燙漂工藝對西蘭花多酚氧化酶的影響

張 帝，湯文晶，陳興京，張慶慶，*，湯義明，錢起光

（1.安徽工程大學，生物與化學工程學院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖新欣食品實業(yè)有限公司，安徽蕪湖241000）

燙漂工藝對西蘭花多酚氧化酶的影響

張 帝1，湯文晶1，陳興京1，張慶慶1，*，湯義明2，錢起光2

（1.安徽工程大學，生物與化學工程學院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖新欣食品實業(yè)有限公司，安徽蕪湖241000）

以鄰苯二酚為底物，通過分光光度計法，對西蘭花中的多酚氧化酶（PPO）進行了研究，同時建立了西蘭花PPO活性測定方法。結(jié)果表明，西蘭花PPO活性的最適測定條件為：檢測波長為415nm，反應(yīng)溫度為35℃，pH為7.2。同時對燙漂西蘭花的工藝進行了研究，確定了最佳燙漂條件為：燙漂溫度為95℃，燙漂時間為90s，燙漂后立刻用冰水冷卻并凍藏，在此條件下，有效鈍化西蘭花PPO活性的同時還能有效的降低顏色的損失，具有良好的保色作用。

西蘭花，多酚氧化酶，燙漂，鈍化

西蘭花為十字花科蕓薹屬，一年生宿根草本植物。它是一種營養(yǎng)成分齊全的高檔蔬菜，并具有增強肝臟的解毒能力、提高免疫力和防癌的優(yōu)點[1]。西蘭花中含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，在加工過程中，當組織完整性被破壞或膜受到傷害后，潛在的多酚氧化酶（PPO）大量被激活，催化原料中的多酚，使其氧化為醌，醌再發(fā)生聚合反應(yīng)生成黑色物質(zhì)，植物組織的褐變隨之發(fā)生[2-3]，這是導(dǎo)致西蘭花發(fā)生褐變的主要原因。燙漂是果蔬速凍加工前預(yù)處理的關(guān)鍵工藝，是為了破壞果蔬的氧化酶系統(tǒng)，能夠有效地鈍化多酚氧化酶的活性，防止因酶的氧化而產(chǎn)生褐變[4]，使制品保持美觀的色澤。本研究對西蘭花PPO的測定條件、燙漂過程中PPO的鈍化及護色作用進行了相關(guān)實驗，確定了西蘭花PPO反應(yīng)體系的最大吸收波長，得到測定的反應(yīng)條件，并確定了最佳燙漂工藝，探討了燙漂對PPO的鈍化與西蘭花保鮮保色之間的關(guān)系，為蔬菜加工提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花 蕪湖新欣食品實業(yè)有限公司；其余試劑 均為分析純。

DS-200型高速組織搗碎機 江陰市保利科研器械有限公司；YP1002型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HS-J2型高速臺式冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；L5型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；pHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPO粗酶液的提取及最大吸收波長的測定 取洗凈的西蘭花花冠部分按料液比1∶5（w/v）加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=7.2）于組織搗碎勻漿機中，低溫勻漿2min，轉(zhuǎn)移至離心管中，于10000r/min、4℃離心15min，上清液即為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆肹5]。取PPO粗酶液1mL，用磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH= 7.2）稀釋4倍后，在波長350～800nm范圍內(nèi)進行波長掃描。

1.2.2 反應(yīng)體系最大吸收波長和PPO相對酶活的測定 取磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=7.2）2mL，0.2mol/L鄰苯二酚溶液1mL、PPO粗酶液1mL至比色皿中，迅速搖勻，35℃下靜置反應(yīng)5min。以磷酸鹽緩沖液為參比，在波長350～800nm范圍內(nèi)進行波長掃描，確定反應(yīng)體系的最大吸收波長。以在PPO最大吸收波長處測定的吸光值表示PPO的相對酶活（即設(shè)同組實驗中吸光值最大的相對酶活為100%）。

1.2.3 溫度對PPO酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，其余條件不變，分別在溫度為20、25、30、35、40、45、50℃條件下進行實驗，在415nm下測定PPO粗酶液OD值，測得不同溫度條件下的相對酶活，確定最佳酶促反應(yīng)溫度。

