脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對花生蛋白結構的影響

廖 鈺，葉 林，趙謀明，孫為正

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641）

脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對花生蛋白結構的影響

廖 鈺，葉 林，趙謀明，孫為正*

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641）

利用脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的反應體系對花生分離蛋白進行不同程度的氧化修飾，通過研究不同亞油酸含量下花生分離蛋白的羰基值、游離巰基含量、粒徑分布、表面疏水性、溶解度以及熒光光譜的變化規律，從而探討氧化對花生分離蛋白結構的影響。結果表明：隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的羰基值先增加后略微下降，游離巰基含量下降，表面疏水性先增加后減小，說明氧化后花生分離蛋白的結構已經發生了改變。其粒徑分布和溶解度的變化規律可以表征花生分離蛋白氧化聚集體的狀態，同時其熒光峰位λmax的變化規律可反映花生分離蛋白三級結構的具體變化，表明脂肪氧合酶催化亞油酸氧化可以誘導花生分離蛋白分子發生聚集，使其結構發生顯著變化。

花生分離蛋白，脂肪氧合酶，氧化，結構

脂肪氧合酶（LOX）是廣泛存在于動植物體內的一種酶，尤其是在豆科植物中含量豐富[1]。它具有直接催化含順，順-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸的能力，通過分子內加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物[2]。這些氫過氧化物及其次生產物可與蛋白質和氨基酸等發生反應引起蛋白質氧化[3]，是影響產品品質的重要因素之一。

花生蛋白因其豐富的營養價值廣泛應用于食品工業。在加工和使用過程中，花生蛋白的功能性質受到許多因素的影響，蛋白質氧化是其中一個重要的因素。氧化修飾對蛋白質結構造成的影響主要包括蛋白質側鏈氨基酸的改變、蛋白質的交聯與肽鏈斷裂、蛋白質分子結構的展開以及構象的變化[4]。這些結構變化最終導致蛋白質的營養價值下降、生物活性降低以及功能性質變化。近年來，越來越多的學者開始關注食品中脂質氧化與蛋白質氧化之間的聯系。目前國內外的相關課題主要圍繞動物蛋白展開研究，而針對花生蛋白氧化的研究還未見報道。本文利用脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的反應體系對花生分離蛋白進行不同程度的氧化修飾，通過針對氧化后花生分離蛋白的羰基值、游離巰基含量、粒徑分布、表面疏水性、溶解度以及內源熒光光譜的分析，以期對脂肪氧合酶催化脂質過氧化引起的花生蛋白氧化及其結構變化提供理論依據，為抑制蛋白質氧化奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂花生粕 山東天申生物蛋白有限公司產品；大豆 市售；脂肪氧合酶（710U/mg） 自制；Tween 20 化學純；亞油酸 色譜純；其他試劑 均為分析純。

pHS-25數顯pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；CS150NX超速離心機 日本HITACHI公司；SP-721可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；Nano-ZS納米粒度分布儀 英國Malvern公司；F700熒光分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生分離蛋白的制備 參考劉巖等[5]的方法，脫脂花生粕與水1∶10混合，以2mol/L NaOH調節體系pH至8.0，浸提1h后常溫3000×g離心15min，所得上清液以2mol/L HCl調節pH至4.5，離心后沉淀再用2mol/L NaOH調節pH至7.0，冷凍干燥，制得花生分離蛋白。

1.2.2 脂肪氧合酶的制備以及酶活的測定 制備方法[6]：大豆→粉碎→過40目篩→正己烷浸提→干燥→脫脂豆粕+水（料液比1∶11）攪拌→離心→上清液冷凍干燥→自制脂肪氧合酶。

酶活的測定參考黃友如等[7]的方法。取0.3mL 4mg/mL的酶液，加2mL底物乳狀液（2.24×10-3mol/L亞油酸分散于含0.5μL/mL Tween20的0.1mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液）混勻后30℃水浴3min，加5mL無水乙醇終止反應，再加5mL蒸餾水混勻，于234nm下測定反應的吸光度。以1min內2.3mL反應體系在234nm的吸光度增加0.001作為一個酶活單位（U）。

