超聲波輔助提取牛睪丸中精蛋白工藝優化

李若綺，韓 玲，*，李儒仁，韓廣星，左秀峰，余群力，安邁瑞

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東臨沂276000）

超聲波輔助提取牛睪丸中精蛋白工藝優化

李若綺1，韓 玲1，*，李儒仁1，韓廣星2，左秀峰2，余群力1，安邁瑞1

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東臨沂276000）

以牛睪丸為原料，確定超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白的最優工藝條件。實驗采用Box-Behnken設計模型確定最佳提取條件為：硫酸濃度5.5%、超聲波功率190W、提取時間10min，牛睪丸精蛋白產率為4.19%，精蛋白含量為66.70μg/g，產率比硫酸提取法提高了33.87%，提取時間縮短至10min，蛋白質含量增加了6.47μg/g，選擇95%的乙醇作為沉淀劑時，乙醇體積比1∶3時，所得精蛋白粗品的產率、水溶性和色澤均最佳。

響應面法，超聲波輔助提取，牛睪丸精蛋白

精蛋白（Protam ine）是一種多聚陽離子堿性天然抗菌肽類，一般由30～50個氨基酸組成，主要以精氨酸為主。常與DNA結合，其中DNA含量約占總量2/3，精蛋白占總量1/3[1-4]。精蛋白在臨床上具有提高肝功能、助呼吸、促消化、降血壓、抑制腫瘤生長等作用及治療糖尿病等功能[5]。許多種動物成熟精巢組織中均可提取到精蛋白，并就其作用及基因序列進行了大量研究[6]。近年來，人們日益關注它的另一項作用，即精蛋白可作為增味劑、調味劑、防腐劑，廣泛應用于諸如米飯、中華面、炒面、饅頭、餃子等淀粉類食品中，還可與醋酸鈉、甘氨酸、乙醇等復配后用于蛋糕、糊狀食品[7-9]。

精蛋白提取通常利用大多數蛋白質不溶于NaCl（0.14mol/L）但溶于硫酸的原理，將大部分蛋白質沉淀溶解，進而利用有機溶劑降低溶液介電常數，增加蛋白質分子間不同電荷吸引力，使精蛋白在有機溶劑中沉淀析出[10]。超聲波輔助提取法較上述提取方法，在提取過程中加入了超聲波處理工序，降低了蛋白質變性失活幾率，且超聲波作用均勻，因而得到目的產物較快、較純。

目前，人們已提取的動物精蛋白，主要來源于魚類，而對哺乳動物精蛋白提取工藝的相關報道較少。作為畜產業生產大國，我國肉牛生產總量位居世界前列。隨著肉牛養殖業迅猛發展，副產物也隨之大量增加，而大部分的副產物都被浪費。因此，利用臟器資源，提取牛睪丸精蛋白具有十分重要的意義。本實驗通過在單因素基礎上進行響應面實驗設計，對牛睪丸精蛋白得率進行分析，研究牛睪丸精蛋白的最佳提取方法及提取工藝參數，為精蛋白提取及其產業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛睪丸 山東綠潤食品有限公司，用水洗清潔后除去附著在睪丸上的脂肪、結締組織、血塊和污物等，將處理過的樣品于-80℃下凍藏待用；氯化鈉、濃硫酸、三氯乙酸、乙醇、丙酮、乙醚、異丙醇 上述所用試劑均為分析純，天津市光復科技發展有限公司。

JY92-ⅡDN型超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；756P型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FA1204B型電子天平 上海佑科儀表有限公司；JJ-2B型組織搗碎勻漿機 金壇市醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要工藝流程

