GPC/SEC與激光光散射聯用技術在食物蛋白分析中的應用研究進展

肖 娜，佟 平，熊麗姬，3，陳紅兵，3，高金燕

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330047；3.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047）

GPC/SEC與激光光散射聯用技術在食物蛋白分析中的應用研究進展

肖 娜1，2，佟 平1，熊麗姬1，3，陳紅兵1，3，高金燕2，*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330047；3.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047）

GPC/SEC與（LLS）聯用技術在分離和測定大分子物質的分子量及其分布中發揮著越來越重要的作用。該方法所需樣品少、快速、準確，而且可以同時測定出物質的重均分子量（Mw）、數均分子量（Mn）、Z均分子量（Mz）、Mw/Mn、第二維里系數（A2）以及均方根半徑（Rg）。目前GPC/SEC與激光光散射聯用技術主要用于測定蛋白質的分子量及其分布以及研究蛋白質的聚合狀態，顯示了其與眾不同的性能，而且該技術在食物蛋白中的應用仍值得進一步研究。

GPC/SEC，激光光散射，分子量，食物蛋白

蛋白質是生命的體現者，是細胞的主要成分之一。它是由L型α-氨基酸通過酰胺鍵連接而成的肽鏈，再經過α或β折疊形成具有二級、三級、四級結構的生物大分子物質[1]，同時它也是人類不可缺少的食物主要構成成分之一。當發現一種新的蛋白質或者多肽的時候，獲得它的分子量的大小及其分子量分布，有助于對其其他方面的性質進行進一步的研究[2]。因此，構建出一種新的方法能夠準確、快速地測定出蛋白質的分子量及其分布有著十分重要的意義。

光散射原理最早是在1972年由Wyatt[3]提出的。Wyatt指出通過光散射可以了解到散射粒子的濃度、取向、形狀及大小等情況，并且可測定出物質的分子量。1983年Hjertberg[4]首次提出凝膠滲透色譜Gel Permeation Chromatography，GPC）低角度激光光散射聯用技術可以連續地測定多聚物的絕對分子量。物質先通過凝膠色譜而被洗脫分離，再經過光散射檢測器檢測出物質的分子量，從而達到既可以分離物質的組分，又可以準確地測定出物質的分子量的效果。因此，凝膠滲透色譜/排阻色譜（Size exclusion Chromatography，SEC）與激光光散射（Laser Light Scattering，LLS）聯用技術不僅具備了LLS技術可以測定蛋白質或者蛋白質聚合物的分子量以及蛋白在不同條件下的聚合情況的優點，還結合了GPC/SEC可以分離單一或混合的蛋白質組分，同時也能得知蛋白質純度等情況的優點。而且GPC/SEC-LLS聯用技術不需要標準物質校正凝膠柱系，可以直接測定出物質的分子量及其分布[5]。由于高聚物一般由不同分子量的同系物組成的混合物，因此它的分子量具有一定的分布。此外，該方法快速簡單，測定誤差一般不超過5%[6-7]。基于以上特點，GPC/SEC-LLS聯用技術的應用非常廣泛，例如，在食品[8]、醫學[9]、聚橡膠工業[10]等領域都有相關研究報道。目前多用于測定多糖、蛋白質以及一些化學聚合物的分子量及其分布。

1 GPC/SEC-激光光散射技術原理

當GPC儀與激光光散射儀聯用時，GPC儀可將溶液中的物質按分子量的大小從大到小洗脫出來[11-12]。再經過光散射檢測器進行檢測，當光束照射到高分子聚合物樣品時，密度起伏和溶液濃度不均一可引起光散射現象，除入射光外的各個方向都會產生散射光[13]。各個方向所收集的散射光強度與分子量大小及溶液濃度成正比，與散射光角度的變化、分子的尺寸大小都有關。不同角度的激光光散射儀可以從多個角度對散射光的強度進行檢測，這樣就提高了檢測的靈敏度，減少了誤差[14]。目前用的較多的檢測儀器是多角度激光光散射檢測儀。以18角激光光散射儀為例，收集的散射光的強度來自于各個方向，高分子溶液的激光散射可用以下基本公式表示[15]。

式中，K為與溶劑性質和入射光頻率相關的常數；c為溶液濃度（g/mL）；R（θ）為不同角度去除溶劑影響后的散射光強度；θ為散射光角度；Mw為重均分子量；P（θ）為散射光強度隨角度變化的函數；A2為第二維里系數，A2是溶劑與溶質相互作用的度量，若溶液極稀時可忽略；n0為溶劑的折射率；dn/dc為折光指數增量，指聚合物溶液折光指數相對于溶質的濃度變化；N為阿佛加德羅常數；λ為入射光波長；Rg為高分子均方末端距，即鏈質量中心至各個鏈段距離平方的平均值。R（θ）為儀器測定量，K、c、n0、dn/dc、N、λ、θ均為常數或已知量，其中dn/dc值可通過折光儀測定，或通過折光儀的儀器常數與輸入樣品質量求得[16]。只有Mw、Rg和A2三個高分子鏈的基本參數為未知值，通過多個角度光散射強度的測定，即可推導求出。