1.2.3 氧化花生分離蛋白的制備 底物亞油酸溶液的配制[7]：取1.5g亞油酸于50mL容量瓶中，依次加入1mL 5mmol/L NaOH溶液，10mL 0.2mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液以及2滴Tween20，搖勻后用0.2mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液定容至50mL。酶液的配制：取1.02g自制脂肪氧合酶溶于51mL pH9.0的磷酸鹽緩沖液。

用去離子水配制5%的花生分離蛋白溶液，以2mol/L NaOH調節體系pH至9.0。分別稱取100g溶液于5個錐形瓶中，用數字1～5表示。在每個瓶中均加入10mL酶液，并分別加入0、3、4.5、7.5、9mL底物亞油酸溶液，振蕩搖勻，于4℃冰箱中培養6h后取出，以2mol/L HCl調節pH至4.5，離心（5000×g，30min），水洗沉淀并用2mol/L NaOH調節pH至7.0，冷凍干燥，制得氧化花生分離蛋白。

1.2.4 羰基值的測定 蛋白質羰基值的測定參考Levine等[8]的方法，并稍作調整。用去離子水配制5mg/mL的蛋白質溶液，充分攪拌后離心（10000×g，20min），用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質含量。取1mL上清液與3mL含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，常溫下避光放置1h，以1mL上清液與3mL 2mol/L HCl混合作空白對照，再加入1mL 50%的三氯乙酸，振蕩后靜置20min再離心（10000×g，20min），用乙醇-乙酸乙酯混合溶液（1∶1，v/v）洗滌沉淀3次。最后將沉淀溶解于3mL 6mol/L鹽酸胍溶液中，37℃水浴20min，待沉淀充分溶解后在367nm處比色，以22000M-1cm-1消光系數計算每mg蛋白質羰基衍生物的摩爾數。

1.2.5 游離巰基含量的測定 游離巰基含量的測定參考Beveridge[9]改進后的方法，并稍作調整。稱取15mg樣品分散于5mL Tris-Gly-8M Urea緩沖液中，漩渦振蕩后加入50μL 4mg/mL DTNB溶液，迅速混合后于室溫下保溫1h，以緩沖液代替樣品作空白對照，在412nm處比色，以13600M-1cm-1消光系數計算每mg蛋白質游離巰基的摩爾數。

1.2.6 粒徑的測定 采用Nano-ZS馬爾文納米粒度分布儀測定樣品的粒徑分布。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制0.02%的蛋白質溶液，過0.45μm的水膜進行測量。

1.2.7 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法測定蛋白質表面疏水性[10]。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制不同濃度的蛋白質溶液（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%）和8mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）溶液。取20μL ANS溶液加到5mL蛋白質溶液中，混合均勻，迅速測定混合液的熒光強度，激發波長和吸收波長分別是390nm和470nm。以蛋白質濃度對熒光強度作圖，采用最小二乘法進行曲線擬合，直線的斜率即為蛋白質的H0。

1.2.8 內源熒光光譜的測定 采用熒光分光光度計測定樣品的內源熒光光譜[11]。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制0.2mg/mL蛋白質溶液，過0.45μm的水膜進行測量。熒光發散光譜分析以蛋白質內部熒光基團為探針，熒光光譜在290nm激發，掃描波長為300～400nm，激發和發射狹縫寬均為5nm，電壓為500mV。

1.2.9 溶解度的測定 用去離子水配制5mg/mL的樣品溶液，充分攪拌后離心（10000×g，20min），上清液中的蛋白質采用雙縮脲法[12]測定，利用牛血清白蛋白（BSA）做標準曲線，測定540nm處的吸光值。根據樣品中蛋白質含量和溶液中蛋白質含量比值計算溶解度。

1.2.10 數據統計與分析 數據均為3次測定的平均值，使用Excel 2007作圖，并用SPSS 17.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 氧化對花生分離蛋白羰基值的影響