1.2.2 實驗方法 準確稱取100g解凍的牛睪丸，置于組織搗碎機中，加入200m L的NaCl（0.14mol/L）溶液勻漿1min，冰浴攪拌20min后靜置10min。所得勻漿液離心（4000r/m in，0℃，10m in），棄去上清液，所得沉淀即脫氧核糖核蛋白（DNP）[11]。在提取的脫氧核糖核蛋白中加入一定量不同濃度的硫酸溶液，進行超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白[12]，提取后離心（4000r/min，0℃，10m in），分離上清液，所得沉淀加入上述硫酸溶液重溶后重復上述操作一次，將兩次操作的上清液合并，加入有機溶劑冰浴沉淀30m in后離心10m in（8000r/min，0℃），所得沉淀用丙酮洗滌2次，乙醚洗滌1次后真空干燥，得牛睪丸精蛋白。

1.2.4 精蛋白含量檢測 采用考馬斯亮藍蛋白質含量測定法[13]。

1.2.5 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的單因素實驗

1.2.5.1 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白硫酸濃度的確定 分別配制不同濃度的硫酸溶液（2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%），按照1.2.2操作要求在提取的脫氧核糖核蛋白中加入硫酸溶液，用200W超聲提取精蛋白30m in，加入有機溶劑沉淀離心制取牛睪丸精蛋白。

1.2.5.2 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白超聲波功率的確定 配制濃度為7.5%的硫酸溶液，設置超聲波功率為：100、200、300、400、500、600W，提取時間30m in，采用1.2.2方法制取牛睪丸精蛋白。

1.2.5.3 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白提取時間的確定 配制濃度為7.5%的硫酸溶液，設置超聲波功率為400W，提取牛睪丸精蛋白方法同1.2.2，其中提取時間分別為10、20、30、40、50、60m in。

1.2.6 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的優化在單因素實驗的基礎上，選取硫酸濃度、提取時間和超聲波功率為實驗因素，以精蛋白得率為響應值，采用Box-Behnken設計模型對超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的參數進行優化，共設計實驗17組，每組做三個平行，利用Design-Expert 8.05b軟件對實驗數據進行分析處理，以獲得最佳參數。每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。實驗因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼Table 1 Chartof coding factors

1.2.7 沉淀劑的篩選在1.2.2實驗中，分別以不同體積比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4）的乙醇（95%）、丙酮、三氯乙酸（60%）、異丙醇作為沉淀劑沉淀牛睪丸精蛋白。以精蛋白產率、所得產品溶解性、色澤為指標，選擇出最佳沉淀劑和沉淀劑最佳用量。

1.3 數據處理

使用M icrosoft Excel和Design Expert進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 硫酸濃度對精蛋白產率影響 由圖1可知，在超聲波功率300W、提取時間為20min的條件下，隨著硫酸濃度從2.5%增加到12.5%，精蛋白產率先快速上升后緩慢下降，且在5%時產率最高為3.54%；硫酸濃度過低時，結合精蛋白少，生成精蛋白硫酸鹽少，提取不完全，而硫酸濃度過高時，蛋白質可能被部分水解；硫酸濃度在12.5%后，精蛋白產率會更低。由此，初步確定硫酸濃度范圍為2.5%～10%。

圖1 硫酸濃度對牛睪丸精蛋白產率的影響Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on testicular productivity

2.1.2 超聲波功率對產率影響 由圖2可知，在硫酸濃度為5%、提取時間為20min的條件下，隨著超聲波功率從100W增加到300W，精蛋白產率先上升后下

降，且當功率達到200W時精蛋白產率最高為3.67%，這是因為超聲波的空化效應和機械效應會促進溶劑向精蛋白表面擴散，促進精蛋白硫酸鹽的生成，但隨著功率的增大可能會引起部分蛋白質的降解，而且對于特定的物質，超聲作用的效果取決于超聲頻率和提取物的結構與性質，不同的提取物有不同適宜的提取超聲功率；功率在400W處精蛋白產率略有上升，但不明顯。據此初步確定超聲波功率范圍為100～400W。

圖2 超聲波功率對牛睪丸精蛋白產率的影響Fig.2 Effectof ultrasound power on testicular productivity

2.1.3 提取時間對產率影響 由圖3可知，在硫酸濃度為5%、超聲波功率300W的條件下，隨著提取時間從10m in增加到60m in，精蛋白產率先上升后持續下降，且在提取時間20m in達到最大值為3.58%，下降趨勢在提取時間為40m in后趨于平緩，這是因為絕大多數的精蛋白都在20m in內被提取出來，隨著時間進一步的延長部分蛋白質會溶解。綜合考慮經濟和效率等因素，初步確定提取時間范圍為10～40m in。