隨著條件的優化，陸續出現了GPC/SEC-動態光散射檢測器（DLS）、GPC/SEC-靜態光散射檢測器（SLS）、GPC/SEC-多角度激光光散射檢測器（MALLS）、GPC/SEC-低角度激光光散射檢測器（LLLS）、GPC/ SEC-十八角激光光散射檢測器等。目前常用的主要是前三種。表1對這三種常用檢測器的特性及優劣進行了比較。

2 GPC/SEC-LLS在食物蛋白中的應用

目前測定蛋白質分子量的方法有很多，如滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠滲透色譜法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）以及質譜法等。常用的方法有凝膠滲透色譜法和SDS-PAGE。凝膠滲透色譜法（GPC）需要知道標準樣品的分子量，測定出標準物質的相對分子質量標準曲線才能計算出待測組份的分子量的大小[17]，而標準物質的價格較高，且需要多種聯合使用，使得該方法在測定物質的分子量方面有一定的局限性。SDS-PAGE也是常用的測定蛋白質分子量的大小的方法之一，它還可以用于蛋白質樣品的分離和鑒定，但是該方法測定的蛋白質分子量的偏差較高，約在10%以上[1]，所以它對蛋白質的分子量大小的測定也只是一個估測。而GPC/ SEC-LLS聯用技術，不僅可以快速準確的測定出物質的Mw、Mn、Mw/Mn、Mz、A2以及Rg[18]，而且不需要測定標準物質的標定曲線。現將GPC/SEC-LLS聯用技術在蛋白質中的應用作一概述。

表1 三種常用GPC/SEC-LLS檢測儀的比較*Table.1 The comparison of the three common GPC/SEC-LLS detector

2.1 GPC/SEC-LLS用于分離和測定蛋白質的分子量

Ewa[19]用SEC-LLS技術檢測了14種分子量在12～475ku之間的標準蛋白質的分子量，在實驗中將蛋白質樣品稀釋到0.1mg/mL，進樣量50ug就能滿足儀器要求，還可以連續自動進樣。樣品先進樣到GPC/SEC凝膠柱，再經過示差檢測器測定出dn/dc，最后經過紫外檢測器和光散射檢測器檢測，使用ASTRA軟件對所得的峰進行分析，結果表明，對于分子量大于40ku的蛋白質，其誤差范圍都在5%以內，而且該方法快速、簡單。Yan[20]用陰離子交換柱、SDS-PAGE和GPCMALLS這三種技術聯合使用測定不同的大豆中大豆球蛋白及其亞群的差異。Emmanuelle[21]用GPC-LLS聯用技術測定含有半光氨酸的蛋白質與聚已二酸乙二醇酯發生可逆加成的鏈式反應后所得到的復合物的分子量的大小，從而判斷出二者的結合狀態。此外，該技術不僅用于測定蛋白質的分子量，也常用于測定多糖、多糖衍生物以及一些化學聚合物的分子量及其分布。Raymond[22]用SEC-MALLS技術測定多種不同的溶劑中的醋酸琥珀羥丙甲纖維素（HPMCAS）的分子量及其分布，所測定的分子量的誤差范圍在3%～6%以內。由此可見，無論測定蛋白質和多糖，GPC/SEC-LLS聯用技術都可以簡單而直接地測定出其分子量及其分布，而且該方法快速，準確。所以GPC/SEC-LLS聯用技術對于測定物質的分子量及其分布的優勢很明顯。

2.2 GPC/SEC-LLS用于檢測蛋白質的純度、分析蛋白質聚合物的狀態

Qiang等[23]用SEC-DLS技術研究了擠壓過程中不同的機械剪切力對大豆蛋白聚合物的影響，為大豆在擠壓過程中的聚合情況的變化提供了有力的依據。他們發現大豆在擠壓過程中隨著擠壓剪切力的加大，大豆蛋白的分子量會加大，說明大豆蛋白發生了聚合；然而，當擠壓力度加大到一定程度之后，大豆蛋白的分子量減小，說明大豆蛋白發生了解聚。Yang[24]同時使用GPC-MALLS、zeta-電位法以及等溫滴定量熱法這三種方法研究β-乳球蛋白和甜菜果膠在不同的pH的情況下所形成的絡合物的聚合情況以及結構的變化，并繪制出其結構變化曲線圖。Yasushi[25]通過該方法測定了OmpF孔蛋白分子量及其分布，從而掌握了該蛋白的重疊和重組的情況。Matsumura[26]使用GPC-MALLS聯用技術分別測定了在轉谷氨酰胺酶和茂原鏈輪絲菌的催化作用下α-乳白蛋白交聯形成的聚合物大小的情況。Matsumura指出轉谷氨酰胺酶和茂原鏈輪絲菌都能夠很快的催化α-乳白蛋白交聯，通過測定α-乳白蛋白的分子量及其分布的變化可表征出α-乳白蛋白的單體快速的減少，以及大型聚合物的快速增長；而且茂原鏈輪絲菌所催化的α-乳白蛋白所形成的聚合物粒子的大小及其分子量都要比轉谷氨酰胺酶所催化形成的聚合物粒子及其分子量要大，從而說明茂原鏈輪絲菌的催化作用要比轉谷氨酰胺酶的催化作用要強；然而，在含有Ca2+存在的情況下，Ca2+會抑制α-乳白蛋白的交聯，所形成的聚合物分子量也更小。不僅如此，GPC/SEC-LLS聯用技術還可以從待測蛋白的出峰情況判斷出待測蛋白的純度，純蛋白只會有一個峰，而雜蛋白則會有多個的峰值[27-28]。顯然，使用GPC/SEC-LLS聯用技術不僅可以測定蛋白質的純度還可以判斷出蛋白質在不同條件下的的聚合狀態，從而可以判斷出蛋白質的聚合是受哪些條件的影響。不言而喻，GPC/SECLLS聯用技術是測定蛋白質純度及聚合物的聚合情況的良好工具。

