67.8ku絲瓜多酚氧化酶酶學性質的研究

吳海霞，曹雨舟

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.山西昭鑫電力科技有限公司，山西運城044000）

67.8ku絲瓜多酚氧化酶酶學性質的研究

吳海霞1，曹雨舟2

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.山西昭鑫電力科技有限公司，山西運城044000）

目的：為對67.8ku絲瓜多酚氧化酶（PPO）的酶學性質進行研究。方法：從絲瓜中提取、純化得67.8ku的絲瓜多酚氧化酶，并分別從溫度、pH、作用底物、金屬離子、抑制劑及表面活性劑對絲瓜PPO活性的影響等方面對絲瓜PPO的酶學性質進行研究。結果：結果表明，pH為6.0時相對酶活最高，pH3.0～8.0酶活較穩定；其最適作用溫度為30℃，對熱穩定性較強，70℃保溫120min后還具有40%的相對酶活；Co2+、K+、Ca2+等對酶有較強的激活作用，而Na+、Mg2+、Cu2+對酶有明顯的抑制作用；抗壞血酸為該酶最好的抑制劑，其次為半胱氨酸、β-巰基乙醇、Na2S2O3、Na2SO3等；十二烷基肌氨酸鈉（Laurouyl Sarcosine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等對酶有一定的激活作用，而十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、吐溫-20（Tween-20）對酶有抑制作用；與l-多巴（l-dopa）的結合力最強，以其為底物時該酶的Km為1.32mmol/L，Vmax為0.22OD475/min。結論：該研究確定了絲瓜多酚氧化酶的最適作用條件及其影響因素，可為控制絲瓜在貯藏、加工過程中的酶促褐變提供理論依據。

絲瓜，67.8ku多酚氧化酶，酶學性質

絲瓜（Luffa cylindrica L.Roem），又名天絲瓜、天絡瓜等，為葫蘆科絲瓜屬一年生攀緣性草本植物[1]。絲瓜營養豐富，除含有人體所必需的常見營養成分外，還含有皂苷、絲瓜苦味素、瓜氨酸、精氨酸等成分，對機體的生理活動十分重要[2]。但是，絲瓜在加工過程中容易發生褐變，這在一定程度上降低了絲瓜的感官品質、營養價值和商品價值。

酶促褐變是果蔬加工過程中普遍存在的嚴重問題[3]。一般認為，植物組織中的褐變主要是由多酚氧化酶（PPO）的作用引起，PPO可催化原料中的多酚類物質為醌類，醌經自身縮合或與細胞內的蛋白質反應，產生黑色或褐色沉積物，是引起果蔬發生酶促褐變的主要酶類[4]。國內外對果蔬中PPO的研究主要集中在蘋果、荔枝、香蕉、馬鈴薯、菊芋、蘑菇、蓮藕、綠豆等[5-14]，有關絲瓜PPO的研究僅黃樹蘋等[15]對絲瓜粗酶提取物的部分酶學特性進行了報道。本實驗通過對絲瓜中PPO的提取、純化，得到67.8ku絲瓜PPO，并對其酶學特性進行研究，旨在探求影響絲瓜PPO活性的關鍵因素，以期為進一步研究果蔬褐變機理、調控絲瓜加工條件及采用抗褐變措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絲瓜 市售新鮮絲瓜，經剝皮、破碎后，于4℃冰箱貯藏、備用；DE-52 為Whatman分裝；SephadexG-75 為Pharmacia分裝；低相對分子質量標準蛋白質maker 為預染蛋白；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-酪氨酸、l-左旋多巴、對苯二酚、鄰苯三酚、抗壞血酸等其余試劑 均為國產分析純。

Lambda 35紫外可見分光光度計 美國Perkin Eimer公司；2-16k臺式高速冷凍離心機 美國SIGMA公司；1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ ALPHA；mini電泳儀、電泳槽 美國Bio-Rad公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；層析系統 上海琪特分析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚氧化酶（PPO）酶活測定方法 測定系統為3.3mL，其中含2.4mL Tris-HCl緩沖液（pH7.5），0.4mL酶液，加入0.5mL l-左旋多巴（l-dopa）溶液（30mmol/L）啟動反應，6min后，迅速取出測定OD475。以煮沸10min后的酶液取代原酶液作為空白對照[16]。PPO活力單位定義為：測定條件下每分鐘OD值變化0.001所需的酶量為一個酶的活力單位（U）。