圖3 提取時間對牛睪丸精蛋白產率的影響Fig.3 Effectof extraction time on testicular productivity

2.2 超聲波提取工藝參數優化

采用Box-Behnken設計模型能用較少的實驗次數進行全面的分析研究[14-17]。以硫酸濃度、提取時間和超聲波功率為實驗因素，以精蛋白產率為響應值，各實驗因素水平編碼如表1所示，共實施17組響應面分析實驗。用Design-Expert 8.05進行數據處理分析，各組實驗列表及產率見表2。

2.2.1 回歸模型建立及檢驗 實驗結果表示，精蛋白產率在3.7%～4.3%之間。借助Design-Expert 8.05軟件對所得實驗結果進行分析，獲得對牛睪丸精蛋白產率Y的二次回歸模型為：

表2 響應面分析結果Table 2 Results of response surface analysis

上述二次回歸模型進行方差分析和回歸系數顯著性檢驗，結果如表3所示。

由表3方差分析可知，回歸模型的p＜0.01，表明回歸模型極其顯著；失擬項p＞0.05，失擬不顯著，說明模型所擬合的二次回歸方程與實際相符合，能正確反映牛睪丸精蛋白產率Y與X1、X2和X3之間的關系，回歸模型可以較好地對優化實驗中各種實驗結果進行預測。

2.3 各因素對性能指標的影響分析

2.3.1 硫酸濃度和超聲波功率對精蛋白產率的影響

令X3=0，得硫酸濃度X1和超聲波功率X2與精蛋白產率Y之間的偏回歸方程為：

Y=3.565+0.22X1+8.61111×10-4X2+1.33333× 10-4X1X2-0.022756X12-4.22222×10-6X22

圖4 硫酸濃度和超聲波功率對應精蛋白產率的響應面圖Fig.4 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and ultrasonic power

由圖4可以看出，硫酸濃度由2.5%向7.0%變化時，

精蛋白產率不斷增大，且上升趨勢較明顯。當硫酸濃度固定在某一水平時，隨超聲波功率的增加（100～400W），精蛋白產率變化不大。由此說明在硫酸濃度變化不大時，精蛋白產率對于在一定范圍內超聲波功率的變化不很敏感。由偏回歸分析和方差分析可知，硫酸濃度對精蛋白產率的影響大于超聲波功率。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Results of ANOVA

2.3.2 硫酸濃度和提取時間對精蛋白產率的影響 令X2=0，得硫酸濃度X1和提取時間X3與精蛋白產率Y之間的偏回歸方程為：

圖5 硫酸濃度和提取時間對應精蛋白產率之間的響應面圖Fig.5 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and extraction time

由圖5可以看出，提取時間由10m in向40m in變化時，精蛋白產率變化不大。當提取時間固定在某一水平時，隨硫酸濃度的增加，精蛋白產率明顯先快速上升（2.5%～6.0%），然后下降（6.0%～10%）。由此說明在提取時間變化不大時，精蛋白產率對于在一定范圍內硫酸濃度變化非常敏感。由方差分析和偏回歸分析可以得出，硫酸濃度對精蛋白產率的影響大于提取時間。

2.3.3 超聲波功率和提取時間對精蛋白產率的影響

令X1=0，得超聲波功率X2和提取時間X3與精蛋白產率Y之間的偏回歸方程為：

圖6 提取時間和超聲波功率對應精蛋白得率之間的響應面圖Fig.6 Response surface graph of testicular productivity between ultrasonic power and extraction time