1.2.4 pH對PPO酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，選定溫度為35℃，其余條件不變，調(diào)整磷酸緩沖液的pH分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6進行實驗，在415nm下測定PPO粗酶液OD值，測得不同pH條件下的相對酶活，確定最佳酶促反應(yīng)pH。

1.2.5 底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，選定溫度為35℃，pH7.2，其余條件不變。分別加入濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mol/L的鄰苯二酚溶液1mL作為底物進行實驗，在415nm下測定PPO粗酶液OD值，測得不同底物濃度條件下的相對酶活，確定酶促反應(yīng)的最佳底物濃度。

1.2.6 最佳燙漂溫度的選擇 燙漂溫度對PPO活性的影響 分別稱取適量的西蘭花花冠于為80、85、90、95、100℃的熱水中燙漂，時間分別為30、60、90、120、150s。處理至規(guī)定時間后，迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干后按照1.2.1的方法處理獲得PPO粗酶液并分為兩部分，一部分用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，在678nm處測定其OD678值，以O(shè)D678值作為西蘭花的保色指標。另一部分在PPO最佳反應(yīng)條件下測定PPO殘存酶活。

1.2.7 最佳燙漂時間的選擇 分別稱取適量西蘭花花冠95℃中水燙漂30、60、90、120、150、180、210s，處理至規(guī)定時間后迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干瀝干后按照1.2.1的方法處理獲得PPO粗酶液并分為兩部分，一部分用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，在678nm處測定其OD678值，另一部分按照1.2.1的方法處理，在PPO最佳反應(yīng)條件下測定PPO殘存酶活。

1.2.8 燙漂后冷卻方法的選擇 稱取適量西蘭花花冠若干份，在溫度為95℃的熱水中分別燙漂30、60、90、120、150s。處理至規(guī)定時間后，每種試樣分兩部分處理：一部分處理完畢后用風扇進行吹風冷卻至室溫并瀝干，按照1.2.1的方法處理，測定PPO殘存酶活；另一部分用迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干后再用聚乙烯薄膜包裹放入冰箱冷凍室中凍藏，取部分凍藏的試樣按照1.2.1的方法處理，測定PPO殘存酶活，比較兩部分所測酶活的差異[6]（燙漂過程的PPO相對酶活均以相同批次的未經(jīng)處理的西蘭花花冠所提取的PPO粗酶液的活性作為最大值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

PPO粗酶液和體系反應(yīng)產(chǎn)物在可見光350～800nm之間的波長掃描圖如圖l所示。

圖1 波長掃描譜圖Fig.1 Wavelength scanning spectra

由圖1可看出，PPO粗酶液在678nm處有最大吸收峰，根據(jù)文獻報道[7-8]，葉綠素的吸收波長在600～700nm之間，以678nm作為葉綠素的測定波長，其OD值可作為西蘭花燙漂后保色的指標，波長掃描前期沒有波峰出現(xiàn)，排除了其他物質(zhì)對PPO活性測定的影響。而PPO反應(yīng)體系產(chǎn)物在415nm具有最大吸收峰，根據(jù)文獻報道[9-12]，PPO反應(yīng)的最大吸收波長在405～420nm之間，以415nm作為PPO活性的最大測定波長。體系產(chǎn)物在415nm后掃描曲線較為平滑，且在600～700nm之間無吸收峰，說明底物鄰苯二酚對葉綠素有破壞作用且在實驗條件下破壞的較為徹底。

圖2 溫度對PPO活性的影響Fig.2 Effect of temperature on PPO activity

2.2 PPO活性最佳反應(yīng)條件的確定

2.2.1 PPO反應(yīng)最適溫度的確定 溫度對西蘭花PPO活性的影響見圖2，由圖2可知，西蘭花PPO反應(yīng)最適溫度為35℃。根據(jù)文獻報道，不同植物的PPO最適溫度不同，可能是因為不同植物的PPO的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的差異所導(dǎo)致[13]，也可能是由于不同植物體內(nèi)和PPO發(fā)生協(xié)同作用的酶類的不同所導(dǎo)致。如圖2所示，PPO活性先隨溫度升高而上升，在35℃時達到最大值。由于隨著溫度繼續(xù)升高，分子的熱運動加劇，PPO空間結(jié)構(gòu)改變，活性中心三維結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致PPO活力降低[13]，這與酶的特性相一致。在20～50℃時，西蘭花PPO相對較穩(wěn)定，所以在燙漂過程中可通過高溫處理，鈍化PPO的活性[14]，在貯藏過程中，盡量選擇低溫以降低PPO的活性。

