大鼠糞便中細菌基因組DNA提取方法的比較

騫 宇，趙 欣

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

大鼠糞便中細菌基因組DNA提取方法的比較

騫 宇，趙 欣*

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

為獲得高質量的腸道細菌基因組DNA，用于研究腸道菌群的多樣性，本實驗分別采用改良的溶菌酶法和兩種試劑盒DNA提取法提取大鼠糞便中的細菌基因組DNA，通過DNA濃度和純度的測定、PCR-變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE技術）對提取效果進行比較，以找到適合于糞便中細菌基因組DNA的提取方法。結果表明，改良的溶菌酶法提取的DNA質量好，純度高，而且具有菌群多樣性豐富等特點，更適合用于腸道微生物菌群后續分子生物學研究。

細菌基因組DNA，大鼠糞便，腸道菌群，變性梯度凝膠電泳

腸道菌群是機體的重要組成部分，其菌群結構數量和種類的變化與機體的健康和疾病有密切關系[1-3]，因此對腸道菌群的研究也越來越受到人們的關注。隨著分子生物學技術在腸道微生物研究中的廣泛運用，提取到高質量的細菌基因組DNA對于研究腸道微生物菌群來說尤為關鍵。而DNA提取方法很多，傳統的DNA提取方法和各種試劑盒法的應用都非常廣泛，但是大多數傳統方法繁瑣復雜，費時又費力，現在提取哺乳動物腸道微生物菌群基因組DNA的主要方法是用傳統的溶菌酶法、酚/氯仿抽提法等，而這些方法提取的DNA純度低，含的蛋白質等雜質較多，嚴重影響后續的分子生物學方法的準確性。而很多DNA提取試劑盒的價格昂貴，提取出來的DNA產量相對較低，效果不理想。目前，很多學者都提出了針對不同實驗樣品的傳統DNA提取法的改良方法[4-6]，但是關于實驗室常用實驗大鼠糞便中細菌基因組DNA提取方法研究較少，而且現在還沒有專門用于從大鼠腸道中提取微生物基因組DNA的試劑盒[7]。因此，尋找一種適用于大鼠腸道細菌基因組DNA的提取方法，對于后續的腸道微生物多樣性的分子生物學研究非常有必要。

本實驗分別采用改良的溶菌酶法，糞便基因組DNA試劑盒提取法和通用基因組DNA試劑盒提取法提取大鼠糞便中細菌基因組DNA，對DNA提取效果進行比較，探尋適合于提取大鼠腸道微生物菌群DNA的快捷、經濟、高效的方法，為后續的分子生物學實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集 采集大鼠新鮮糞便0.2g，放入2mL的無菌離心管中（取2份樣品），放置在-80℃冰箱中冷凍保存；糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 北京天根生物技術有限公司；通用基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；GelRed凝膠核酸染料 美國biotium公司；蛋白酶K、溶菌酶、過硫酸銨、TEMED 美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Genview公司；PCR的試劑 中國大連TaKaRa公司；引物 均由上海生工合成。

紫外分光光度計（MiNi） 日本島津公司；制冰機（SIM-F140AY65） 日本三洋電器公司；凝膠成像系統、梯度PCR儀（S1000）、變性梯度凝膠電泳儀（DcodeSystemapparatus） 美國Bio-Rad公司。

1.2 糞便中細菌基因組DNA的提取

1.2.1 樣品預處理[8]將200mg左右糞便樣品放入2mL離心管，加入1mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1mol/L，pH7.4），20μL 20%PVPP，充分振蕩混勻。室溫下2000r/min離心6min，取上清液。沉淀中再加入1mL PBS混勻，離心，取上清液，合并兩次上清液再3000r/min離心6min，取上清液，再12000r/min離心6min，收集沉淀。沉淀用PBS清洗一次。分別用下面的3種方法抽提DNA。

