異養培養小球藻chlorella sp.生產葉黃素條件的優化

王淑慧，林河通，汪 靚，曹莉莉

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002；2.中國科學院上海高等研究院，上海201210；3.上海投資咨詢公司，上海200003）

異養培養小球藻chlorella sp.生產葉黃素條件的優化

王淑慧1，2，林河通1，汪 靚2，*，曹莉莉3

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002；2.中國科學院上海高等研究院，上海201210；3.上海投資咨詢公司，上海200003）

研究了異養條件下不同碳源、氮源、pH和溫度等因素對一株自分離小球藻的生長及葉黃素產量的影響。結果表明，葡萄糖和硝酸鉀分別是支持這株小球藻持續快速生長生產葉黃素的最佳碳源和氮源。異養培養小球藻生產葉黃素的最佳條件為：葡萄糖濃度20g·L-1、硝酸鉀濃度1.25g·L-1，初始pH6.0，溫度30℃，葉黃素產量為12.27mg·L-1。

異養培養，小球藻，葉黃素，碳源，氮源

小球藻（Chlorella）為單細胞藻類，在分類學上屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、綠球藻目（Chlorococcale）、小球藻科（Chlorellaceae）的一屬[1]。小球藻細胞中含有葉綠體等光合作用器官，可以利用光能和二氧化碳進行自養生長，某些藻種可在無光條件下，利用有機碳源進行異養生長[2-3]。小球藻富含蛋白質、不飽和脂肪酸、葉黃素和多種維生素[4]，營養豐富、全面、均衡，具有極高的營養價值和生理功效。其中葉黃素具有廣泛的生物學活性[5]：它能有效地清除自由基、刺激肌體的免疫反應、增強細胞間隙聯絡通訊、抑制腫瘤細胞的生長等，具有保護視力、防止老年人視黃斑退化、抗氧化、延緩動脈硬化、抗癌、抗衰老，預防潰瘍等許多藥用保健功效，是目前國際上食品功能性成分研究中的一個熱點。

葉黃素（lutein）廣泛存在于花卉、水果、蔬菜等植物中，其中萬壽菊為目前最主要的葉黃素來源[6-8]。然而大規模的栽培，存在占地面積大、易受季節、氣候及地域等條件的限制，造成生產效率低、提取成本高昂[9]。采用化學方法合成工藝復雜、難以合成單一異構體的葉黃素，而且其生理活性明顯低于天然提取的產物[10]。研究發現微藻類不僅生長速度快，且細胞中的類胡蘿卜素特別是葉黃素含量可達0.27%～0.31%[4，11-13]，因此人們對微藻作為葉黃素的另一來源進行了一系列的研究[4]。

目前發現富含葉黃素的微藻主要包括小球藻（Chlorella）、Muriellopsis sp.和柵藻（Scenedesmus）等，基本上均屬綠藻門（Chlorophyta）[5]。Shi[14]比較了來源于3種類型小球藻（C.vulgaris、C.protothecoides、C.pyrenoidosa）藻株在異養培養條件下的細胞生長和葉黃素合成能力，發現其中C.protothecoides CS-41的葉黃素含量最高，在30L發酵罐培養條件下，細胞葉黃素含量及產量分別為4.85mg·g-1和66.3mg·L-1。Sansawa等[15]對小球藻C.regularis S-50進行異養培養，細胞干重和葉黃素產量分別達到84g·L-1和3.5mg·g-1。Sanchez等[16]從自然界中分離得到一株高產葉黃素的柵藻（S.almeriensis），細胞中葉黃素含量達到5.5mg·g-1。從細胞生長和細胞葉黃素產量上綜合考慮，小球藻是目前最具生產潛力的藻類葉黃素源。本研究通過單因素影響實驗探討了不同培養條件下小球藻細胞生長和葉黃素含量變化，旨在為異養培養小球藻生產葉黃素等天然功能性成分提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻（Chlorella sp.） 用TAP培養基制成瓊脂平板保存藻種，用基礎Basal培養基異養轉化、二級放大用于實驗研究；葡萄糖、碳酸氫鈉、硝酸鉀、氯化銨、尿素、二氯甲烷 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈 HPLC色譜純，Sigma-Aldrich公司；葉黃素標準品 Sigma-Aldrich公司。