1.2.2 絲瓜PPO粗酶液的提取及分離純化 取新鮮絲瓜200g，剪碎后，以1∶1（m∶v）料液比加入4℃預冷的pH5.5 PBS中，并加10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及0.5g VC，勻漿，于4℃靜置浸提12h，過濾，濾液于4℃下10000r/min離心20min，上清液即為絲瓜PPO粗酶液[17]；于粗酶提取液中，加入40%飽和硫酸銨，4℃靜置、離心棄沉淀后，取上清液再加入80%的飽和硫酸銨，靜置、離心，取上清，于4℃冰箱透析。透析后的酶液采用PEG4000濃縮，進行DEAE-cellulose DE52離子交換柱層析，隔管檢測并收集酶活性峰，PEG20000濃縮后進行Sephadex G-75凝膠過濾層析，隔管檢測并收集酶活性峰，真空冷凍干燥，備用。此酶蛋白經SDS-PAGE及NATIVE-PAGE檢測，顯示為單一條帶，其分子量約為67.8ku。

1.2.3 絲瓜多酚氧化酶的酶學性質測定

1.2.3.1 絲瓜PPO最適作用pH及pH穩定性 配制pH3.0～10.0的緩沖液，按1.2.1酶活測定體系將酶液加入其中，測定酶活。以最適條件下的酶活力作為100%；將酶液在不同pH（pH3.0～10.0）的緩沖液中于4℃保溫12h，按照1.2.1測定酶的活性。以未保溫酶液的酶活為100%。

1.2.3.2 絲瓜PPO最適作用溫度及熱穩定性 按1.2.1酶活測定體系，分別測定酶液在不同溫度（20～70℃）下的酶活，以最適條件下的酶活力作為100%；將酶液在20～60℃下分別保溫120min，每間隔30min按照1.2.1方法測定酶活，以未保溫酶液的酶活為100%。

1.2.3.3 作用底物對絲瓜多酚氧化酶活性的影響及米氏常數（Km）、最大反應速度（Vmax）的測定 按1.2.1測定酶活力方法，測定30℃、pH6.0條件下，酶液與0.5mL濃度為10mmol/L的l-dopa、對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、間苯三酚及l-酪氨酸7種底物反應時的酶活，以l-dopa為底物時的酶活為100，其余與之相比得相對酶活；將l-dopa配制成不同濃度的溶液（2～15mmol/L），分別測定不同底物濃度下酶的反應速度（OD475表示）。按Lineweaver.Burk雙倒數作圖，求出Km、Vmax[18]。

1.2.3.4 金屬離子對絲瓜多酚氧化酶活性的影響 在反應體系中分別加入濃度為5mmol/L的Na+、K+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+等8種金屬離子，與一定量酶液于4℃保溫30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法測定酶活。以最適條件下未加金屬離子的酶液所測酶活為100%[19]。

1.2.3.5 抑制劑對絲瓜多酚氧化酶活性的影響 在反應體系中分別加入濃度為5mmol/L的Na2SO3、Na2S2O3、檸檬酸、硫脲、半胱氨酸、抗壞血酸、β-巰基乙醇、EDTA等8種抑制劑，與一定量酶液于4℃保溫30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法測定酶活。以最適條件下未加抑制劑的酶液所測酶活為100%[20]。

1.2.3.6 表面活性劑對絲瓜多酚氧化酶活性的影響

在反應體系中分別加入濃度分別為0.1%、0.2%的十二烷基肌氨酸鈉（Laurouyl Sarcosine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、吐溫-20（Tween-20）與一定量酶液于20℃保溫30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法測定酶活。以最適條件下未加活性劑的酶液所測酶活為100%[20]。

圖1 絲瓜PPO最適作用pHFig.1 The optimal pH of loofah PPO

2 結果與分析

2.1 絲瓜PPO最適作用pH及pH穩定性

PPO是含銅酶，pH較高或較低都會導致Cu2+的解離及蛋白質的變性，從而使PPO失活。研究報道，不同植物或同一植物不同部位的PPO，其最適pH可能有所不同，作用底物的不同也會導致最適pH的變化。以鄰苯二酚為底物，曼密蘋果為7.0[5]，栗子為5.0[17]。Oktay Arslan等[21]則分別以愈創木酚、兒茶酚及鄰苯三酚為底物研究得出桑葚PPO的最適pH為5.0、7.0及7.5。Tülin Aydemir[19]分別以愈創木酚、l-dopa及鄰苯三酚為底物研究得出洋薊多酚氧化酶最適pH分別為6.0、8.0及6.5。本實驗以l-dopa為底物研究了絲瓜PPO的最適pH。由圖1可知，該酶促反應適宜的pH范圍較寬，當pH為3.0～6.0時，隨著pH的逐漸增加，絲瓜PPO的活性逐漸增強，pH為6.0時活性最高，隨著pH的繼續增加，酶活受到抑制，逐漸減弱。由此可知，以ldopa為底物時絲瓜PPO的最適pH為6.0。與黃樹蘋等[15]以鄰苯二酚為底物所測得的絲瓜PPO最適pH6.8略有差別。

