化學發光免疫法檢測食品中恩諾沙星殘留的研究

龔云飛，鄒曉楠，張露露，吳瑩瑩，戴明雁，陳宗倫，張明洲，*

（1.中國計量學院生命科學學院，浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江杭州310018；2.杭州迪恩科技有限公司，浙江杭州310013）

化學發光免疫法檢測食品中恩諾沙星殘留的研究

龔云飛1，鄒曉楠1，張露露1，吳瑩瑩1，戴明雁1，陳宗倫2，張明洲1，*

（1.中國計量學院生命科學學院，浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江杭州310018；2.杭州迪恩科技有限公司，浙江杭州310013）

建立了基于多克隆抗體的化學發光免疫檢測技術，用于測定動物源性食品中恩諾沙星殘留含量。反應條件優化結果為：抗體包被最佳稀釋倍數為64000倍，最佳酶標抗原稀釋倍數為256000倍。結果顯示：該方法的回歸曲線方程為y=-13.898x+110.38（R2=0.9893），檢測線性范圍為3～810pg/mL，IC50為69.63pg/mL，IC10為1.41pg/mL；雞肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜、牛奶空白組織樣品中恩諾沙星的最低檢測限分別為3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL，最低定量限分別為6.13、7.35、3.57、3.73和6.48pg/mL，回收率在88.28%～102.6%，板內和板間的平均變異系數分別為2.61%和4.71%。表明本研究建立的化學發光免疫檢測方法滿足動物源性食品恩諾沙星殘留的檢測要求。

恩諾沙星，化學發光免疫檢測技術，食品安全

抗生素濫用是社會關注的熱點問題，動物飼料中添加或者直接使用抗生素來預防和治療感染，導致了動物源性產品中抗生素的大量殘留。人類食用含有抗生素殘留的食品，可導致抗生素在人體的富集[1]；同時可誘導細菌產生抗藥性，如結核桿菌、痢疾病菌持續危害人類健康其原因就是耐藥性升高[2]，臨床上的病菌感染致死大多也與此有關；抗生素在人體內的代謝還可增加器官負擔，增大對肝臟和腎臟的損害風險[3]，從而增加患惡性疾病的風險[4]。

恩諾沙星屬于喹諾酮類抗生素，廣泛用于預防治療動物疾病[5]。但因其濫用，造成動物制品中恩諾沙星殘留，并給人體健康帶來威脅，如導致過敏反應與其他毒副作用[6-7]，造成頭痛等神經系統不良反應[8]，引起胃部痙攣[9]，造成惡心與嘔吐等消化系統不良反應[10]。因此，世界各國對喹諾酮類抗生素的最高殘留限量（Maximum residue limits，MRLs）均做出了嚴格限制，如日本在2007年調整了水產品恩諾沙星殘留限量標準歐盟，即魚貝類恩諾沙星MRLs不得超過10μg/kg；我國及美國均規定，牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的MRLs分別為100、100、200和300μg/kg[11]，豬、兔與家禽等其他動物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRL分別為100、200和300μg/kg[12]。

化學發光免疫檢測方法結合了高靈敏度的化學發光檢測技術與高特異性的免疫反應[13]，具有檢測線性范圍廣[14]、靈敏度高[15]、檢測時間短[16]等特點，相比高效液相、氣質聯用等檢測方法，化學發光免疫簡化了步驟、減少了操作時間，且不需要專業操作人員，更適用于基層檢測。本文采用實驗室前期制備的抗體，并自主合成酶標抗原，初步建立了直接競爭化學發光免疫分析法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

99%恩諾沙星 中國獸醫藥品監察所；96孔聚苯乙烯酶標板 美國CORNING-COSTAR公司；化學發光顯色劑 湖州英創生物科技有限公司；1-乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS） 分析純，上海生工生物技術有限公司；雞肉、鯽魚、蝦、牛奶與蜂蜜樣品 購自杭州市下沙物美超市和高沙菜場。

