響應面法優化紅緣擬層孔菌胞外多糖發酵培養基

圣志存，郝利民，2，*，賈士儒，陶如玉，張 虹，魯吉珂

（1.天津科技大學，工業發酵微生物重點實驗室，天津300457；2.總后勤部軍需裝備研究所，北京100010；3.武裝警察部隊總部機關門診部，北京100089；4.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州450001）

響應面法優化紅緣擬層孔菌胞外多糖發酵培養基

圣志存1，郝利民1，2，*，賈士儒1，陶如玉1，張 虹3，魯吉珂2，4

（1.天津科技大學，工業發酵微生物重點實驗室，天津300457；2.總后勤部軍需裝備研究所，北京100010；3.武裝警察部隊總部機關門診部，北京100089；4.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州450001）

為提高紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）胞外多糖（EPS）產量，采用響應面法對其發酵培養基進行優化。在單因素實驗基礎上，利用中心組合設計原理，以蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O濃度為實驗因素，以多糖產量為響應值，采用3因素5水平響應面分析方法建立數學模型。結果顯示，紅緣擬層孔菌產EPS的最佳培養基為：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此條件下，EPS產量預測值為4.02g/L，驗證值為（3.92±0.18）g/L。采用響應面法對紅緣擬層孔菌EPS發酵培養基進行優化，方法可行。

紅緣擬層孔菌，紅緣擬層孔菌胞外多糖，響應面

紅緣擬層孔菌又名紅緣層孔菌、紅緣樹舌、紅帶菌等[1]，為世界廣泛分布的木腐真菌，生長在多種針葉樹、闊葉樹立木、倒木及腐朽木上，在我國東北地區常作為藥用補肺益腎，鎮痛解毒等。現代藥理研究表明，該菌提取物具有抗菌、調節神經系統、增強免疫力、保護肝損傷、抑制腫瘤細胞和清除自由基等作用[2-5]。當前藥用真菌活性物質幾乎都來源于子實體，其生長狀況及產量完全受自然條件的控制，野生菌難以滿足人們的需求。紅緣擬層孔菌液體培養有望解決子實體生長周期長和自然資源稀少的問題，值得進一步深入研究。目前，對紅緣擬層孔菌的研究主要集中在菌絲體培養、胞內多糖及其活性研究等方面[6]，而對以胞外多糖為目標產物的紅緣擬層孔菌發酵培養基的研究尚未見報道。

培養基成分是影響紅緣擬層孔菌胞外多糖（EPS）產量的主要因素，對培養基進行優化是提高EPS產量的有效途徑。響應面分析法通過合理設計實驗，建立二次回歸模型，對各因子水平及其交互作用進行優化與評價，尋求最優響應因子水平及響應值，可快速有效地確定多因子系統的最佳條件[7-11]。本文通過單因素和響應面分析實驗優化胞外多糖產量適宜的培養基，可為后續紅緣擬層孔菌EPS的藥用開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）菌種由總后勤部軍需裝備研究所提供；種子培養（g/L） 葡萄糖30，酵母粉5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 10，pH6.0；酵母粉 天津市百世化工有限公司；蛋白胨 天津市化學試劑一廠；麥芽糖 海藍季科技發展有限公司；乳糖 天津市德恩化學試劑有限公司；蔗糖、NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、（NH4）2SO4、NH4Cl天津市北方天醫化學試劑廠；以上試劑等級均為分析純。

RE-300型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；QL-902型漩渦振蕩器 海門市其林儀器制造有限公司；722s型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限責任公司；UV-3600型紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司。

1.2 培養方法

1.2.1 液體菌種制備 取3～4塊約0.5～1.0cm2的菌種塊接種到盛有150mL液體種子培養基的500mL三角瓶中，28℃，180r/min振蕩培養48h，得液體菌種。

1.2.2 液體培養 500mL三角瓶中分裝135mL發酵培養基，10%接種量接種，28℃，180r/min振蕩培養5d，得液體發酵液。

1.2.3 EPS提取及測定 取發酵液5mL加入3倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜。10000r/min，離心10min，收集沉淀。用65℃溫水溶解，定容，苯酚硫酸法測EPS含量[12]。

1.3 實驗設計

首先利用單因素實驗篩選對紅緣擬層孔菌EPS產量影響顯著的因素，再利用部分因子實驗和最陡爬坡實驗確定對EPS產量較為顯著的變量和其最佳濃度中心點，最后利用中心組合設計實驗對紅緣擬層孔菌EPS發酵培養基進行預測和驗證。

1.3.1 單因素實驗

1.3.1.1 碳源實驗 分別以3%（w/v）的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖為碳源，酵母粉0.5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培養紅緣擬層孔菌5d，考察碳源對EPS產量的影響。

1.3.1.2 氮源實驗 分別以0.5%的酵母粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4為氮源，蔗糖5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培養紅緣擬層孔菌5d，考察碳源對EPS產量的影響。

