霉對蛋白酶的分泌量減少，導致兩菌分泌的總蛋白酶量降低，從而造成水解度不高。故選取兩種菌種的混合比例為米曲霉∶枯草芽孢桿菌=2∶1。

圖3 不同菌種混合比例對混合發酵過程中水解度的影響Fig.3 Effectofmixing ratio of differentmicrobial strain on DH in themixed fermentation process

2.1.4 花生粕含量對水解度的影響 由圖4可知，在花生粕含量為70%時水解度最高，之后隨著花生粕含量的增加，水解度逐漸降低。分析原因，發酵培養基所用的底物原料為豆粕和麩皮，麩皮中含有大量微生物所需要的生物素。當底物中的花生粕含量增大時，麩皮的相對含量降低，培養基中缺乏麩皮不利于微生物的生長繁殖，另外在一定范圍內，碳氮比相對較低的培養基，發酵過程中pH逐漸升高，抑制微生物的生長繁殖，故產酶量降低，水解度會不斷下降，故選取花生粕含量為70%。

圖4 花生粕對混合發酵過程中水解度的影響Fig.4 Effectof peanutmeal contenton DH in the mixed fermentation process

2.1.5 接種時間差對水解度的影響 由圖5可以看出，接種時間差對米曲霉與枯草芽孢桿菌混合發酵過程中水解度的影響較為明顯。兩菌種同時接種的水解度明顯小于有時間間隔的水解度，接種時間差為3h時水解度最高，大于3h后水解度程緩慢下降趨勢。分析其原因為，枯草芽孢桿菌在發酵初始階段的生長繁殖能力強于米曲霉，如果在發酵過程中同時接種兩種菌種會造成因為枯草芽孢桿菌先于米曲霉快速生長繁殖易成為優勢菌種，從而對米曲霉的生長產生明顯的抑制作用，使米曲霉的產酶能力嚴重下降，從而減緩混合發酵過程中花生粕的降解，故接種時需有時間間隔。接種時間差由3～12h的過程中，水解度呈下降趨勢，故選取接種時間差為3h。

圖5 接種時間差對混合發酵過程中水解度的影響Fig.5 Effectof time difference of different vaccination on DH in themixed fermentation process

2.1.6 料液比對水解度的影響 由圖6可得，在固液比小于1∶16時，水解度隨固液比的減小而增大，并于固液比為1∶16時達到最大值，隨后呈下降趨勢。這是因為底物分散在溶液體系中的量隨固液比的減小而增加，有利于微生物在發酵初始階段吸收營養進行繁殖及底物與微生物分泌的酶充分接觸，但當料液比過小時，底物的濃度較小，微生物生長的速度及酶的水解效率受底物濃度的限制，故選取料液比為1∶16。

圖6 料液比對混合發酵過程中水解度的影響Fig.6 The effectof solid-to-liquid ratio on DH in the mixed fermentation process

2.1.7 發酵時間對水解度的影響 由圖7可知，米曲霉與枯草芽孢桿菌混合發酵花生粕的過程中，在發酵時間小于56h時，水解度增加顯著，但56h之后呈波動狀態。這是由于米曲霉和枯草芽孢桿菌生長繁殖，產生大量的酶，酶的活性不斷增強，進而促進花生粕中的蛋白質等大分子物質的降解，因此水解度快速升高。發酵56h后，隨著時間的延長，水解度變化不明顯，可能是菌體的大量積累，培養基中的營養物質已

被大量消耗，菌體生長進入了穩定期，甚至衰亡期，菌體大量死亡，故分泌蛋白酶的能力下降，酶活力降低。所以發酵時間為56h最適宜。

圖7 混合發酵過程中水解度隨時間的變化趨勢Fig.7 Variation trend of DH inmixed fermentation process with time