KPS-QQ80化學發光分析儀 北京泰格科信生物技術有限公司；HP1100高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Multiskan Ascent酶標儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶標抗原的合成及與抗ENR抗體最佳工作濃度的確定 反應溫度由37℃改為4℃，其他步驟和反應條件參照文獻[17]中的ENR人工抗原合成方法合成ENR酶標抗原。

采用方陣法確定化學發光免疫檢測法的抗ENR抗體與ENR-HRP的最適工作濃度。純化抗體用包被液按1∶160000、1∶320000、1∶640000、1∶1280000進行梯度稀釋，100μL/孔包被于96孔酶標板中，4℃包被24h，洗板拍干；封閉液300μL/孔，37℃條件下封閉2h，洗板拍干；先后添加入梯度濃度的ENR標準品（50μL/孔）和酶標抗原（100μL/孔），25℃反應10min，洗板拍干；加入混合好的化學發光顯色劑（100μL/孔，A液∶B液為1∶1），立刻測定發光值。

1.2.2 ENR化學發光免疫檢測方法（CLIA）基本操作步驟 將包被有E-4抗體的化學發光免疫酶標板于4℃取出，置25℃回溫30min，每孔加入50μL的ENR標準品或者待檢樣品，平行重復實驗3次；加入100μL酶標抗原，25℃反應10min；洗板四次，拍干；將化學發光底物顯色劑加入酶標板，100μL/孔，于讀數儀讀數。

1.2.3 CLIA標準曲線制作與靈敏度分析 加系列濃度的ENR標準品溶液0、3、10、30、90、270、810pg/mL，50μL/孔，其他步驟同1.2.4，重復6次。以ENR標準品濃度的對數為橫坐標，抑制率為縱坐標，制作半對數標準曲線，結合率I（%）=B/B0×100，并分別計算IC50和 IC10。以IC50衡量抗體對恩諾沙星的親和性，以IC10衡量恩諾沙星化學發光免疫的檢測靈敏度。

1.2.4 CLIA樣品前處理方法

1.2.4.1 組織樣品 準確稱取3g勻漿的組織樣品（雞肉、魚肉與蝦肉），加入9mL提取液（0.1mol/L NaOH∶乙腈=1∶8）混勻提取10min，室溫3000×g離心10min；取上清3mL，加入PBS 3mL、二氯甲烷8mL，充分混勻后室溫3000×g離心10min；取下層液體2mL氮氣吹干，加入1mL正己烷復溶后，加入一定體積的PBS振蕩混勻（0.5mL，稀釋倍數為2；1mL，稀釋倍數為4；以此類推），室溫3000×g離心10min后，取下層50μL待測，考察樣品基質的影響并確定最佳稀釋倍數。

1.2.4.2 牛奶樣品 直接檢測樣品；或取適量樣本用PBS按一定比例稀釋（1∶1，則稀釋倍數為2；1∶3，稀釋倍數為4……依此類推），取50μL進行檢測，并分析樣品基質的影響以確定最佳稀釋倍數。

1.2.4.3 蜂蜜樣本 準確稱取1g樣品，加入一定體積的樣品提取液（含30%乙醇的PBS緩沖液），振蕩30min，于3000×g離心10min，取上清50μL進行分析樣品基質的影響并確定最佳稀釋倍數（1mL含30%乙醇的PBS，稀釋倍數為2；3mL，稀釋倍數為4；以此類推）。

1.2.5 精密度測定 測定計算同一包被時間和三個不同包被時間的試劑盒中的板內與板間的變異系數。在同一塊板上重復10次建立標準曲線，測定OD450值并計算變異系數。

1.2.6 最低檢測限與定量限分析 隨機抽取經HPLC分析未檢測出ENR的20份陰性樣品，用本研究建立的化學發光免疫檢測方法檢測，計算最低檢測限（LOD）=陰性樣品ELISA檢測平均值+3倍標準差（SD），最低定量限（LOQ）=陰性樣品ELISA檢測平均值+6倍標準差（SD）。