2.3 GPC/SEC-LLS用于研究不同條件對蛋白質性質的影響

Beaulieua等[29]用SEC-MALLS聯用技術測定果膠對加熱之后乳清蛋白的聚合的影響。在沒有鈣的情況下，果膠對乳清蛋白在加熱時所形成的的聚合物的分子量大小及其分布沒有太大影響；而在有鈣的情況下，低甲氧基果膠會導致乳清蛋白加熱時形成的聚合物的分子量變小，峰型也變小，分子量分布變窄，說明低甲氧基果膠會抑制加熱時乳清蛋白的聚合。Mallika[30]應用GPC-DLS聯用技術方法測定了GPC純化的β-乳球蛋白的分子量及其分布，通過測定不同溫度下處理β-乳球蛋白其分子量及其分布的變化，發現25℃時β-乳球蛋白以單體的形式存在；溫度升到30℃的時候，β-乳球蛋白則同時以單體和二聚體的形式存在；溫度再升高到45℃或更高時，β-乳球蛋白則會部分變性。眾所周知，蛋白質具有多種性質和作用，如起泡性、溶解性、具有黏度、凝膠作用、乳化作用等，而且它也很容易受外界條件的影響，如pH、溫度、表面活性劑等，因而，探索某一條件對蛋白質的性質的影響有重要意義。通過GPC/SEC-LLS聯用技術測定蛋白質的分子量及其分布，可以得知某一因素對蛋白質的分子量及其性質的影響有多大[31-32]，從而可以推導出蛋白質的性質與分子量的變化的關系。由此可見，GPC/SEC-LLS聯用技術在食品研究與應用方面具有重要價值。

3 結論與展望

在進行蛋白質的分析中，GPC/SEC-LLS聯用技術能夠高效、快速、準確地測定出大分子物質的分子量及其分布、分散性、聚合情況等。然而，GPC/SECLLS聯用技術只是單一的通過測定物質的分子量及其分布來反映物質的一些特性。如果能將其和其他儀器聯合使用，如和黏度檢測器連用，則不僅可以測定物質的分子量，還可以測定物質的黏度，這樣，就為分子量的大小與黏度的關系提供更加有利的依據。國外已有相關文獻報道了GPC/SEC-LLS聯用技術與黏度檢測器聯用[33-34]，國內則未見有相關的報道。而且目前國內應用GPC/SEC-LLS聯用技術測定食物蛋白質的分子量及其的分子量分布、聚合情況等的相關應用也并不多見。隨著技術的發展及需要，GPC/SEC-LLS聯用技術將會在測定食物蛋白質純度、分子量及其分子量的分布、聚合程度等研究領域中發揮越來越重要的作用。

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Application of GPC/SEC coupled with laser light scattering on food proteins

XIAO Na1，2，TONG Ping1，XIONG Li-ji1，3，CHEN Hong-bing1，3，GAO Jin-yan2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.College of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China；3.Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

GPC/SEC and laser light scattering（LLS）combined technology play a more and more important role in the separation determination of molecular weight and its distribution of macromolecular substances.This method requires less samples，and also was fast and accurate，moreover it could also determine average molecular weight（Mw），the number average molecular weight（Mn），Z-average molecular weight（Mz），Mw/Mn，the second virial coefficient（A2）and root mean square radius（Rg）of the material.GPC/SEC and laser light scattering detection application in protein was summarized.At present，the technology mainly used for the determination of protein molecular weight and its distribution as well as the study of protein aggregation state，and showed its distinctive performance，however，its application in food protein deserved further study.

GPC/SEC；laser light scattering；molecular weight；food proteins

TS203

A

1002-0306（2014）04-0384-04

2013－07－08 *通訊聯系人

肖娜（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2013AA102205）；國家國際科技合作專項（2013DFG31380）；國家自然科學基金（21162019）；江西省科技計劃項目（20122BBG70170-2）。