響應面法優化雙水相萃取棉花葉中總黃酮的研究

羅光宏，張喜峰，張麗娟，李靜雅，李小霞

（1.河西學院凱源生物技術開發中心，甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖734000；2.河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000）

響應面法優化雙水相萃取棉花葉中總黃酮的研究

羅光宏1，張喜峰2，*，張麗娟2，李靜雅2，李小霞2

（1.河西學院凱源生物技術開發中心，甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖734000；2.河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000）

采用乙醇-硫酸銨雙水相體系分離純化棉花葉中總黃酮，確定其雙水相體系組成為23%無水乙醇-22%（NH4）2SO4，通過單因素實驗和Box-Behnken Design實驗研究粗提液質量分數、pH、NaCl質量分數三個變量對棉花葉中總黃酮響應值的影響程度，用響應面法得出三個考察因素最優工藝參數，即：粗提液質量分數31%、pH4、NaCl質量分數3%，在此條件下萃取率為76.32%。與響應面法優化黃酮萃取率預測值78.02%接近，為棉花葉中總黃酮有效開發利用提供一定的借鑒作用。

響應面法，棉花葉片，黃酮

棉花葉中存在黃酮類化合物，它是重要的抗病蟲害物質[1]。目前對棉花葉中黃酮類化合物的提取研究報道較少。馬彥梅等[2]對棉花根莖葉黃酮化合物進行了超聲提取，主要側重于如何提高目標產物萃取率，忽略了目標成分與雜質的分離問題。而雙水相萃取是利用物質在互不相溶的兩水相間分配系數的差異進行萃取的方法[3]。短鏈醇/鹽體系作為一種新型的雙水相體系，因原料豐富、價格低廉、溶劑粘度小、傳質速度快、能除去大量雜質、試劑易回收等優點，引起了廣泛關注，已被用于生物化工、天然產物等領域[4]。采用短鏈醇/鹽雙水相體系提取棉花葉黃酮的方法尚未見報道。

利用乙醇/硫酸銨雙水相萃取技術對棉花葉中黃酮活性成分進行提取，在單因素實驗基礎上通過響應面法來優化棉花葉中黃酮最佳提取條件，為棉花葉中黃酮有效利用和開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉花葉片 采自甘肅民勤，經洗凈、自然晾干、粉碎并過40目篩得到棉花葉粉末；蘆丁對照品 上海一基生物科技有限公司，純度＞98%；硝酸鋁 天津亞太龍興化工有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉 天津開發區花光化學制藥廠；硫酸銨 天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸、無水乙醇 天津市百世化工有限公司。

PL-203型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限

公司；XO-SM 5O型超聲波-微波反應系統 南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501型數顯超級恒溫水浴鍋 揚州市三發電子有限公司；DHG-9101.1型電熱恒溫鼓風干燥箱、722型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FZ102型植物試樣粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉花葉總黃酮粗提液的制備 準確稱取10g已粉碎的棉花葉粉末，以1∶10（g/m L）料液比加入到50%乙醇中，325W超聲10m in（超2s，停2s），抽濾，收集濾液得棉花葉總黃酮粗提液，測定粗提液中棉花葉總黃酮的含量。

1.2.2 黃酮測定 采用鋁離子絡合法[5]，以蘆丁為標準品，510nm處吸光值為縱坐標，蘆丁的含量（mg）為橫坐標繪制標準曲線。蘆丁標準曲線方程：y=1.245x-0.0024（R2=0.992）。式中y為吸光值，x為蘆丁的含量（mg）。將棉花葉總黃酮提取液稀釋后按上述方法測定吸光值，根據蘆丁標準曲線計算稀釋液中黃酮的質量濃度。

1.2.3 雙水相萃取方法 稱取一定量無水乙醇、（NH4）2SO4、棉花葉總黃酮粗提液于小燒杯中，使雙水相體系總質量為10.00g，充分振蕩使成相物質溶解，并調節體系pH，靜置10m in，兩相達到相分離，棉花葉總黃酮富集于雙水相系統的上相中，測定相比R和棉花葉總黃酮的含量，并計算其分配系數K及萃取率Y，如下式：

R=Vt/VbK=Ct/Cb

Y（%）=（RK/1+RK）×100

式中：Vt為上相體積，m L；Vb為下相體積，m L；Ct為上相黃酮的質量濃度，mg/m L；Cb為下相黃酮的質量濃度，mg/m L。

1.2.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系的確定 通過改變乙醇質量分數（19%、21%、23%、25%、27%）、硫酸銨質量分數（18%、20%、22%、24%、26%）確定雙水相體系的組成。

1.2.5 影響棉花葉總黃酮萃取的因素

1.2.5.1 單因素實驗設計 在確定了雙水相體系組成后，研究pH（3、4、5、6、7）、黃酮粗提液質量分數（10%、20%、30%、40%、50%）、NaCl質量分數（1%、2%、3%、4%、5%）對黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 Box-Behnken法優化實驗 在單因素實驗的基礎上選擇pH、粗提液質量分數以及NaCl質量分數這3個因素作為自變量，Box-Behnken響應面法對萃取條件進行優化。實驗設計方案如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計因素及水平Table 1 Factors and level in the Box-Benhnkenexperimental design