1.3.1.3 無機鹽實驗 分別以5%的蔗糖，1%的酵母粉為基礎培養基，KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4的添加量篩選對EPS產量的影響較大的無機鹽，再對其濃度進行優化。

1.3.2 部分因子設計實驗 分別選取以上4個因素的高低2個水平，通過Design Expert軟件的部分因子設計，以EPS產量作為響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對EPS產量影響較為顯著的因素。表1為部分因子實驗設計水平及其編碼值。

表1 部分因子實驗設計及其編碼水平Table.1 The experiment design and coded level of fraction factor design

1.3.3 最陡爬坡實驗 最陡爬坡實驗以部分因子實驗的中心點為路起始點向外延伸，由回歸方程確定正負效應來增加或降低變量濃度。根據部分因子實驗及其分析結果設計爬坡實驗，即對顯著因素進行濃度的梯度設計，不顯著的因素取單因素EPS最佳濃度值。

1.3.4 中心組合設計實驗 用中心組合設計進行響應面優化，通過實驗數據擬合響應面模型，得到二次多項式，并最終確定最佳發酵條件。二次多項式為描述響應量（應變量）和自變量關系的經驗模型[7]。中心組合水平取值見表2。

表2 中心組合設計水平及其編碼Table.2 Range and levels of central composite design

1.4 統計分析

所有實驗做3個平行，Excel進行實驗數據誤差分析。Design Expert軟件對部分因子實驗，中心組合設計實驗進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源實驗 由圖1可知，紅緣擬層孔菌產EPS最適碳源為蔗糖，蔗糖利用率較高可能是由于紅緣擬層孔菌具有較高的蔗糖酶活性。有文獻報道有些真菌以蔗糖為底物時，能分泌蔗糖酶催化底物蔗糖水解消耗[13]；另外，隨著蔗糖濃度的上升，其EPS產量先上升后下降，在蔗糖濃度為15%時，EPS達到最大值。這可能是由于過低的底物濃度不能最大限度地滿足紅緣擬層孔菌的生長需求。相反，底物濃度過高導致培養基黏度增加，進而影響菌體的生長和產物的分泌。

2.1.2 氮源實驗 由圖2可知，紅緣擬層孔菌產EPS最適氮源為酵母粉，這可能是由于酵母粉是有機氮源，其含有豐富的蛋白質、氨基酸和維生素，能夠促進多糖的合成[14]。酵母粉濃度在1%時，EPS產量達到最大值，為1.57g/L。繼續增加酵母粉濃度會抑制EPS的合成，這可能是由于酵母粉成分復雜，后期底物消耗不完，會誘導產生一些酶降解紅緣擬層孔菌菌絲體。

圖1 不同碳源及最佳碳源濃度對紅緣擬層孔菌EPS的影響Fig.1 Effect of different carbon source and sucrose concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

圖2 不同氮源及最佳氮源對紅緣擬層孔菌產EPS的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source and yeast extract concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.1.3 無機離子實驗 由表3可知，對于相同添加量的無機鹽，MgSO4·7H2O、KH2PO4對EPS產量影響較大。對兩者濃度進行優化，如圖3所示，其最適濃度分別為分別20g/L、2g/L。這可能是由于KH2PO4中的磷元素是合成菌體細胞膜磷脂雙分子層的主要成分，磷含量適度過低（0.2%）會阻礙磷脂的合成，導致細胞膜通透性增加從而有利于EPS的分泌，過高會抑制EPS的釋放；相反磷含量過低可能不能滿足其正常生長需求。鎂離子影響EPS產量的原因在于鎂離子是各種酶的激活劑。同酵母粉類似，MgSO4·7H2O濃度過高，后期營養過剩，可能會激活降解紅緣擬層孔菌菌絲體的酶類，反而不利于EPS的積累產生。

表3 不同無機鹽對紅緣擬層孔菌EPS產量的影響Table.3 Effect of different inorganic salts on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.2 部分因子設計實驗及其結果

根據單因素實驗結果，蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4是影響EPS產量的重要因素。首先，通過部分因子實驗從四個因素篩選影響EPS產量的顯著因子，表4為部分因子設計及其對應EPS產量值。由表5實驗回歸模型分析可以看出，影響EPS產量顯著因子為蔗糖（p＜0.05）、酵母粉（p＜0.1），MgSO4·7H2O（p＜0.05），3個因素影響大小順序為蔗糖＞MgSO4·7H2O＞酵母粉。運用Design Expert軟件，得出EPS產量的多元一次回歸模型為：Y=2.78+0.57X1-0.17X2-0.12X3+0.24X4。

2.3 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，在其他區域擬合方程與被近似的函數方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。根據部分因子實驗回歸方程確定正負效應來增加蔗糖和MgSO4·7H2O濃度，同時降低酵母粉濃度，同時將KH2PO4的濃度固定為2g/L。由表6可知，從起點開始，EPS產量逐漸增加直至第4組，此后EPS產量逐漸降低。因此，將第4組的培養基組合（蔗糖180g/L，酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 26g/L，KH2PO42g/L）作為下面中心組合實驗的中心點。