1.2.2 改良溶菌酶法 用傳統的溶菌酶法提取的基因組DNA的質量少，而且含有的蛋白質雜質較多[8]，故在傳統溶菌酶法中，加入裂解液Ⅰ和Ⅱ，有利于細胞的裂解，可獲得更多的DNA，并且用氯仿/異戊醇反復抽提，有利于去除蛋白質等雜質，具體方法如下：在預處理的樣品中依次加入300μL裂解液Ⅰ（0.15mol/L NaCl，0.1mol/L Na2EDTA，pH8.0）、100mg/mL溶菌酶100μL、5μL蛋白酶K（10mg/mL），在37℃下225r/min振蕩1h；加入300μL裂解緩沖液Ⅱ（10%SDS，0.1mol/L NaCl，0.5mol/L Tris-HCl，pH8.0），50μL 20% PVPP，65℃保溫10min；加入750μL Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混合振蕩2min，13000r/min離心8min。上清液轉入新的2mL離心管；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）。混合振蕩2min，13000r/min離心8min，上清液轉入另一2mL離心管；加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀2h；15000g/min離心15min，沉淀用70%冰乙醇洗滌一次，自然風干；最后沉淀用50μL無菌去離子水溶解，-20℃保存。

1.2.3 糞便基因組DNA試劑盒提取法 將預處理的樣品，采用北京天根生物技術有限公司的糞便基因組DNA提取試劑盒提取樣品細菌基因組DNA。提取得到的DNA溶于50μL無菌去離子水中。

1.2.4 通用基因組DNA試劑盒提取法 將預處理的樣品，采用北京索萊寶科技有限公司的通用基因組DNA提取試劑盒提取樣品細菌基因組DNA。提取得到的DNA溶于50μL無菌去離子水中。

表1 細菌基因組DNA的濃度和純度Table.1 Bacterial genomic DNA of concentration and purity

1.3 糞便中細菌基因組DNA的純度和質量檢測

1.3.1 DNA提取效果及質量的檢測 分別取三種方法提取得到的DNA樣品1μL，稀釋10倍，用紫外分光光度計檢測DNA的A260、A280和A260/A280值；同時取三種方法抽提獲得的DNA各5μL，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.2 PCR擴增

1.3.2.1 細菌基因組16S rDNA PCR擴增 用16S rDNA通用引物[9-10]27f（5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進行V3區擴增，擴增產物長度約為1500bp。25μL擴增體系：1μL DNA模板，正向和反向引物各0.5μL，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix，滅菌的超純水補足至25μL。反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環，72℃延伸5min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.2.2 細菌巢式PCR擴增 為提高反應的特異性，用另一對引物特異性擴增位于第一次PCR產物內的一段更小的DNA片斷，以保證擴增片段的準確性。以第一次PCR產物作為模板，用引物[10]338f（5’-ACT CCA CGG GAG GCA GCA G-3’）及518r（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’），并在引物338f的5’末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），進行擴增。50μL擴增體系：2μL DNA模板，正向和反向引物各1.0μL，25μL 2×Taq PCR Master Mix，滅菌的超純水補足至50μL。反應程序：94℃ 5min，94℃ 30s，65～55℃ 30s（每個循環降低0.5℃），72℃30s，20個循環，94℃30s，55℃30s，72℃30s，8個循環，72℃延伸7min。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.3 DGGE電泳分析 參照朱陽玲等[11]的方法，采用Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測系統對三種方法提取的細菌基因組DNA的巢式PCR擴增產物進行電泳分離分析。采用10%（w/v）的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度范圍為35%～60%，電泳溫度60℃，恒壓200V下電泳4h。電泳結束后取出膠放入配制好的GelRed染液中，浸染30min，再使用紫外凝膠成像系統觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 三種方法獲得的細菌基因組DNA質量比較

2.1.1 細菌基因組DNA的濃度和純度 由表1可知，用改良溶菌酶法得到的樣品細菌基因組DNA濃度最高，通用基因組DNA試劑盒提取法得到的樣品細菌基因組DNA濃度最低。兩種試劑盒法提取的大鼠糞便細菌基因組DNA的OD260/OD280的值均小于1.7，改良溶菌酶法提取的基因組DNA的OD260/OD280的值在1.9～2.0之間。正常DNA樣品的OD260/OD280值約為1.8～2.0，若OD260/OD280值小于1.8或大于2.0，說明可能有蛋白污染或RNA污染[12-13]。因此改良溶菌酶法提取的基因組DNA純度較高，而兩種試劑盒法提取的基因組DNA都有不同程度的蛋白質污染或RNA污染。