絲瓜PPO的pH穩定性實驗結果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著保溫時間延長，絲瓜PPO酶活均表現為下降的趨勢。在pH3.0～8.0范圍內較為穩定，在此范圍內，酶活下降較為緩慢，保溫12h后，其相對酶活均保持在55%以上。在高于pH8.0的堿性環境中，酶的穩定性急劇降低，pH10.0保溫12h后其酶活僅為20.02%，此時酶蛋白發生變性產生沉淀并導致反應環境渾濁。

2.2 絲瓜PPO的最適作用溫度及熱穩定性

圖2 絲瓜PPO的pH穩定性Fig.2 pH stability of loofah PPO

溫度對酶活性的影響是雙重的，一是酶作為一種生物催化劑，隨著反應溫度升高，其活化分子數增多，催化效率提高，酶促反應速度加快；另一方面則是隨著溫度升高，酶蛋白變性程度加深，酶會逐步喪失其催化活力，同時不適宜的溫度也會破壞酶活性部位三維結構的完整性和穩定性[17，22]。由圖3可知，在10～30℃范圍內隨著溫度的上升，絲瓜PPO活性逐漸增強，溫度為30℃時活性最大，這可能是第一種效應起主導作用，溫度的適度提高，可使酶朝著有利于與底物發生作用的催化構象轉變；隨著溫度的繼續升高，溫度則會破壞酶的活性構象，活性逐漸下降。因此可知，絲瓜PPO的最適反應溫度為30℃。

圖3 絲瓜PPO最適作用溫度Fig.3 The optimal temperature of loofah PPO

從圖4可以看出，絲瓜PPO在20～40℃短時間保溫（30min以內）可使酶活略微增強，隨著保溫時間延長，酶活有所下降，但保溫120min后還能保持80%以上的酶活，說明在此溫度范圍內絲瓜PPO較為穩定。當溫度升高至60℃以后，短時間保溫其酶活下降不明顯，但保溫120min后，其酶活降至50%以下，表現出明顯的不穩定性。

2.3 作用底物對絲瓜多酚氧化酶活性的影響及Km、Vmax的測定

圖4 絲瓜PPO的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of loofah PPO

作用底物不同，酶所表現的活性不同，其Km、Vmax也不同。以l-dopa為底物時洋薊PPO的Km及Vmax分別為37.7mmol/L、5865（U/mL·min）[19]。從圖5可以看出，絲瓜PPO催化l-dopa的酶促反應酶活最高，以對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚及間苯三酚為底物時也具有較強的催化活性，而對單酚1-酪氨酸的催化活性極弱。因此，研究以l-dopa為底物測定了絲瓜PPO的Km、Vmax，據Lineweaver.Burk雙倒數作圖原理，得線性方程：（見圖6），絲瓜PPO的Km為1.32mmol/L、Vmax為0.22OD475/min。

圖5 作用底物對絲瓜PPO活性的影響Fig.5 Effect of substrate on loofah PPO activity

圖6 LcPPO米氏常數的確定Fig.6 Determination of loofah PPO Km

2.4 金屬離子對絲瓜多酚氧化酶活性的影響

金屬離子在酶的催化反應中有重要作用，可通過使底物直接結合到活性部位或可逆地改變金屬離子的氧化態來調節氧化還原反應；或者通過靜電穩定或屏蔽負電荷等途徑參與酶的催化反應[21]。PPO為含銅的金屬酶，每個亞基均含兩個金屬銅離子，兩個銅離子分別與蛋白質分子中組氨酸結合，另有一個內源橋基將兩個銅離子聯系在一起，構成酚氧化酶催化氧化反應的活性中心[23]。由圖7可以看出，Co2+、K+、Ca2+對于絲瓜PPO有一定的激活作用，而Na+、Mg2+、Cu2+有明顯的抑制作用，Ba2+、Zn2+則無明顯作用。結果說明，低濃度的金屬離子（5mmol/L）對絲瓜PPO活性有一定影響，但并不顯著，在絲瓜的保藏、加工過程中只需適當控制絲瓜與金屬離子的接觸即可避免褐變的發生。

2.5 抑制劑對絲瓜多酚氧化酶活性的影響

圖7 金屬離子對絲瓜PPO活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on loofah PPO activity

