利用TLC和HPLC結合的方法定性檢測尿液中的雌馬酚

王安易，程永強，歐小群，劉肖南，李 婷，周 韻

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

利用TLC和HPLC結合的方法定性檢測尿液中的雌馬酚

王安易，程永強*，歐小群，劉肖南，李 婷，周 韻

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

雌馬酚是人體腸道細菌分解大豆苷和大豆苷元的最終代謝產物之一，采用薄層色譜法（TLC）分離純化尿液樣品中的雌馬酚后再進行高效液相色譜法（HPLC）定性檢測，可有效減少染料木苷元的干擾，解決了僅依靠HPLC無法實現雌馬酚有效分離的問題。以氯仿-甲醇（24∶1，v/v）作為TLC展開劑，染料木苷元的Rf值為0.29，雌馬酚的Rf值為0.40。本方法具有準確度高，干擾度低等優點，為定性檢測尿液中雌馬酚提供了新的方法。

薄層色譜法，高效液相色譜法，雌馬酚，大豆苷元

大豆異黃酮（soy isoflavones）的代謝產物之一——雌馬酚（equol）與其前體物質大豆苷元（daidzein）相比具有更高的生物活性[1-6]。雌馬酚的生物活性主要為抗氧化和雌激素樣活性，還具有降低心血管疾病發病風險、抗腫瘤、緩解更年期癥狀等功能[7]。因此建立有效的雌馬酚檢測方法，對人群雌馬酚生產者的鑒定，跟蹤、了解人群飲食與疾病關系以及從雌馬酚有效生產者體內分離篩選雌馬酚腸道生產菌等均具有重要意義。目前應用最為普遍最為廣泛的檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）。李巖等[8]建立了檢測人體尿樣中雌馬酚的HPLC檢測方法，王靜等[9]建立了同時檢測人尿中4種異黃酮組分的HPLC檢測方法，王路等[10]建立了同時檢測人尿中6種異黃酮組分的HPLC檢測方法，通過不斷探索和優化HPLC檢測條件，人尿中可有效檢測出的異黃酮種類增多，但是這些檢測方法在應用于雌馬酚檢測時幾乎都存在響應值低，受染料木苷元（genistein）干擾等問題，這給定性檢測雌馬酚以鑒定雌馬酚有效生產者帶來難度。人尿成分復雜，雌馬酚含量較低，易受其他雜質干擾，所以探索濃縮純化尿液中的雌馬酚，消除染料木苷元干擾對雌馬酚的準確定性檢測具有重要意義。

目前用于分離純化異黃酮的方法主要有柱層析法、固相萃取法、薄層色譜法等[11]。潘廖明[12]采用聚酰胺柱層析時，用不同濃度甲醇洗脫，可得到含量分別為90.30%大豆苷和92.0%染料木苷；Mauricio等[13]利用固相萃取法，并使用Strata X填料時，大豆異黃酮中各組分回收率最高，平均回收率為99.37%，可用于大豆異黃酮分離純化；權靜[14]利用薄層色譜法，用氯仿-甲醇-乙酸（93∶7∶0.5，v/v）作為展開劑成功分離了豆粕中的大豆苷元和染料木苷元，但是將這些方法應用于分離純化尿樣中雌馬酚的相關報道較少。本文探索性地進行了HPLC檢測條件優化，在效果不顯著的情況嘗試使用薄層色譜法（TLC）先對尿液樣品中的雌馬酚進行預分離，再進行HPLC定性檢測。將雌馬酚標準品與尿樣同時進行TLC展開后比較Rf值，實驗結果表明可以有效分離尿液中的雌馬酚并排除染料木苷元的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

染料木苷元和雌馬酚標準品 美國Sigma-AldrichCorporation；乙腈、甲醇 色譜純，美國Dikma公司；乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃、碘 分析純，北京化學試劑廠；磷酸氫二鉀 分析純、乙酸 色譜純，汕頭市西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鉀 分析純，廣東光華股份有限公司；硅膠 青島海洋化工廠分廠；GF254硅膠薄層板 德國Merck KGaA；純凈水 杭州娃哈哈集團；蒸餾水 實驗室自制。