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇質量分數對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 選取19%、21%、23%、25%、27%無水乙醇，22%（NH4）2SO4和質量分數為20%粗提液組成雙水相體系，室溫條件下，混勻調節pH 7，靜置分層后，對上下相溶液進行分析。

如圖1所示，隨著乙醇質量分數的增加，棉花葉片黃酮的萃取率Y和分配系數K逐漸增大，在23%時達到最大值，這是因為硫酸銨的初始質量分數相同時，乙醇質量分數增大，分相能力也就增強，上相中乙醇質量也就隨之增加，而黃酮在乙醇中的溶解度比水中的大，所以萃取率Y和分配系數K均增大[6]。因此無水乙醇質量分數選擇為23%。此后，隨著無水乙醇質量分數的增加，總黃酮提取率顯著下降，其主要原因可能是無水乙醇質量增加了雙水相體系的分相能力增加，黃酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇質量分數過高時，其他有機物的溶出量也會增加，從而抑制了總黃酮的浸出[7]。

圖1 乙醇質量分數對棉花葉總黃酮分配系數和萃取率的影響Fig.1 Effectof ethanol concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.2（NH4）2SO4質量分數對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 選取18%、20%、22%、24%、26%（NH4）2SO4，23%無水乙醇和質量分數為20%粗提液組成雙水相體系，室溫條件下，混勻調節pH 7，靜置分層后，對上下相溶液進行分析。

圖2 硫酸銨質量分數對棉花葉總黃酮分配系數和萃取率的影響Fig.2 Effectof ammonium sulfate concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

由圖2可知，隨著（NH4）2SO4質量分數的增加，分

配系數和萃取率先是逐漸上升，當質量分數達到22%時呈下降趨勢。可見，（NH4）2SO4質量分數影響雙水相體系，可以改變各相中成相物質的組成和相比[8]，從而影響黃酮在上相中的分配，導致分配系數和萃取率隨（NH4）2SO4質量分數的增加而下降。因此（NH4）2SO4的最佳質量分數選擇22%。

2.1.3 pH對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 在23% CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，加入質量分數20%黃酮粗提液，調節體系pH分別為3、4、5、6、7，靜置分層后，對上下相溶液進行分析。

如圖3所示，隨著雙水相體系pH逐漸升高，棉花葉總黃酮萃取率和分配系數逐漸增加，在pH4時，達到最大值。pH的變化改變了棉花葉黃酮的電性和表面性質，同時也改變了無機離子的分配情況，從而影響兩相之間的電位差[9]，最終影響K值。pH為4時，棉花葉黃酮的萃取率最高。

圖3 體系pH對棉花葉總黃酮分配系數和萃取率的影響Fig.3 Effect of pH on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.4 NaCl質量分數對棉花葉片黃酮分配行為的影響 在23%CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，加入質量分數20%黃酮粗提液，添加1%、2%、3%、4%、5%NaCl，體系pH為4.0，靜置分層后，對上下相溶液進行分析。無機鹽的加入能夠縮短分相時間從而影響萃取過程，而且無機鹽能夠影響雙水相兩項之間的電位差、相體積比和兩相中成相物質的組成[10]。

圖4 NaCl質量分數對棉花葉總黃酮分配系數和萃取率的影響Fig.4 Effectof NaCl concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

如圖4所示，實驗結果顯示：當NaCl添加量達到3%時，棉花葉黃酮萃取率最高；NaCl質量分數超過3%時，棉花葉黃酮萃取率下降。這可能是由于加入的NaCl過多導致鹽析現象的出現，棉花葉黃酮隨著鹽從兩相體系中一齊沉淀出來[11]。因此，NaCl質量分數選擇為3%。

2.1.5 粗提液質量分數對棉花葉片黃酮分配行為的影響 在雙水相體系萃取棉花葉片黃酮時，粗提液質量數是影響萃取結果的重要因素。在以上獲得的最優條件下，分別添加質量分數為10%、20%、30%、40%、50%粗提液，靜置分層后，對上下相溶液進行分析。如圖5所示，原液質量分數為30%時，棉花葉片黃酮萃取率達到最高。當原液質量超過30%時，萃取率變化不大，且有下降的趨勢。因此確定最佳粗提液質量分數為30%。

圖5 粗提液質量分數對棉花葉總黃酮分配系數和萃取率的影響Fig.5 Effectof crude extrat concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.2 響應面法優化與分析

用Design-Expert8.0軟件隨機產生Box-Behnken Design實驗方案，在無水乙醇-（NH4）2SO4體系基礎上，對pH（A）、粗提液質量分數（B）、NaCl質量分數（C）設計了3因素3水平的17組實驗，對考察因素和其水平進行設計，得出其17次實驗響應結果，見表2，并對實驗結果進行方差分析，見表3。

將所得實驗數據用Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合，根據表2的實驗結果，得到棉花葉片黃酮萃取率對編碼自變量pH、粗提液質量分數和NaCl質量分數的二次多元回歸方程式：