RID-10A/SPD-20A高效液相色譜儀 日本SHIMADZU；BSA 224S-CW電子天平、PB-10 pH計

德國Sartorius；ZHJH-C1115C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；HZ-9310KBG光照冷凍搖床 太倉市華利達實驗設備有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器 日本三洋；ZHWY-110X50往返式恒溫水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；Centrifuge5424小型離心機 德國Eppendorf；HACH DR2800分光光度計 美國哈希。

1.2 培養條件

用于小球藻擴培的為基礎Basal培養基[17]。培養器皿為250mL三角瓶，培養量100mL，pH調至6.5，經過115℃15min的高溫滅菌后在28℃搖床中暗培養，轉速為200r/min。

1.2.1 碳源的確定 分別以葡萄糖、乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源，設定初始的總碳濃度為4g·L-1。硝酸鉀為氮源，保持其濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養。

1.2.2 葡萄糖濃度的確定 初始葡萄糖濃度分別為：0、5、10、20、30、40、60、120g·L-1。硝酸鉀為氮源，保持其濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養。

1.2.3 氮源的確定 分別以硝酸鉀、氯化銨、尿素作為唯一氮源，初始的總氮濃度為173mg·L-1。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養。

1.2.4 硝酸鉀濃度的確定 初始硝酸鉀濃度分別為：0、0.625、1.25、2.5、5、10g·L-1。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養。

1.2.5 pH的確定 初始pH分別為：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1；硝酸鉀為氮源，濃度為1.25g·L-1，在28℃200r/min搖床暗培養。

1.2.6 溫度的確定 培養溫度分別設置為：20、25、28、30、34、37℃。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1；硝酸鉀為氮源，濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，200r/min搖床暗培養。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定 采用濁度比色法[18]。濁度比色法用HACH DR 2800分光光度計測定培養液在540nm處的光密度（OD540），測定時確保OD在0.2～0.8之間。

1.3.2 葡萄糖的測定 利用3，5-二硝基水楊酸法，具體參照參考文獻[19]。

1.3.3 硝酸根的測定 采用水質-硝酸鹽氮的測定-紫外分光光度法。

1.3.4 葉黃素的提取 采用桂林等[20]有機溶劑萃取法。在小球藻培養過程中及結束后，取2mL藻液，離心（10000r/min，10min），棄上清，將沉降于離心管底部的藻泥進行-20℃冷凍48h，加入2mL甲醇/二氯甲烷（體積比2∶1）溶液，水浴搖床（35℃，150r/min）30min，離心（10000r/min，2min），取上清液進行HPLC測定。

1.3.5 葉黃素的檢測 葉黃素標準品用甲醇溶解，配制成質量濃度分別為5、10、20、30、40、50mg·L-1的葉黃素標準溶液，在HPLC上進行測定，得到葉黃素峰面積（y）與葉黃素濃度（x）的一元線性回歸方程（y=173534x-373008，R2=0.9991）。實驗中根據測定樣品的峰面積帶入建立的一元線性回歸方程，即可計算出對應的葉黃素濃度。

色譜條件為：高效液相色譜（HPLC）儀（島津LC-20AD泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器）、Agilent Zorbax Ecipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱、流動相為甲醇/乙腈（v/v）∶90/10，流速為1mL/min，進樣量為20μL，柱溫28℃，檢測波長447nm。