2.2.2 PPO反應(yīng)最適pH的確定 由圖3可知，采用鄰苯二酚為底物時pH對西蘭花PPO活力的影響，西蘭花PPO反應(yīng)最適pH為7.2。這也與文獻報道多數(shù)水果中的PPO在接近中性pH時顯示最大的活力相一致。在酸性和堿性時，酶活力急劇下降，當pH＜6.2或pH＞7.8時，PPO相對酶活顯著下降。原因是PPO作為一種含銅的蛋白質(zhì)，當pH較低時，輔基銅將以Cu2+的形式解離出來；當pH較高時，輔基銅則會解離生成Cu（OH）2[15]，兩種情況均可使PPO的活性顯著降低。在果蔬加工貯藏中，通過調(diào)節(jié)pH可有效的抑制PPO活力。

圖3pH對PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

2.2.4 PPO反應(yīng)最適底物濃度的確定 圖4為底物濃度對PPO活性的影響，在供試反應(yīng)體系中，當鄰苯二酚濃度為0.05～0.25mol/L時，酶活性呈上升增長趨勢，酶活與濃度成正比例的關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。當濃度為0.25～0.4mo1/L時，酶活性的變化趨于平緩，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。說明該酶促反應(yīng)適宜的鄰苯二酚用量為0.25mol/L，當?shù)孜餄舛冗_到這一適宜值時，再增加底物濃度對酶的活性作用不大。這是因為當?shù)孜餄舛容^低時，有一些酶的活性部位未能與底物結(jié)合，隨著底物濃度的增加，更多的酶活性部位與底物相結(jié)合，使酶促反應(yīng)充分進行，在達到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時，酶活性部位被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達到最大值[16]。

圖4 底物濃度對PPO活性的影響Fig.4 Effect of the substrate concentration on PPO activity

2.3 燙漂工藝的確定

2.3.1 最佳燙漂溫度的確定 圖5為西蘭花在不同溫度燙漂不同時間對PPO活性的影響，由圖5可知，85℃燙漂150s后，PPO相對酶活仍有39%，而100℃處理30s后，PPO相對酶活僅有33%；80～95℃燙漂150s后，PPO相對酶活在39%～27%之間，而100℃處理150s后，PPO相對酶活僅有10%，說明燙漂溫度越高，燙漂時間越長，PPO相對酶活越低，這與酶在高溫下變性這一特點相符合。其中100℃鈍化酶活的能力最為顯著。但是在蔬菜燙漂加工時除了要鈍化PPO活性，還要考慮蔬菜的保色和保鮮，不同燙漂溫度對西蘭花顏色的影響見圖6。

圖5 不同溫度燙漂不同時間對PPO活性的影響Fig.5 Effect of the blanching different temperature with different time on PPO activity

圖6為西蘭花燙漂90s后在678nm處測得的OD678值。由圖6可看出，燙漂溫度為80～95℃，OD678值略有下降但幅度很小，但燙漂溫度為100℃燙漂90s后，OD678值驟降至0.081。說明西蘭花中所含的葉綠素會在95～100℃條件下會被破壞。結(jié)合圖5，選擇95℃作為燙漂溫度進行研究。

圖6 不同溫度燙漂90s后的OD678值Fig.6 OD678value of different blanching temperature after the 90s

2.3.2 最佳燙漂時間的確定 圖7不僅表明西蘭花在95℃燙漂不同時間對PPO活性的影響，還能表明對西蘭花顏色的影響，由圖7可看出，燙漂處理30s和90s后，PPO相對酶活由53%下降到35%，降幅較大，原因是由于燙漂時間過短，西蘭花內(nèi)部沒有處理徹底，內(nèi)部殘存的PPO相對酶活比較高，燙漂90s和210s后，西蘭花PPO相對酶活僅由35%下降到26%。下降幅度較小，原因是由于西蘭花內(nèi)部處理徹底，整個樣品燙漂充分，酶活鈍化較徹底。