Y=77.86+0.4625A+1.5375B+0.675C+0.15AB-0.775AC+2.675BC-2.555A2-7.305B2-3.73C2

從方差分析結果可以看出，該回歸模型F檢驗非常顯著（p＜0.001），調整后的決定系數R2值為0.9932，表明在考察值與模型預測值存在高度聯系。其中失擬項在p=0.05水平上不顯著（p=0.1952＞0.05），表明此模型擬合程度較好。各因素中B、BC、A2、B2、C2因素對黃酮結果有極顯著的影響（p＜0.01）；C、AC對黃酮結果的影響是顯著的。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，且對提取條件進行優化是可行的，得到的棉花葉片黃酮萃取條件具有實際應用價值。

通過Design-Expert 8.0軟件優化功能再次優化，

得出雙水相萃取棉花葉中黃酮萃取率最優工藝參數，即：pH 4.07，粗提液質量分數為31.3%，NaCl質量分數為3.13%，萃取率為78.02%。考慮到實際操作的可行性，將雙水相萃取棉花葉黃酮在理論值基礎上修正為pH4，粗提液質量分數為31%，NaCl質量分數為3%。

表2 Box-Benhnken實驗設計結果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 棉花葉片提取工藝優化模型方差分析Table 3 Mathematicalmodel a analysis of variance on ptimization extraction cotton blade flavonoids

根據回歸方程利用Design-Expert 8.0繪出響應面圖，即圖6a～c。每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平。圖6a顯示，NaCl質量分數為3%時，pH與粗提液質量分數對雙水相萃取黃酮的影響。由圖6a可知，pH對雙水相萃取黃酮的影響較小，曲面較平滑。粗提液質量分數對雙水相萃取黃酮的影響較大，表現為較陡的曲面；圖6b顯示，粗提液質量分數為30%時，pH與NaCl質量分數對雙水相萃取黃酮的影響。由圖6b可知，當pH一定時，隨著NaCl質量分數提高，萃取率先增大后減小。圖6c顯示了粗提液質量分數與NaCl質量分數對雙水相萃取黃酮的影響。從圖6c可以看出，粗提液質量分數與NaCl質量分數取某適中值時會使萃取率達到最大值，且過高或過低都會使萃取率降低。

圖6 各因素交互作用的等高線圖Fig.6 Contour plot for the pairwise interactive Effectof mass fraction of crude extract，pH andmass fraction of NaCl on extraction yield

2.3 驗證響應面法得出棉花葉中黃酮雙水相萃取的最佳條件

在修正條件下，即：pH 4，粗提液質量分數為31%，NaCl質量分數為3%，對模型預測值進行實驗驗證，平行實驗3次，棉花葉黃酮平均萃取率為76.32%，與響應面法優化得到的黃酮萃取率預測值78.02%接近。因此，響應面法對提取條件進行優化是可行的，得到的棉花葉黃酮萃取條件具有實際應用價值。

3 結論

雙水相體系中無水乙醇、（NH4）2SO4、pH、粗提液質量分數、NaCl質量分數對雙水相萃取棉花葉黃酮均有影響，實驗確定萃取棉花葉黃酮雙水相體系組成為23%無水乙醇-22%（NH4）2SO4，研究了pH、粗提液質量分數、NaCl質量分數對雙水相體系萃取棉花葉黃酮的影響，用響應面曲線擬合出一個二次回歸方程，找出乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取黃酮最優組合為pH4、粗提液質量分數為31%、NaCl質量分數為3%，在該條件下進行了3次平行實驗，棉花葉黃酮平均萃取率為76.32%。研究結果為利用乙醇/硫酸銨雙水相體系從棉花葉中萃取分離黃酮提供了一種新的提取方法，對其他植物中黃酮的提取分離也有一定的參考和借鑒價值。

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Study on the optimization of aquoues two-phase extraction oftotal flavonoids from cotton leaves using response surface methodology

LUO Guang-hong1，ZHANG Xi-feng2，*，ZHANG Li-juan2，LI Jing-ya2，LIXiao-xia2
（1.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，Kaiyuan Bio-tech Development Center，HexiUniversity，Zhangye 734000，China；2.The College of Agriculture and Biotechnology（CAB），HexiUniversity，Zhangye 734000，China）

An aqueous two-phase system composed of 23% ethanol and 22% （NH4）2SO4 was used to extracttotal flavonoids from cotton leaves. Mass fraction of crude extract，pH and mass fraction of NaCl on the extractionefficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods. Theresults showed that the optimal conditions were as follows ：crude extract concentration 31% ，pH4，NaClconcentration 3%. Under the above conditions the confirmed tests indicated that the extraction rate of totalflavonoids was 76.32% which had close relation with the predicted yield of the extraction rate of total flavonoidswas 78.02%. The study would provide reference for the effective utilization of flavonoids from cotton leaves.

response surface methodology；cotton leaves；flavonoids

TS210

：B

：1002-0306（2014）16-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.036

2013－08－05 *通訊聯系人

羅光宏（1965-），男，碩士研究生，教授，研究方向：天然產物分離。

甘肅省中小企業創新基金項目（1110FCCG112）；甘肅省微藻工程技術研究中心建設項目（1009FTGG017）。