圖1 不同碳源條件下OD的變化Fig.1 The variation of OD under different carbon source

2 結果與討論

2.1 不同碳源對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

圖1顯示葡萄糖作為碳源時，小球藻可持續快速生長，且在第3d生物量達最大（OD540為17.58）；乙酸鈉為碳源時，初期生長狀況良好，培養至第2d生物量最大（OD540為6.7），之后出現生長抑制。由圖2可以看出，隨著CH3COO-的利用，培養基的pH逐漸升高，達抑制小球藻生長的9.0以上，這與文獻[21]得到的結果一致；甲醇為碳源時，小球藻生長停滯，可見小球藻不能利用甲醇做碳源進行異養生長。上述結果表明，葡萄糖是支持小球藻快速穩定生長的最佳碳源。這與文獻[21-23]得到的結果一致。

圖2 不同碳源條件下pH的變化Fig.2 The variation of pH under different carbon source

由圖3可以看出，以葡萄糖、乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源時，小球藻均可生產葉黃素。當以葡萄糖為唯一碳源時，葉黃素產量最高達9.339mg·L-1；以乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源時，葉黃素的含量僅為葡萄糖作碳源時的76.9%和52%，進一步說明葡萄糖不僅支持小球藻快速生長，而且有利于小球藻細胞葉黃素的積累。

圖3 碳源對葉黃素的產量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the lutein yield

2.2 葡萄糖濃度對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

確定葡萄糖為最佳碳源之后，進一步探索其最佳添加濃度。培養基中葡萄糖的初始濃度分別設置為：0、5、10、20、30、40、60、120g·L-1。由圖4可以看出，異養條件下不添加葡萄糖，小球藻不增殖；當葡萄糖濃度較低（＜20g·L-1）時，培養后期出現生長停滯，這是由于葡萄糖消耗殆盡，培養基中缺乏碳源所致，說明葡萄糖是小球藻異養生長的限制性基質；高濃度的葡萄糖（＞20g·L-1）則抑制小球藻生長，并且抑制現象隨著糖濃度增加越來越明顯。故適宜小球藻異養生長的最佳葡萄糖濃度為20g·L-1。

由圖5可以看出，當葡萄糖濃度≤60g·L-1時，葉黃素的產量隨葡萄糖濃度的升高而增大，其中當葡萄糖濃度為0～20g·L-1時，隨葡萄糖濃度的增大，葉黃素產量增長速度明顯；葡萄糖初始濃度為20～60g·L-1培養4d后，葉黃素產量逐漸增大，但增長幅度較小；當葡萄糖濃度達到120g·L-1時，小球藻生物量與空白相比幾乎無增長，導致葉黃素產量較低，只有3.35mg·L-1。培養結束后測定培養基中的殘糖。當葡萄糖初始濃度為10、20、30、40、60g·L-1時，其剩余濃度分別為0、7.56、17.89、27.94、50.6g·L-1。綜合考慮葡萄糖利用及最終葉黃素濃度，葡萄糖的最佳濃度選擇20g·L-1。

圖5 葡萄糖濃度對葉黃素產量的影響Fig.5 The effect of glucose concentration on the lutein yield

2.3 不同氮源對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

圖6、圖7結果顯示，在硝酸鉀、氯化銨、尿素三種氮源下，小球藻均能生長，但因種類不同，生長狀況各異。硝酸鉀作為唯一氮源時，小球藻持續快速生長，且培養3d后生物量達最大（OD540為17.55），尿素作為唯一氮源時，初期生長狀況良好，培養至第3d生物量達到較高水平，OD540為15.3，可見小球藻可以利用尿素作為氮源進行生長；氯化銨作為唯一氮源時，培養第1d小球藻生長良好，此后進入生長停滯階段，這是由于隨著NH4+被小球藻吸收利用，為保證細胞內電荷平衡釋放出對應數量的H+，使得培養基中的pH迅速降低至4.5以下，抑制了小球藻的進一步生長[22]。上述結果表明，與氯化銨、尿素相比，硝酸鉀是支持小球藻快速穩定生長的最佳氮源。