2.1.2 細菌基因組DNA的電泳 如圖1所示，所得DNA樣品均大于23kbp，說明這三種方法都能提取出細菌基因組DNA，1、2泳道條帶清晰且亮度較高，說明改良后的溶菌酶法DNA提取效果最好；3、4泳道條帶亮度稍弱，5、6泳道條帶亮度相對最弱，表明用兩種基因組DNA提取試劑盒法提取的樣品基因組DNA純度跟改良后的溶菌酶法提取相比稍差，且得率較低。這與表1所顯示的信息是一致的，說明改良后的溶菌酶法提取樣品細菌基因組DNA效果最好。

圖10 .8%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 0.8%agarose gel electrophoresis figure

2.2 細菌基因組DNA的16S rDNA的PCR擴增結果

2.2.1 第一次PCR擴增結果 由圖2可見，對細菌16S rDNA V3區進行第一次PCR擴增，陰性對照無條帶，說明擴增無污染；1～6泳道均得到長度約1500bp的特異性擴增片段，符合預期擴增片段長度。而且3、4泳道亮度很強，說明擴增產物較多，效果較好。

圖2 細菌16S rDNA第一次PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electropherogram of First PCR amplication of16S rDNA of bacteria

2.2.2 巢式PCR擴增結果 如圖3所示，陰性對照無條帶，說明擴增無污染，1～6泳道均擴增出長度約200bp的片段，條帶清晰，無雜帶，證明PCR效果較好。亮度為5，6泳道＞1，2泳道＞3，4泳道，說明改良溶菌酶法提取的DNA質量最好。

本實驗證明改良溶菌酶法提取糞便樣品中的細菌基因組DNA的濃度和純度均優于兩種試劑盒法。

2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）結果分析

如圖4所示，1、2泳道顯現出的條帶最多，其次是5、6泳道，3、4泳道顯現出的條帶最少，說明改良溶菌酶法提取的DNA樣品的菌群多樣性豐富，糞便基因組DNA提取試劑盒法次之，通用基因組DNA提取試劑盒法效果不太理想。

圖3 細菌16S rDNA巢式PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electropherogram of Nested-PCR amplication of 16S rDNA of bacteria

圖4 細菌巢式PCR產物的水平變性梯度凝膠電泳圖譜Fig.4 DGGE profile of bacterial Nested-PCR amplication

3 討論

動物和人都是由宿主自身及其體內定植的微生物菌群共同組成的超級生物體。動物和人體的健康狀況可由外界環境因子與機體自身及體內的微生物菌群共同相互作用決定，因此研究宿主與體內菌群之間的相作關系等具有重大的意義。糞便與腸道內容物相似，含有大量的微生物、植物和腸道脫落細胞等，將糞便微生物作為研究對象，有利于更好地研究腸道微生物[14]。而且糞便取樣方便、無損傷。很多研究人員都選擇從動物糞便中提取出細菌基因組DNA運用于腸道微生物的研究。但由于糞便成分復雜，不同的細菌細胞壁的組成成分和結構不一樣，且糞便中伴有各種Taq酶抑制劑和膽紅素、膽鹽等DNA降解物[15]，對不同提取方法的敏感度也不一樣，所以不同的提取方法所獲得的基因組DNA有差異。而樣品DNA的提取是腸道微生物菌群后續分子研究中最關鍵、最重要的一步，提取時不僅要盡可能地將樣品中所有細菌的基因組DNA提取出來，保證DNA的質量和數量，而且要盡量去除其中抑制分子克隆中多種酶活性的雜質。

本實驗的目的是希望從大鼠糞便樣品中獲得高濃度、高純度的，并且能夠盡量全面的反映出樣品中菌群多樣性的細菌基因組DNA。根據紫外分光光度法、DNA樣品的電泳圖和PCR擴增圖，發現改良溶菌酶法提取的細菌基因組DNA的濃度和純度均高于其他兩種方法提取的DNA。因DGGE圖譜能夠比較直觀地反映細菌菌群的多樣性，故采用PCR-DGGE技術從細菌多樣性的角度評價DNA提取方法的優劣。通過3種方法得到的同一份糞便樣品的DGGE圖譜差異較大，說明在腸道菌群的分子生態研究中，DNA提取的方法會影響我們對菌群多樣性的分析，甚至引起誤差。實驗結果說明改良溶菌酶法比糞便基因組DNA提取試劑盒法和通用基因組DNA提取試劑盒法提取的細菌基因組DN的純度和質量更好，且能夠觀察到糞便中菌群的多樣性更豐富，所以更合適腸道菌群多樣性的研究。