1.2.7 準確度分析 添加回收率（%）=測定的樣品濃度/理論濃度×100。在雞肉、魚肉、蝦肉、牛奶與蜂蜜陰性樣品中分別添加ENR標準品，使其濃度達到50、100、1000pg/g（pg/mL），每個樣品及添加濃度6次平行實驗，計算平均添加回收率。

2 結果與分析

2.1 酶標抗原合成鑒定及與抗體最適工作濃度的確定

圖1 酶標抗原ENR-HRP紫外掃描圖Fig.1 The UV absorbance spectra of ENR-HRP

酶標抗原紫外掃描結果見圖1。ENR的特征峰為275.5、317、334nm，HRP的特征峰為278、402nm，偶聯產物經透析后其特征峰為278、314、329、402nm。可見，偶聯產物的峰相比反應物的特征峰，既保留了反應物的特征峰也產生了新的特征峰，說明有新的物質產生，即表明酶標抗原合成成功。

表1 E-4抗體和酶標抗原最佳工作濃度的確定Table.1 The optimum concentration of 4 antibody and enzyme labeled antigens

表2 板內與板間變異實驗Table.2 Plate variation with inter-assay and intra-assay

選擇效價最高的E-4抗血清作為測試抗體，采用方陣法實驗，具體結果見表2，當E-4抗體按1∶128000稀釋包被、ENR-HRP按1∶256000稀釋添加時，B/B0值達到最小為43.5%，即抑制率最高。考慮到發光值大小的因素，選定B/B0值為47.9%時包被抗體和酶標抗原稀釋倍數為最佳工作濃度，即包被抗體按1∶64000倍稀釋包被，酶標抗原按1∶256000倍稀釋添加。

2.2 CLIA標準曲線線性范圍及檢測靈敏度

用添加的標準品濃度的對數和相應結合率分別作為橫縱坐標，建立化學發光免疫檢測方法標準曲線（圖2）。當ENR在3～810pg/mL范圍時，線性回歸方程為y=-13.898x+110.38（R2=0.9893）。經計算，半抑制濃度IC50=69.63pg/mL，僅為蔣興東[18]和劉紅[19]建立的恩諾沙星直接競爭ELISA技術所得IC50的1/500，也僅為趙銀麗[20]利用單克隆抗體技術對恩諾沙星進行研究所得IC50的1/15；方法的檢測靈敏度IC10= 1.41pg/mL。

2.3 CLIA變異系數分析

圖2 ENR化學發光免疫檢測標準曲線Fig.2 The standard curve of ENR chemiluminescence immunoassay

變異系數表示一個生產周期生產的試劑盒和不同生產周期生產的試劑盒之間的差異度。表2實驗結果顯示一個生產周期的變異系數值為2.61%，不同生產周期變異系數值為4.71%，說明該種試劑盒在對恩諾沙星進行檢測的過程中偏差不大，符合要求。

2.4 CLIA最低檢測限與定量限分析

隨機抽取本研究研制的ELISA試劑盒檢測HPLC確證為陰性的10份雞肉、10份魚肉、10份蝦肉、10份蜂蜜、10份牛奶，用于最低檢測限和定量限分析。結果表明（表3），雞肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜、牛奶樣品中ENR殘留的最低檢測限分別為3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL或pg/g，最低定量限分別為6.13、7.35、3.57、3.73、6.48pg/mL或pg/g。

表3 雞肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜與牛奶空白組織樣品的最低檢測限與定量限（pg/g，pg/mL）Table.3 The LOD and LOQ in Blank tissue samples（chicken，fish，shrimp，honey，milk，pg/g，pg/mL）

2.5 CLIA樣品基質的影響

添加恩諾沙星在3～810pg/mL濃度內，稀釋檢測物基質溶液16～32倍時，與空白組的檢測結果相比幾乎沒有差別（圖3），為簡化操作步驟，縮短檢測時間，在進行實際樣品檢測時，對基質分別進行16～32倍的稀釋。