蛋白質羰基值是廣泛用于評價蛋白質氧化程度的指標之一。Zamora等[13]的研究發現脂質氧化產生的氫過氧化物及其次生產物可與蛋白質的氨基酸殘基反應，導致蛋白質羰基含量的增加。由圖1可見，隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的羰基值從3.83nmol/mg增加到5.8nmol/mg（p＜0.05），隨后略微下降到5.35nmol/mg（p＜0.05）。羰基值的升高可能是因為脂肪氧合酶催化亞油酸氧化產生的脂質自由基可以誘導蛋白質自由基的生成，在蛋白質的α碳原子或其側鏈氨基酸殘基的其他碳原子上形成蛋白質類過氧化物，從而引起蛋白質羰基含量的增加[7]；而羰基值的下降可能是因為5號樣品的氧化程度較深，生成較多的不可溶性聚集體，使部分氧化反應所形成的羰基因沉淀分離而未被檢測出來。該結果表明氧化使花生分離蛋白的氨基酸組成發生了變化，進而對花生分離蛋白的構象造成一定的影響。

2.2 氧化對花生分離蛋白游離巰基含量的影響

圖1 不同亞油酸含量對花生分離蛋白羰基值的影響Fig.1 Effect of different contents of linoleic acid on thecarbonyl content of PPI

巰基和二硫鍵是穩定蛋白質分子構象的重要的化學鍵[14]，對蛋白質的功能特性（如凝膠、起泡和乳化性能等）起著非常重要的決定作用。氧化可以改變半胱氨酸的氧化還原狀態以及巰基/二硫鍵交互反應的平衡常數，進而改變蛋白質分子中巰基和二硫鍵的含量和分布[15]。如圖2所示，隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的游離巰基含量不斷減少，從5.16nmol/mg下降到4.25nmol/mg（p＜0.05）。蛋白質的變性、二硫鍵的生成均可導致游離巰基含量的下降。崔旭海等[16]的研究表明，巰基的降低可能是由于在多肽分子之間或多肽內部形成二硫鍵，或者是進一步氧化成磺酸類或其他氧化產物，從而導致蛋白結構中巰基含量的下降。黃友如等[7]的研究表明，在添加亞油酸和脂肪氧合酶的大豆蛋白模擬體系中，巰基可能被氧化成非二硫鍵形式的基團，從而造成蛋白質中半胱氨酸的損失。

圖2 不同亞油酸含量對花生分離蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effect of different contents of linoleic acid on the free sulphydryl content of PPI

2.3 氧化對花生分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以反映蛋白質表面疏水性基團的數量，它決定了蛋白質分子間相互作用的能力，從而影響蛋白質的功能特性[17]。如圖3所示，花生分離蛋白的表面疏水性隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加先從123.28升高至185.93（p＜0.05），再下降到99.35（p＜0.05）。這可能是由于花生分離蛋白的結構隨著氧化程度的增加逐漸展開，分子內部的疏水性基團逐漸暴露，從而導致其表面疏水性的增加；當氧化程度進一步加深時，展開的蛋白質分子又在疏水作用和二硫鍵的作用下重新聚集，使花生分離蛋白表面疏水性降低。該結果表明氧化改變了花生分離蛋白的分子構象。

2.4 氧化對花生分離蛋白熒光光譜的影響

圖3 不同亞油酸含量對花生分離蛋白表面疏水性指數的影響Fig.3 Effect of different contents of linoleic acid on the surface hydrophobicity of PPI

圖4 不同亞油酸含量對花生分離蛋白內源熒光掃描時的熒光峰位的影響Fig.4 Effect of different contents of linoleic acid on the λmaxof PPI monitored by intrinsic fluorescence spectra

花生分離蛋白在290nm處激發所得到的主要是色氨酸為發射基團的熒光光譜，可反映色氨酸殘基的變化程度及其微環境的變化情況[18]。如圖4所示，隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的熒光峰位λmax先從328.9nm逐漸增加到330.6nm（p＜0.05），再逐漸減小到328.7nm（p＜0.05）。λmax的紅移表明氧化使花生分離蛋白的結構展開，分子內部的色氨酸殘基逐漸暴露，而λmax的藍移則表明進一步的氧化使花生分離蛋白重新發生聚集，分子中的色氨酸殘基暴露程度降低，被轉移到內部非極性環境中。其熒光峰位λmax的分析結果與表面疏水性的分析結果相一致，進一步表明氧化會導致花生分離蛋白的聚集和結構的變化。