2.2 正交實驗結果

表2 L9（34）正交實驗表Table 2 Orthogonal test result

由表2可以得出，對混合菌種液態發酵花生粕水解度影響最大的因素是接種量，其次是接種比例和溫度，料液比的影響最小，通過極差分析得到最優組合為A2B1C3D2。為了驗證結果的準確性，根據極差分析所得的最佳工藝條件A2B1C3D2與正交表中水解度最大的第7號實驗A3B1C3D2做驗證實驗，得到結果為DH（A2B1C3D2）=37.11%，DH（A3B1C3D2）=37.17%，由于兩者的水解度相差不大，綜合能耗與發酵液風味的考慮，選取發酵溫度較低的方案A2B1C3D2為最優方案，即溫度為30℃，接種比例（米曲∶枯草）為3∶1，接種量為固態物料的10%，發酵培養基料液比為1∶16。在此條件下的水解度為37.11%，高于正交實驗中除了第7號實驗以外的各組實驗的結果，證明所得優水平是可靠的。

3 結論

通過單因素實驗與正交實驗可以得出米曲霉與枯草芽孢桿菌混合固態發酵花生粕的最佳工藝條件：溫度為30℃，接種比例米曲∶枯草為3∶1，接種量為固態物料的10%，固態物料中花生粕含量為70%、麩皮為30%，兩菌種接種時間差為3h，發酵培養基料液比為1∶16，發酵時間為56h，此方案所得水解度為37.11%，氮溶解指數高達92.52%。本工藝制得的發酵液不但無苦味且具有純正的發酵風味及鮮味，為直接應用于食品上提供可能。

[1]劉巖，王爾茂，黃國平，等.淺談花生粕的加工和研究進展[A].//李汴生.廣東省食品學會第六次會員大會暨學術研討會論文集[C].廣東廣州：2012：201-206.

[2]張巖，肖更生.花生粕的應用進展[J].食品工業科技，2006，27（8）：197-198.

[3]蔡國林，鄭兵兵，王剛，等.微生物發酵提高花生粕營養價值的初步研究[J].中國油脂，2010，35（5）：31-34.

[4]張偉，李兆勇，姚琨淺.淺談微生物發酵在豆粕中的作用及應用優勢[J].飼料廣角，2012（9）：33-35.

[5]馬文強，馮杰，劉欣.微生物發酵豆粕營養特性研究[J].中國糧油學報，2008，23（1）：121-124.

[6]蔡國林，楊旭，曹鈺，等.微生物發酵對豆粕營養價值的影響[J].中國油脂，2008，33（10）：21-24.

[7]楊彩艷，宋俊梅.液態發酵大豆肽分子量分布與酶分布關系研究[J].糧食與油脂，2009（10）：19-22.

[8]陳中平，周安國，王之盛，等.米曲霉發酵豆粕營養特性的研究[J].營養飼料，2011，47（9）：40-44.

[9]吳寶昌，宋俊梅.枯草芽飽桿菌與米曲霉混合發酵制備豆粕飼料的研究[J].山東輕工業學院學報，2010，24（2）：12-15.

[10]劉海燕，邱玉朗，魏炳棟，等.微生物發酵豆粕研究進展[J].動物營養學報，2012，24（1）：35-40.

[11]徐勤，葛向陽，劉建峰.甲醛法測大豆蛋白水解度的改進[J].飼料工業，2008，29（5）：46-47.

[12]GB 5009.5—2010，食品中蛋白質的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

Study on improving the value of peanut meal byliquid-state fermentation with binary compound strains

ZHANG Chun-yu，CHEN Xiao-dan，M AO Xiao-yu，LIN Si-m in，LAI Jian-ping，ZHOU Yong-qiang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Aspergillus oryzae AS3.951 and Bacillus subtilis 1.398 were used in the liquid-state fermentation ofpeanut meal and degree of hydrolysis to determine the optimal ferment conditions. The results showed that theoptimal conditions were as follows：fermentation temperature 30℃，inoculum size 10%，inoculation proportion3∶1，peanut content 70%，Bran was 30%，two strain vaccination time difference for 3h，solid/liquid 1∶16，time56h. Under the optimized conditions，the DH（%） and NSI（%） reached 37.11% and 92.52% respectively. Theproduct had a pure fermented flavor and good umami.

peanut meal；liquid-state fermentation；DH；mixed fermentation

TS229

：A

：1002-0306（2014）16-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.033

2013－11－11 *通訊聯系人

張春雨（1991-），女，大學本科，研究方向：食品科學與工程。

廣東省大學生創新實驗項目（1107812003）；第十三屆全國挑戰杯校級項目以及廣州市科技計劃項目（12C12011620）。