由圖8可以看出，以硝酸鉀、氯化銨、尿素作為唯一氮源時，小球藻均可產生葉黃素。當以硝酸鉀為唯一氮源時，葉黃素產量最高達9.338mg·L-1（干重計的產量為：2.159mg·g-1）；以尿素作為唯一氮源時，葉黃素的含量次之為7.263mg·L-1，以氯化銨為唯一氮源時，葉黃素的產量最低，僅為5.071mg·L-1，進一步說明硝酸鉀不僅支持小球藻快速生長，而且有利于小球藻細胞中葉黃素的合成。對比王素琴等[21]以硝酸鉀為氮源，利用USTB01生產葉黃素，其產量為0.69mg·g-1。

圖6 氮源對小球藻生長的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on growth of Chlorella vulgar

圖7 不同氮源條件下pH的變化Fig.7 The variation of pH under different carbon resource

圖8 氮源對葉黃素的產量的影響Fig.8 Effect of nitrogen source on the lutein yield

2.4 氮源濃度對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

確定硝酸鉀為最佳氮源之后，進一步探索其最佳添加濃度。設定培養基中硝酸鉀的初始濃度為：0、0.625、1.25、2.5、5、10g·L-1。由圖9可以看出，異養條件下不添加硝酸鉀，小球藻有微弱的生長跡象，生長極其緩慢；當硝酸鉀的濃度≤1.25g·L-1時，OD540隨硝酸鉀濃度的增大而增大；當硝酸鉀的濃度為1.25～10g·L-1之間時，隨著硝酸鉀濃度的增大，小球藻的生長略受抑制。說明適宜小球藻異養生長的最佳硝酸鉀濃度為1.25g·L-1。

圖9 硝酸鉀濃度對小球藻異養生長的影響Fig.9 The effect of potassium nitrate concentration on growth of Chlorella sp.

由圖10可以看出，在實驗濃度范圍內，葉黃素的產量隨硝酸鉀濃度的升高而增大，說明硝酸鉀是影響葉黃素產量的限制性因子。其中當硝酸鉀濃度為0～1.25g·L-1時，隨硝酸鉀濃度的增大，葉黃素產量增大速度較快，這與此濃度區間微藻生物量的線性增長密切相關；硝酸鉀初始濃度為2.5g·L-1，培養4d后，葉黃素產量為10.46mg·L-1；當硝酸鉀濃度為10g·L-1時培養4d后，葉黃素產量達12.3mg·L-1。培養結束后測定培養基中的殘氮（NO3--N），結果如下：當硝酸鉀初始濃度小于1.25g·L-1時，培養4d后，培養基中的NO3--N消耗殆盡；當培養基中硝酸鉀的初始濃度為2.5、5、10g·L-1時，培養4d后剩余NO3--N的濃度分別為0.448、3.024、7.771g·L-1。綜合考慮，硝酸鉀的最佳濃度為1.25g·L-1。

圖10 硝酸鉀濃度對葉黃素產量的影響Fig.10 The effect of nitrogen concentration on the lutein yield

圖11 不同初始pH時，pH隨培養時間的變化Fig.11 The variation of pH under different original pHs

2.5 初始pH對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

由圖11可以看出，雖然培養基中的初始pH不同，但小球藻可在初始培養階段，自動調整至相當水平，之后隨著培養時間的延長，呈現逐漸增大的趨勢；這是由于培養基中的氮源為硝酸鉀，小球藻在吸收的過程中伴隨質子共轉運，使培養基中質子濃度降低，導致培養基pH上升[22]。

由圖12可以看出，雖然初始pH不同，但隨著培養時間的延長，OD540呈現相同的變化趨勢，最大值均出現在第3d。培養液的初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0時均利于小球藻的生長，并且最終的生物量差別不大。初始pH為6.0時的OD540最大，為17.1。當初始pH為8.0時，經過115℃15min滅菌后，培養基呈現淡黃色，不利于實驗結果的觀察。而且不同初始pH時，最后的葉黃素濃度均在7.98～8.3mg·L-1的范圍，故初始pH選擇6.0為佳。