2.5 氧化對花生分離蛋白聚集程度的影響

激光納米粒度測定儀只能對樣品的可溶性部分進行測量，其測量結果一定程度上可以反映花生分離蛋白的聚集程度。不同氧化條件下花生分離蛋白的粒徑分布如圖5所示。與1號樣品相比，2號樣品的粒徑分布明顯向粒度小的方向偏移。隨著反應體系中底物亞油酸含量的進一步增加，3號和4號樣品的粒徑分布相似，均向粒度大的方向偏移，并十分接近1號樣品的粒徑分布。而5號樣品的粒徑分布又略微向粒度小的方向偏移。上述現象可能是由于氧化引起了花生分離蛋白的分子結構展開，導致平均粒徑變小；再通過暴露的疏水基團的相互作用生成可溶性聚集體，平均粒徑變大；并隨著進一步的氧化最終生成不可溶性聚集體而使相應的可溶性部分的平均粒徑有所降低。

圖5 不同亞油酸含量對花生分離蛋白粒徑分布的影響Fig.5 Effect of different contents of linoleic acid on the particle size distribution of PPI

溶解性是蛋白質其他功能特性的基礎，溶解度也可以用來表征花生分離蛋白的聚集程度。本文參照牛血清白蛋白標準曲線（圖7）計算各樣品的溶解度值。如圖6所示，2號樣品的溶解度略低于1號樣品的溶解度，二者相差1.14%（p＜0.05）。但隨著反應體系中底物亞油酸含量的進一步增加，3號樣品的溶解度達到最大值77.72%（p＜0.05），隨后溶解度逐漸下降到71.08%（p＜0.05）。該測定結果與粒徑分布的分析結果相結合，進一步說明氧化會誘導花生分離蛋白聚集，并隨著氧化程度的加深，可溶性聚集體逐漸轉變為不可溶性聚集體。

圖6 不同亞油酸含量對花生分離蛋白溶解度的影響Fig.6 Effect of different contents of linoleic acid on the solubility of PPI

圖7 牛血清白蛋白標準曲線Fig.7 The standard curve of bovine serum albumin

3 結論

脂肪氧合酶催化亞油酸氧化會對花生分離蛋白的結構產生明顯的影響。由實驗結果可知，花生分離蛋白的氧化伴隨著羰基值的增加和游離巰基含量的下降。隨著反應體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的表面疏水性和內源熒光光譜的熒光峰位λmax均呈現先增加后減小的趨勢，表明花生分離蛋白三級結構的變化規律。此外，花生分離蛋白的粒徑分布和溶解度的變化規律表明氧化可誘導花生分離蛋白聚集，并隨著氧化程度的加深，可溶性聚集體逐漸轉變為不可溶性聚集體。

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Effect of oxidation on the structure of peanut protein isolate induced by lipoxygenase-catalyzed linoleic acid

LIAO Yu，YE Lin，ZHAO Mou-ming，SUN Wei-zheng*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China）

Peanut protein isolate（PPI）was oxidized by free radicals and reactive oxidation products released by lipoxygenase-catalyzed linoleic acid.Carbonyl content，free sulphydryl content，particle size distribution，surface hydrophobicity，solubility and intrinsic fluorescence were determined to evaluate effect of oxidation on the structure of PPI.Results showed that，with increasing content of linoleic acid，the carbonyl content first increased then slightly decreased，the free sulfhydryl content decreased，and the surface hydrophobicity first increased then decreased，which reflected change in the structure of PPI after oxidation.Changes in the particle size distribution and solubility indicated the condition of PPI aggregates，and difference in the maximum emission wavelength indicated change of the tertiary conformation of PPI.All these showed that lipid oxidation could induce protein aggregation，leading to significant change in the structure of PPI.

peanut protein isolate；lipoxygenase；oxidation；structure

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0118-05

2013－07－17 *通訊聯系人

廖鈺（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品工程。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102201）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD37B08）；國家自然科學基金面上項目（31171783）。