由圖6可以看出，超聲波功率由80W向200W變化時，精蛋白產率不斷增大，且上升趨勢較明顯，從200W開始到600W時，產率隨著超聲波功率增加而快速降低。當超聲波功率固定在某一水平時，隨提取時間的增加，精蛋白產率出現下降趨勢。由此說明，精蛋白產率對一定范圍內超聲波功率變化和提取時間變化都較為很敏感。由方差分析和偏回歸分析可以得出，超聲波功率對精蛋白產率的影響大于提取時間。

2.4 最優作業參數確定及模型驗證

通過對回歸方程模型進行優化求解，以精蛋白產率最大值（4.21%）作為相應結果，從Design Expert軟件中可得到超聲波輔助牛睪丸精蛋白提取最優工藝參數為：硫酸濃度5.48%、超聲波功率188.54W和提取時間10m in。3個因素對牛睪丸精蛋白產率影響主次順序為：硫酸濃度、超聲波功率和提取時間。

為了進一步為了驗證模型的可靠性，采用響應

面所得最優條件的調整參數（硫酸濃度5.5%、超聲波功率190W，提取時間10min）進行精蛋白提取實驗。從表4可以看出，兩種方法提取牛睪丸精蛋白后產率分別為3.13%、4.19%，蛋白含量分別為60.23、66.70μg/g。該產率與Design Expert模擬結果相比，相對誤差為0.24%。同硫酸提取實驗中最優結果相比，產率相對提高了33.87%，提取時間縮短至10m in。因此，通過響應面實驗設計得到的牛睪丸精蛋白提取工藝參數準確可靠，可用于實際操作。

表4 牛睪丸中精蛋白含量及產率Table 4 Testicular productivity and content in bovine testis

2.5 沉淀劑的篩選

2.5.1 沉淀劑種類選擇 分別用乙醇（95%）、三氯乙酸（60%）、異丙醇、丙酮沉淀牛睪丸精蛋白，所得精蛋白粗品的產率、水溶性和色澤見表5。

表5 不同沉淀劑效果比較Table 5 Results of precipitation using different reagent

從表5可以看出，以產率而言，95%乙醇、60%三氯乙酸的產率較高，其中以60%三氯乙酸為沉淀劑的產率最高。從溶解性來看，以丙酮、60%三氯乙酸、為沉淀劑所得產品的溶解性不好，難溶解，有沉淀。綜合考慮，選擇95%乙醇作為沉淀劑。

2.5.2 沉淀劑95%乙醇用量確定 由圖7可知，95%乙醇體積比為1∶1、1∶1.5、1∶2時，精蛋白產率在3%以下，當沉淀劑體積比增加到1∶2.5時，產率為3.28%；當沉淀劑的體積比為1∶3時，精蛋白產率最高為4.2%；隨著沉淀劑體積比的增加，牛睪丸精蛋白粗品的產率緩慢下降。所以選擇體積比為1∶3的95%乙醇作為沉淀劑來沉淀牛睪丸精蛋白。

圖7 不同體積比對應牛睪丸精蛋白產率Fig.7 Testicular productivity using different volume ratio in bovine testes

3 結論

經過上述實驗和統計分析，本實驗所得出結論如下：

3.1 結合Box-Behnken實驗設計原理，采用響應面分析方法，進行超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白工作參數優化，通過實驗優化結果可得影響精蛋白產率的因素由大到小依次為：硫酸濃度、超聲波功率和提取時間。

3.2 由回歸模型得出超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白最佳工藝參數為：硫酸濃度5.48%、超聲波功率188.54W和提取時間10m in，實際操作選擇硫酸濃度為5.5%、超聲波功率為190W，提取時間10m in。

3.3 超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白優于硫酸提取法，超聲波輔助法比硫酸提取法產率提高了33.87%，提取時間縮短至10m in，蛋白質含量增加了6.47μg/g。

3.4 以95%乙醇作為沉淀劑來沉淀牛睪丸精蛋白，當乙醇體積比為1∶3時，精蛋白產率最高。

綜上所述，本實驗確定了超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白優化工藝參數，為精蛋白工業化生產提供了理論依據。

[1]蒙學蓮，鄭亞東.魚精蛋白的研究現狀及應用[J].黑龍江畜牧獸醫，2007（5）：26-27.