M-20A分析型液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器 日本Shimadzu Corporation；反相C18色譜柱 日本Shiseido Corporation，4.6mm×50cm×5μm；GL-20G-Ⅱ離心機 上海安亭科學儀器廠；RE52-99旋蒸儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相檢測條件優化

1.2.1.1 標準溶液配制 標準溶液配制參照文獻[15]中的方法。染料木苷元儲備液（1mg/mL）：染料木苷元固體標準儲存瓶（1mg）中加入少量甲醇（色譜純）將其完全溶解，全部轉移至10mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。

染料木苷元標準液：取染料木苷元儲備液1mL，用甲醇（色譜純）定容于10mL容量瓶中，經0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性針頭過濾器過濾后，即得染料木苷元標準液，于4℃冰箱中保存。

雌馬酚儲備液（1mg/mL）：向雌馬酚固體標準儲存瓶（10mg）中加入少量甲醇（色譜純）將其完全溶解，全部轉移至10mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。

雌馬酚標準液：取雌馬酚儲備液1mL，用甲醇（色譜純）定容于10mL容量瓶中，經0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性針頭過濾器過濾后，即得雌馬酚標準液，于4℃冰箱中保存。

混合標準液（genistein∶equol=20∶8，v/v）：取染料木苷元標準液80μL，雌馬酚標準液200μL，經0.22μm PP型（聚丙烯）Whatman一次性針頭過濾器過濾后，于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 對照組的HPLC檢測條件 對照組采用劉肖南等[15]分析條件。色譜柱為Shiseido C18（4.6mm×50cm× 5μm）；采用二極管陣列檢測器（PDA）；流動相包括水相和有機相，其中水相為0.1%（v/v）乙酸溶液，有機相為乙腈/甲醇（5/2，v/v）；其他檢測參數為：柱溫35℃，檢測波長270nm，進樣量20μ，流速0.8mL/min，靈敏度，0.020AUFs；采用梯度洗脫，詳細洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序Table.1 HPLC elution program

1.2.1.3 改變有機相組成 在其他條件不變的情況下，分別向有機相中添加四氫呋喃（THF）和二氯甲烷（DCM）。有機相組成見表2。

表2 有機相組成Table.2 The composition of organic phase

1.2.2 利用薄層色譜法分離純化尿液中雌馬酚

1.2.2.1 尿樣預處理方法 取10mL尿樣置于50mL離心管中，加入pH=7.0的磷酸鹽緩沖液[16]15mL，乙酸乙酯25mL，渦旋振蕩器振蕩20s，離心6000×g，5min后取上清液在65℃，0.04MPa，75r/min下旋蒸至溶劑全部蒸出。向蒸餾燒瓶加入1～2mL甲醇并渦旋振蕩20s至蒸出物全部溶解后，經0.45μm有機濾膜過濾，于4℃冰箱中保存，保存時間不超過48h。

1.2.2.2 對照樣品的配制 參照1.2.1.1中標準混合液配制。

1.2.2.3 雌馬酚和染料木苷元薄層色譜定性和分離方法的建立 將GF254薄層板（10cm×10cm）在使用前于110℃活化30min。在距底邊邊緣1cm處用微型注射器點樣，標準對照品和預處理好的樣品點樣量各為4μL。將GF254薄層板放入充滿展開劑（見表3）蒸汽的層析缸內，預飽和20min后，上行展開8cm，取出薄層板，揮干后于充滿碘蒸氣的碘缸中顯色。測定各斑點的Rf值并計算分離度R，確定最佳展開劑組成。

其中分離度R[17]的計算公式為：

用冷風吹去碘，收集色譜帶，并用甲醇反復浸泡至被吸附的樣品全部洗脫，將洗脫液氮吹至干，加入100μL甲醇，過0.45μm有機濾膜，于4℃冰箱中保存，以備HPLC檢測。