4 結論

本實驗中使用的三種方法均能夠從大鼠糞便中提取到細菌基因組DNA，通過紫外分光光度法、PCRDGGE等方法檢測，結果顯示，相對于兩種試劑盒DNA提取法，改良溶菌酶法提取的大鼠糞便細菌基因組DNA的純度更高、質量更好，而且能夠觀察到更高的多樣性，所以更合適腸道菌群后續分子生物學研究。

[1]吳高峰．應用PCR-DGGE技術對不同日齡仔豬腸道菌群分布規律的研究[D]．鄭州：河南農業大學，2009．

[2]季天榮，葉雪芳，陳莊.變性梯度凝膠電泳（DGGE）及其在動物腸道微生態研究中的應用[C]．中國畜牧獸醫學會動物微生態學分會第三屆第八次學術研討會論文集，廣州：華南農業大學，2006：13-15．

[3]陳蓓，黃瑞.糞便標本中細菌DNA提取方法的比較[J]．中國血液流變學雜志，2007，17（2）：210-214．

[4]趙健元，李進華.一種高效的哺乳動物糞便DNA提取通用方法[J].激光生物學報，2008，17（5）：695-700.

[5]Thakuria D，Schmidt O，Liliensiek A K.Field preservation and DNA extractionmethods for intestinalmicrobial diversity analysis in earthworms[J].Journal of Microbiological Methods，2008，10：1-8.

[6]楊德君，吳襟，劉毅，等.一種快速提取腸道微生物總DNA的方法[J].中國微生態學雜志，2006，18（2）：91-93.

[7]李麗婷，許文濤，郭星，等.提取鼠腸道內微生物基因組DNA的方法研究[J].中國糧油學報，2010，25（1）：122-127.

[8]LaMONTAGNE M G，MICHEL F C，Jr HOLDEN P A，et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis[J].Journal of Microbiology Methods，2002，49（3）：255-264.

[9]Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]．Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695-700.

[10]Kim T，Lee J，Kim S，et al．Analysis of microbial communities in doenjang，a Korean fermented soybean paste，using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]．International Journal of Food Microbiology，2009，131（2-3）：265-271．

[11]朱揚玲.采用PCR-DGGE方法研究浙江玫瑰醋釀造過程中的微生物多樣性[D].杭州：浙江工商大學，2009.

[12]吳銀寶，史金才，莫測輝，等．豬糞和土壤樣品中微生物DNA提取方法的比較[J]．農業工程學報，2006，22（增刊2）：10-13．

[13]徐曉宇，閡航，劉和，等．土壤微生物總DNA提取方法的比較[J].農業生物技術學報，2005（3）：377-381．

[14]徐敏娟．鵝腸道細菌多樣性的分子生態學初步研究[D].揚州：揚州大學，2008．

[15]鄭剛，陳己任，胡博文，等.基于DGGE分析的大鼠糞便及腸道細菌DNA提取方法研究[J].食品科學，2011，32（17）：215-218．

A comparison of methods for the extraction of bacterial genomic DNA in rat feces

QIAN Yu，ZHAO Xin*
（Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China）

In order to obtain high-quality bacterial genomic DNA，and to study the diversity of the intestinal flora，improved lysozyme method，and two kinds of DNA extraction kits were used to extract bacterial genomic DNA in rat feces.These extraction techniques were compared through measuring DNA concentration and purity，and PCR-DGGE technique to find the best method for extracting bacterial genomic DNA in rat feces.Results showed that bacterial genomic DNA was extracted by improved lysozyme method had better quality and purity，and diversity of flora.It was more suitable for the subsequent intestinal microflora molecular biology research.

bacterial genomic DNA；rat feces；gut microflora；denaturant gradient gel electrophoresis（DGGE）

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0166-04

2013－07－16 *通訊聯系人

騫宇（1976-），女，博士，講師，研究方向：食品科學。

重慶市科委自然科學基金項目（cstc2011jjA80001）。