抑制劑的種類及濃度對酶活性的影響有明顯的差別。由表1可知，EDTA對酶活幾乎無抑制作用，檸檬酸對酶活的影響也不大，而抗壞血酸、半胱氨酸等其它幾種抑制劑對絲瓜PPO均有一定的抑制作用，且濃度增大，抑制效果增強。抗壞血酸作為一種常用的抗氧化劑，在粗酶提取過程中適量的添加可有效降低提取過程中PPO的損耗[17]。半胱氨酸也常作為一種抗氧化劑被廣泛使用，有研究認為其可能是通過與PPO活性位點的銅離子結合或替代與銅緊密配合的組氨酸殘基來抑制PPO活性[24]，這與本試驗中半胱氨酸可抑制PPO酶活性的結果相一致；但也有報道稱半胱氨酸是通過與酚氧化生成的醌類物質直接結合而形成無色硫氫化合物，在不影響PPO活性的情況下來抑制褐變[25-26]；也可能是這兩種機制共同作用的結果。

表1 抑制劑對絲瓜PPO活性的影響Table.1 Effect of inhibitors on loofah PPO activity

2.6 表面活性劑對絲瓜多酚氧化酶活性的影響

表面活性劑會對酶活有不同程度的抑制或激活作用，實驗以不同濃度、不同種類的表面活性劑對絲瓜PPO的影響進行了研究。由表2可知，聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）對絲瓜PPO酶活沒有任何影響，Laurouyl Sarcosine、SDS對酶活有很強的激活作用，濃度為0.2%時，酶活分別達119%、139%；CTAB、Tween-20則對酶活有一定的抑制作用，其中CTAB的抑制作用更為顯著，在濃度為0.2%時相對酶活僅為46%。

表2 表面活性劑對酶活性的影響Table.2 Effect of surfactants on loofah PPO activity

3 結論

采用磷酸緩沖液浸提得絲瓜多酚氧化酶粗酶液，經硫酸銨沉淀、透析、DE-52離子交換層析及sephadex-G75凝膠柱層析純化并結合電泳檢測，得67.8ku的絲瓜多酚氧化酶。酶學性質研究表明，該酶最適作用pH6.0，最適作用溫度30℃，其pH適應范圍廣、熱穩定性強，在pH3.0～8.0及50℃以下時穩定性較好，因此在絲瓜的貯藏、加工過程中可采用調節pH在強酸性或堿性環境并結合適當升溫的方法來保持酶活性在較低的水平，從而達到控制絲瓜褐變的目的；金屬離子中，Na+、Mg2+、Cu2+對該酶有明顯的抑制作用，而Co2+、K+、Ca2+對其具有較強的激活作用，特別是在金屬離子濃度較高時，激活作用更為明顯；抗壞血酸、半胱氨酸、β-巰基乙醇、Na2SO3、Na2S2O3對絲瓜PPO有強烈的抑制作用，其中抗壞血酸為該酶最好的抑制劑，而檸檬酸、EDTA的抑制作用則相對較弱，在絲瓜加工過程中可采用添加抗壞血酸、半胱氨酸的方法來抑制其褐變；該酶對單酚底物l-酪氨酸的催化活性較弱，而對雙酚、三酚底物催化活性較強，其中對l-dopa的結合力最強，以其為底物時，該酶的Km值為1.32mmol/L，Vmax為0.22OD475/min。

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Study on enzymatic properties of 67.8ku polyphenol oxidase in loofah

WU Hai-xia1，CAO Yu-zhou2
（1.Department of Life Science，Yuncheng University，Yuncheng 044000，China；2.Zhaoxin Electric Power Technology Co.，Ltd.，Yuncheng 044000，China）

Objective：To study the enzymatic properties of 67.8ku PPO in loofah.Methods：Polyphenol oxidase of 67.8ku was extracted and purified from loofah and the effect of tempere，pH，substrats，metal ions，inhibitors and surfactants on PPO activity were researched respectively.Results：The enzyme activity was the strongest when pH value was 6.0 and its activity was stable in pH3.0～8.0.The optimum temperature of PPO was 30℃and its thermostability was good.After 120min of keeping 70℃，its relative activity was 40%.The enzyme was activated by Co2+，K+and Ca2+，but inhibited by Na+，Mg2+and Cu2+.Ascorbic acid was the best inhibitor of the PPO，followed by cysteine，β-Mercaptoethanol，sodium thiosulfate and sodium sulfite.Some surfactants had significant stimulation to the enzyme activity such as Laurouyl Sarcosine and SDS，but some had inhibiton such as CTAB and Tween-20.The binding ability of l-dopa with the enzyme was the strongest，taking it as substrate，the value of Kmand Vmaxof PPO were 1.32mmol/L and 0.22OD475/min respectively.Conclusion：The study identified the optimum conditions and the critical factors affected its activity of PPO in loofah，it could provide theoretical basis for the prevention of enzymatic browning during storage and processing of the loofah.

loofah；67.8ku polyphenol oxidase（PPO）；enzymatic properties

TS255.36

A

1002-0306（2014）04-0184-05

2013－06－17

吳海霞（1980-），女，在讀博士，講師，研究方向：農產品貯藏保鮮及植物活性成分。

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（CXZZ12_0544）。