表3 TLC展開劑的組成Table.3 The composition of developing solvent in TLC analysis

2 結果與分析

2.1 分離條件的選擇

在液相色譜中，當固定相一定時，流動相的種類和配比能嚴重影響分離效果，并且反相高效液相中常使用THF和DCM調節流動相極性以獲得更好的分離效果[18]。所以本文研究了改變流動相組成對雌馬酚和染料木苷元分離效果的影響，結果見表4。當有機相組成為1%THF和5%THF時，雖然雌馬酚和染料木苷元的保留時間和分離度都隨著THF加入量的增加有所提高，分離度從0.88提高到1.41，但是與對照相比，分離度反而減小；繼續增大THF的比例，分離效果并沒有明顯改善，而且基線顯著向上漂移，所以THF并不能有效提高雌馬酚和染料木苷元的分離度，去除染料木苷元的干擾。

當向原有機相中添加不同比例的DCM后，雌馬酚和染料木苷元的保留時間均顯著提前，但是分離度均低于對照組，并且染料木苷元出峰時間早于雌馬酚。這可能是由于二氯甲烷的溶劑強度較乙腈、甲醇強，加入二氯甲烷，降低了整個流動相的極性，使染料木苷元和雌馬酚的保留時間和洗脫順序都發生了變化。

根據上述實驗結果，加入THF或DCM后，雌馬酚和染料木苷元分離效果均沒有明顯改善。因此，嘗試通過改變流動相優化雌馬酚的檢測方法是比較困難的，所以探索其他實現雌馬酚和染料木苷元有效分離的方法是極其必要的，經過研究，本文嘗試使用TLC分離雌馬酚并取得了理想的分離效果。

表4 流動相B組成對雌馬酚和染料木苷元的保留時間和分離度的影響Table.4 Effect of mobile phase composition on the retention time and resolution of equol and genistein

2.2 薄層色譜法展開劑的確定

經過實驗，展開劑比例和層析效果如表5和圖1所示。

表5 不同展開劑的層析效果Table.5 Chromatographic separation of different developing solvents

當分離度＞1.5時相鄰兩斑點可達到基線分離[17]。所以只有當用展開劑Ⅲ時，展開后雌馬酚和染料木苷元的分離度＞1.5，實現了基線分離，并且斑點顯色效果好，說明將氯仿∶甲醇（24∶1，v/v）作為TLC展開劑最為理想（圖1）。

圖1 薄層板色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatogram of standards

2.3 雌馬酚的分離純化效果

尿液樣品薄層色譜圖如圖2所示，從圖2可以看出，雖然由于標準對照品與樣品濃度相差較大而出現輕微的“邊緣效應[17]”，但是根據薄層板右端標準對照品的Rf值，初步推斷尿液樣品薄層色譜圖中a對應色譜帶為雌馬酚，b對應色譜帶可能為染料木苷元，將a、b對應的色譜帶進行洗脫和濃縮后進行HPLC檢測驗證。

圖2 尿液樣品薄層板色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatogram of urine sample

2.4 HPLC分析

利用PDA檢測器對待測物進行全波長掃描，得到待測物的紫外光譜圖，可以輔助HPLC檢測結果對物質進行準確定性。因此為了更準確地判斷TLC分離效果，在本實驗中除了用保留時間對待測物進行歸屬，還用PDA檢測器采集待測物的紫外光譜圖，與標準品的光譜圖進行對照定性。

圖3（A1）和圖4（A2）分別為雌馬酚和染料木苷元混標的HPLC檢測色譜圖和PDA檢測光譜圖，其中雌馬酚的保留時間為40.112min，具有224nm和281nm兩個特征吸收波長；染料木苷元的保留時間為40.853min，特征吸收波長為259nm。

當未使用TLC處理尿樣時，尿液樣品的HPLC檢測圖如圖3（B1）所示，在40.362min時出現嚴重的拖尾峰，說明流動相洗脫效果不佳；使用PDA檢測器采集待測物的紫外光譜圖并與標準品的光譜圖（A2）進行對照發現沒有與雌馬酚或染料木苷元最大吸收波長和峰型一致的特征吸收峰，說明尿液樣品中的雌馬酚和染料木苷元未實現有效分離。