由圖7還可以看出，西蘭花在燙漂處理30～120s之間，OD678值下降幅度較小，而在燙漂120s以后，OD678值下降幅度較大，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該和PPO活性變化的原因一樣。綜合來看，選擇90s和120s作為燙漂時間較為合理，此時西蘭花PPO相對酶活分別為35%和30%，同時都可以有效的護色。從生產(chǎn)角度出發(fā)，選擇90s作為處理時間可以有效的減少成本。因此選擇燙漂90s作為西蘭花燙漂時間。

圖7 95℃燙漂不同時間對PPO活性和OD678值的影響Fig.7 Effect of the different blanching time at 95℃on PPO activity and OD678value

2.3.3 冷卻方法對PPO活性的影響 冷卻方法對西蘭花PPO活性的影響如圖8所示。由圖8可知，經(jīng)過95℃燙漂處理90s，經(jīng)過冰水冷卻的西蘭花PPO相對酶活（35%）低于常溫（20～25℃）吹風冷卻的西蘭花的PPO相對酶活（45%），這是因為經(jīng)冰水冷卻后凍藏的西蘭花植物細胞中會形成冰晶會使胞內(nèi)可溶性PPO失活，并且在凍結(jié)過程中大量胞內(nèi)液向胞外滲透，胞內(nèi)未凍液高離子強度可能會造成可溶性PPO活性下降[17]。

圖8 冷卻方法對PPO活性的影響Fig.8 Effect of the type of cooling on PPO activity

由圖8還可以看出，隨著燙漂時間的增加，常溫吹風冷卻和冰水冷卻的相對酶活差值增加。這是因為燙漂過程中，隨著燙漂時間的增加，PPO鈍化的較為充分，冷卻方式對PPO活性的影響更為明顯。選擇冰水冷卻可以直接有效的降低PPO活性并且有利于后續(xù)加工工藝的操作。

3 結(jié)論

在實驗條件下，西蘭花PPO以鄰苯二酚為底物，

其PPO活性的最佳測定波長為415nm，最佳反應(yīng)溫度為35℃，最佳pH為7.2，最佳底物濃度為0.25mol/L。在西蘭花的加工和貯藏過程中要避開此溫度和pH，以避免發(fā)生酶促褐變。
燙漂可以有效地鈍化西蘭花PPO活性，并以PPO活性和葉綠素OD678為指標，適當?shù)恼{(diào)節(jié)溫度和時間，結(jié)合工廠生產(chǎn)的情況，確定了西蘭花在95℃燙漂90s時，燙漂后立刻用冰水冷卻并凍藏的燙漂工藝條件，其PPO殘存酶活在35%，對西蘭花的顏色還有較好的保護作用，滿足了廠家生產(chǎn)的要求，同時，能有效延長西蘭花的貯藏期，為提高其食用價值和商品價值提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

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Effects of blanching conditions on polyphenol oxidase activity of broccoli

ZHANG Di1，TANG Wen-jing1，CHEN Xing-jing1，ZHANG Qing-qing1，*，TANG Yi-ming2，QIAN Qi-guang2
（1．College of Biology and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2．Wuhu Xinxin Food Industrial Co．，Ltd.，Wuhu 241000，China）

Polyphenol oxidase（PPO）of broccoli was investigated through spectrophotometric method by using catechol as substrate．And an examination method for the activity of broccoli PPO was established．Results showed that the optimum conditions for detection of PPO activity from broccoli were as followings：absorption wave length 415nm，35℃and pH7.2．The processing technology about blanching was investigated，results indicated that optimum condition of blanching was at 95℃for 90s，after blanching treated with cooling type of ice water immediately．Under the condition，the PPO activity of broccoli could be effectively passivation and the loss of color could reduce effectively，giving a good color retention．

broccoli；polyphenol oxidase；blanching；passivation

TS201.1

A

1002-0306（2014）04-0144-04

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

張帝（1989－），男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用。

蕪湖市年度科技計劃（2011農(nóng)業(yè)-13）。