表4 部分因子設計結果Table.4 The result of fraction factor design

表5 部分因子設計多元回歸模型系數評估及其顯著性檢驗Table.5 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of fraction factor design

表6 最陡爬坡實驗設計及其結果Table.6 Experiment design and results of thesteepest ascent path

表7 中心組合實驗結果Table.7 The result of central composite design

表8 中心組合設計多元回歸模型系數評估及其顯著性Table.8 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of central composite design

2.3 中心組合設計實驗及其結果

結合部分因子設計和最陡爬坡實驗結果，進一步使用中心組合對影響EPS產量顯著因子（蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O）濃度進行3因素5水平響應面優化。各因素編碼、水平及結果見表7。由表8、表9方差分析可知，以EPS產量為目標函數的回歸方程的回歸效果顯著（p＜0.0001），回歸方程為Y=4.02+0.12X1-0.046X2+0.040X4+0.015X1X2+5E-03X1X4+5E-03X2X4-回歸模型方差分析結果見表9，模型p＜0.0001，說明模型在α=0.01水平上極顯著。該模型的復相關系數R2=0.9520，失擬項不顯著p=0.1373＞0.05，說明該模型相關性良好。校正決定系數R2=0.9088，說明90.88%的符合度，有很高的可信度。一次項顯著性X1＞X2＞X4；二次項中X12、X22、X42顯著性水平為極顯著，交互項都不顯著。

表9 中心組合設計的多元回歸模型方差分析Table.9 Analysis of variance for the quadratic polynomialmodel of central composite design

2.5 響應面分析結果

由回歸方程所作的響應面立體分析圖如圖4所示，響應面值存在最大值。固定其中兩因素時，酵母粉對響應值EPS產量呈拋物線關系，蔗糖、MgSO4·7H2O趨勢則呈不同程度上升后變為平緩。RSM三維圖坡度表示響應值受各變量因素的影響大小。由圖4可知，蔗糖和酵母粉，MgSO4·7H2O和酵母粉三維圖坡度較蔗糖和MgSO4·7H2O陡峭，其結果說明另兩者因素取值固定時，單因素蔗糖、酵母粉對EPS產量的影響大于MgSO4·7H2O；響應值與3個實驗因素并非線性關系，只有特定條件下，EPS產量才能達到最大值。利用Design Expert軟件，進行分析計算，得到合成EPS的最佳培養基為：蔗糖濃度為186.24g/L、酵母粉濃度為6.91g/L、MgSO4·7H2O 26.71g/L。考慮實際操作，確定最佳培養基成分分別為蔗糖濃度為186g/L、酵母粉濃度為7g/L、MgSO4·7H2O 27g/L，此條件下EPS產量預測值為4.02g/L。為了檢測模型方程的適用性，在響應面最佳培養條件下進行三組平行重復驗證，測得EPS產量平均值為（3.92±0.18）g/L，基本和預測值相近，說明多元二次回歸模型可以準確預測EPS產量。

圖4 實驗因素兩兩交互作用響應曲面圖Fig.4 Response surface polts showing the effects between two experimental factors

3 結論

在單因素實驗基礎上，利用部分因子設計、中心組合設計實驗對紅緣擬層孔菌產EPS的發酵條件進行了響應面優化，建立了EPS與顯著因子蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O 3個因素的二次多項式回歸模型，經驗證實驗證明該模型合理可靠。最終確定紅緣擬層孔菌產EPS的最佳培養基為：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此條件下，EPS產量高達4.02g/L，重復驗證測得EPS產量平均值為（3.92±0.18）g/L，兩者相對偏差小于5%。因此，采用響應面法優化紅緣擬層孔菌培養基組成穩定可行，可為后續紅緣擬層孔菌的液體規模培養及多糖產物的放大制備奠定基礎。

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Optimization of culture medium of Fomitopsis pinicola for exopolysaccharide production by response surface methodology

SHENG Zhi-cun1，HAO Li-min1，2，*，JIA Shi-ru1，TAO Ru-yu1，ZHANG Hong3，LU Ji-ke2，4
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.The Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100010，China；3.The Outpatient Department of Armed Police Forces of General Headquarters，Beijing 100089，China；4.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Response surface methodology was employed to optimize the culture medium for exopolysaccharide production from Fomitopsis pinicola.Exopolysaccharide yield was investigated with respect to the concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O based on these results of single factor experiment.A quadratic regression model was established on a three-variable，five-level center composite design.The optimum concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O were 186g/L，7g/L and 27g/L，resepectively.Under these conditions，the predicted value of EPS yield was 4.02g/L，while the actual value was（3.92±0.18）g/L.So response surface methodology was feasible for optimization of fermentation medium of Fomitopsis pinicola for EPS production.

Fomitopsis pinicola；Fomitopsis pinicola exopolysaccharide；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2014）02-0194-06

2013－12－09 *通訊聯系人

圣志存（1988-），男，碩士研究生，研究方向：發酵工程原理。