將尿液樣品經過TLC分離后得到的色譜帶a收集物進行HPLC和PDA檢測，采集到色譜圖（C1）和紫外吸收光譜圖（C2），將結果與標準品對比后得到色譜圖保留時間基本一致，且具有與雌馬酚標準品相同的特征吸收峰和峰型，因此可以證實分離純化得到的色譜帶a收集物即為雌馬酚。同理將色譜帶b收集物進行檢測，得到色譜圖（D1）和紫外吸收圖譜（D2），與標準品進行比對發現色譜帶b收集物與染料木苷元標準品的保留時間基本一致，且特征吸收峰和峰型相同，因此可以證實分離純化得到的色譜帶b收集物即為染料木苷元。

圖3 標準品、尿液樣品和TLC分離色譜帶的色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatograms of standard，urine sample and chromatographic band

圖4 標準品和TLC分離色譜帶紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectrum of standard，urine sample and chromatographic band

3 結論與討論

利用氯仿∶甲醇（24∶1，v/v）作為TLC展開劑，雌馬酚和染料木苷元的分離度（R）為2.4，達到基線分離；后將色譜帶a和色譜帶b收集物分別進行HPLC和PDA檢測后發現，兩者分別與雌馬酚和染料木苷元的保留時間基本一致，且具有相同的峰型和最大吸收波長，說明通過TLC可以將尿樣中雌馬酚和染料木苷元基線分離，消除染料木苷元的干擾，實現了雌馬酚的有效定性檢測，解決了在雌馬酚檢測過程中由于雜質干擾造成的定性困難的問題，這對準確判定雌馬酚生產者有重要意義。

TLC是用于異黃酮分離純化處理的常用方法，權靜等[13]利用氯仿∶甲醇∶乙酸（93∶7∶0.5，v/v/v）作為TLC展開劑成功分離大豆苷元與染料木苷元，說明以氯仿和甲醇為主要成分的展開劑對于大豆異黃酮及其分解產物有較好的分離作用。而Shin-ichiro Yokoyama等[19]利用甲苯∶丙酮（2∶1，v/v）作為TLC展開劑對尿樣中的雌馬酚進行分離濃縮后進行HPLC檢測，并根據檢測結果判斷受試者是否為雌馬酚生產者。而本文在TLC與HPLC相結合的基礎上還利用PDA檢測器進行輔助定性，使判定結果更加準確可靠。本方法不僅可以用于檢測尿液中的雌馬酚，還可以用于對菌種發酵液中的雌馬酚進行定性檢測。

本方法雖然可以對雌馬酚進行定性檢測，但是還無法實現對雌馬酚的準確定量，這主要是由于在色譜帶收集過程中存在損失，所以如何利用此方法實現尿液中雌馬酚的精確定量檢測還有待于在今后實驗中繼續探索。

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Qualitative detection of urinary equol by thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography

WANG An-yi，CHENG Yong-qiang*，OU Xiao-qun，LIU Xiao-nan，LI Ting，ZHOU Yun
（College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Equol was one of metabolites of daidzin and daidzein by intestinal bacteria decomposition.The disturbance from genistein to equol was reduced by using thin-layer chromatography（TLC）followed by high performance liquid chromatography（HPLC）.This method solved the problem that equol could hardly be separated effectively by HPLC.Developed in a TLC solvent system of chloroform∶methanol（24∶1），equol and genistein were observed on Rfvalue of 0.40 and 0.29，respectively.This new qualitative method for the analysis of urinary equol was more accurate and less disturbed than using only HPLC analysis.

thin-layer chromatography（TLC）；high performance liquid chromatography（HPLC）；equol；genistein

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0079-05

2013－07－17 *通訊聯系人

王安易（1992－），女，在讀大學本科，研究方向：食品科學。

國家自然科學基金項目（31171739）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03）；北京市大學生創新創業訓練項目；教育部新世紀優秀人才支持計劃（NETC-10-0776）項目；北京市優秀人才培養資助計劃（2011D009007000001）。