2.6 CLIA樣品添加回收實驗

將不同濃度的標準溶液混合到待測樣品中，提取回收后計算添加值。添加恩諾沙星到雞肉、魚、蝦、牛奶、蜂蜜等陰性待檢樣品中，添加濃度為50.0、100、1000pg/g（pg/mL），進行5次平行實驗，得到測得值以及添加回收率，如表4所示。結果表明，添加50.0～1000pg/g（pg/mL）ENR的平均回收率在88.28%～102.6%內，本研究建立的CLIA方法的準確度符合要求，可用于雞肉、魚、蝦、牛奶、蜂蜜等樣品中ENR殘留的快速檢測。

表4 雞肉、魚、蝦、牛奶、蜂蜜等樣品添加回收實驗Table.4 Test of recovery in chicken，shrimp，milk，honey

3 結論與討論

化學發光免疫技術將高特異性的免疫反應與高靈敏度的化學發光技術相結合，相比于酶聯免疫檢測技術縮短了檢測時間，大大降低了檢測限。劉鄧等[21]報道了一種基于魯米諾-辣根過氧化物酶體系的化學發光免疫分析試劑盒，用于檢測食品中的痕量恩諾沙星殘留，得到的IC50為0.106ng/mL，檢測時間約為50min。本研究的IC50明顯要低于以上結果，即靈敏度更高；檢測時間可以控制在30min以內，也優于以上方法。在對雞肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜和牛奶等空白組織樣品中進行恩諾沙星實際樣品檢測實驗中，最低檢測限分別為3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL。恩諾沙星添加回收實驗結果表明，平均回收率在88.28% ～102.6%之間，板內和板間變異系數均低于10%。說明此方法符合現場快速檢測食品中恩諾沙星殘留的要求，值得在實踐中進行推廣。

在進一步的試劑盒開發研究中，將在精密性、特異性、保存期和相關性實驗方面進行系統評價，為該方法的試劑盒商品化應用奠定基礎。

圖3 樣品基質對試劑盒檢測的影響Fig.3 The effect of specimen matrix on ELISA kit

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Study on detecting enrofloxacin residues in food by chemiluminescence immunoassay

GONG Yun-fei1，ZOU Xiao-nan1，ZHANG Lu-lu1，WU Ying-ying1，DAI Ming-yan1，CHEN Zong-lun2，ZHANG Ming-zhou1，*
（1.College of Life Science，China Jiliang University，Zhejiang Provincial Key Laboratory of Bio-metrology，Inspection and Quarantine，Hangzhou 310018，China；2.Hangzhou DNA Sci-tech Co.，Ltd.，Hangzhou 310013，China）

It was developed a chemiluminescence immunoassay（CLIA）method based on polyclonal antibody to detect the enrofloxacin residue in animal food.The CLEIA conditions were optimized.The optimal concentration of coating antibody dilution was 1∶64000 and the enrofloxacin markered enzymes dilution was 1∶256000.The results showed that：with an concentration range from 3 to 810pg/mL，the regression equation was y＝-13.898x+ 110.38（R2＝0.9893）.The 50%inhibition percentage（IC50）and sensitivity（IC10）was 69.63pg/mL and 1.41pg/mL，respectively.Actual sample testing experiment results showed：in chicken，fish，shrimp，honey and milk samples，the detection limits was 3.76，4.59，2.85，2.65 and 4.20pg/mL，respectively.The limit of quantity was 6.13，7.35，3.57，3.73 and 6.48pg/mL，respectively.Recoveries were between 88.28%～102.6%when ENR was spiked to samples at 50～1000pg/g（pg/mL）.The mean intra-assay variability and inter-assay was 2.61%and 4.71%，respectively.The CLIA which we stablished could be used to detect enrofloxacin residues in animal food.

enrofloxacin；chemiluminescence immunoassay；food safety

TS207.3

A

1002-0306（2014）04-0066-05

2013－08－02 *通訊聯系人

龔云飛（1984-），碩士研究生，主要從事食品安全快速檢測技術方面的研究。

浙江省重點科技創新團隊（2010R50028）；浙江省科技成果轉化項目（2011E61018）；浙江省國境安全檢驗檢疫科技創新服務平臺（2006C17014）；浙江省重大科技專項重點項目（2012C12013-3）。