[2]黃占旺，上官新晨，沈勇根，等.鯉魚精蛋白的提取與抗菌穩定性研究[J].農業工程學報，2005（2）：49-59.

[3]王夢鶴，劉風之，劉宇峰.魚精核蛋白的開發利用[J].食品科學，1992，10（10）：18-20.

[4]Nakano M，Tobita T，Ando T.Studies on a protamine from fowlsperm：Fractionation and some characterization[J].International journal of peptide and protein research，1973，5（3）：149-159.

[5]王海明，鐘世彬，任玉翠.魚精核蛋白的營養保健功效及產業應用[J].浙江省醫學科學院學報，2000，43（9）：37-38.

[6]傅紅霞，杜榮茂，應鐵進.魚精蛋白的研究現狀及其發展前景[J].食品科技，2003（4）：25-29.

[7]鐘立人，呂民主，張合文.魚精蛋白的抑菌機理[J].水產學報，2001，25（2）：171-174.

[8]何華.國外新開發的幾種天然食品防腐劑[J].四川食品工業科技，1995，14（3）：21-22.

[9]Ueno R，Fujita Y，Yamamoto M.Multiplication inhibitor for Bacilluscereus[J].European PatentApplication，1987，7（6）：49-59.

[10]上官新晨.鯉魚抗菌精蛋白的提取、分離、抗菌特性研究及抗菌機理探討[D].西安：陜西師范大學，2004.

[11]趙逸云，施永壽，胡敏琴.超聲波在有機化學中的研究進展[J].云南大學學報，2003，25（3）：261-265.

[12]唐孝禮，周永紅.魚精DNA的快速無污染提取工藝[J].廣州化工，1996，24（4）：21-22.

[13]Julian K，Chan J.W，Thompson T.A.Quantitativedetermination of pro-tamines by coomassie blue G assay[J].Journal of Food Science and Technology，1995，（226）：193-195.

[14]袁雪，祁力鈞，王虎.溫室搖擺式變量彌霧機噴霧參數響應面法優化[J].農業機械學報，2012，43（4）：45-50．[15]Xue Y，Qi L，Wang H.Spraying parameters optimization of swing，automatic variables and greenhouse mist sprayer with response surface method[J].Transactions of the Chinese Society for AgriculturalMachinery，2012，43（4）：45-50.

[16]張軍偉，傅大放，彭奇均，等.響應面法優化酸水解稻稈制木糖的工藝參數[J].農業工程學報，2009（11）：137-143.

[17]劉天舒，李樹君，景全榮.植物纖維餐具干法熱壓成型工藝響應面法優化[J].農業機械學報，2012，43（9）：116-119.

Optimization of ultrasonic assistant protamine extraction processingparameters using response surface methodology in bovine testes

LIRuo-qi1，HAN Ling1，*，LIRu-ren1，HAN Guang-xing2，ZOU Xiu-feng2，YU Qun-li1，AN Mai-rui1
（1.College of Food Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Shandong Lorain Food Company，Linyi276000，China）

Experiments of extracting protamine with ultrasound assistant processing in bovine testes weredesigned using Box-Behnken response surface methodology. The optimal extraction processing parametersbased on design expert were：5.5% sulfuric acid，190W of ultrasonic and extraction time was 10min. Comparedwith the traditional extraction method，this study raised the protamine productivity up to 33.87%，decreased theextraction time to 10min and increased the content of protamine with up to 6.47μg/g as well. In addition，whilethe optimal precipitating reagent was 95% ethanol，volumeration 1∶3 for testicular precipitation，protamine productyield，water soluble and color were the best.

response surface methodology；ultrasonic assistant；testicular protamine

S872

：B

：1002-0306（2014）16-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.039

2013-11-06 *通訊聯系人

李若綺（1987-），女，碩士研究生，研究方向：畜產品加工。

國家現代農業產業技術體系項目資助（CARS-38）；國家公益性行業（農業）科研專項經費資助（201203009）。