圖12 不同初始pH條件下，OD隨培養時間的變化Fig.12 The variation of OD under different original pHs

2.6 不同溫度對小球藻生長狀況及葉黃素產量的影響

為了研究溫度對這株小球藻生長及葉黃素產量的影響，本實驗選取20、25、28、30、34、37℃六個溫度，培養時間為5d。由圖13可以看出，在設置的溫度范圍內，較高的溫度，延遲期短，細胞內酶活性強，代謝旺盛。溫度較低時（20、25℃）細胞內酶活性低、代謝遲緩，延滯期長，達到最大生物量所需的之間較長。當培養溫度為20℃時，培養5d后OD540最大為16.57；當培養溫度為25℃和28℃時，4d生物量達最大，OD540分別為14.92、14.97；當培養溫度為30℃時，2d后生物量達到最大，OD540為16.00。當培養溫度為34℃和37℃時，三個平行中均有一個在培養初期出現了生長抑制現象，后期生長迅速，并于第3d達到相當水平。當培養溫度為20～30℃范圍內，藻細胞的生長速率隨溫度的升高而增大，在30～37℃范圍內隨著溫度的升高而降低，并有生長抑制現象發生。從以上結果看，30℃的培養溫度較適宜小球藻chlorella sp.生長。

圖13 溫度對小球藻生長的影響Fig.13 Effect of temperature on growth of chlorella sp.

圖14 不同溫度下，培養后期葉黃素在微藻細胞中的演變規律Fig.14 Lutein evolution in microalgae in late culture stage under different temperatures

由圖14可以看出，在各個培養溫度下，葉黃素的濃度均在第4d達最大，其中培養溫度為30℃時最大為12.27mg·L-1。所以，小球藻異養培養生產葉黃素的最佳溫度為30℃。

3 結論

對影響小球藻Chlorella sp.生長和葉黃素產量的幾個關鍵因子進行了單因素影響實驗，結果表明：

3.1與乙酸鈉、甲醇相比，葡萄糖是支持小球藻異養培養生產葉黃素的最佳碳源，最適濃度為20g·L-1。

3.2與尿素、氯化銨相比，硝酸鉀是支持小球藻異養培養生產葉黃素的最佳氮源，最適濃度為1.25g·L-1。

3.3初始pH5.0～9.0范圍對葉黃素的產量無明顯影響，小球藻Chlorella sp.最適生長的初始pH為6.0。

3.430℃不僅是小球藻快速生長的最佳溫度，而且是促進小球藻生物合成葉黃素的最適溫度。

在葡萄糖濃度20g·L-1、硝酸鉀濃度1.25g·L-1，初始pH6.0，溫度30℃的培養條件下葉黃素的產量為12.27mg·L-1。

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Optimization of heterotrophic culture conditions of Chlorella sp.for lutein production

WANG Shu-hui1，2，LIN He-tong1，WANG Liang2，*，CAO Li-li3
（1.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；
3.Shanghai Investment Consulting Corporation，Shanghai 200003，China）

The effect of carbon source，nitrogen source，pH as well as temperature on the growth of a self-isolated Chlorella sp.and the production of lutein were investigated.Results showed that glucose was the best carbon source and potassium nitrate was the best nitrogen source to support sustained and rapid growth of this strain of Chlorella sp.as well as lutein production.Results of optimization were as follows：the glucose concentration was 20g·L-1，potassium nitrate concentration was 1.25g·L-1，initial pH was 6.0 and temperature was 30℃.In this condition the maximal lutein concentration was 12.27mg·L-1.

Chlorella sp.；heterotrophic culture；lutein；carbon source；nitrogen source

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0179-06

2013－07－04 *通訊聯系人

王淑慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品貯藏保鮮原理與應用。

國家自然科學基金（51208305）；上海市科委浦江人才計劃項目（13PJ1407600）。