小麥苗中超氧化物歧化酶（SOD）提取條件的優化研究

叢 軍，徐 杰，任 飛，張志清

（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

小麥苗中超氧化物歧化酶（SOD）提取條件的優化研究

叢 軍，徐 杰，任 飛，張志清*

（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

利用磷酸鹽緩沖液提取小麥苗中抗氧化組分超氧化物歧化酶（SOD），對磷酸緩沖液pH、抽提時間、熱處理溫度、熱處理時間四個提取工藝參數進行單因素實驗，并采用四因素三水平的響應曲面分析法（RSA）對上述因素的最佳水平范圍進行優化，以鄰苯三酚自氧化法對超氧化物歧化酶的活性進行測定。結果表明，在磷酸緩沖液pH8.0、抽提時間1h、熱處理溫度70℃、熱處理時間15min的最優工藝條件下酶的活性較高，超氧化物歧化酶的活性可達587.60U/mL，此技術為小麥苗的綜合利用提供了新方向。

小麥苗，超氧化物歧化酶（SOD），鄰苯三酚自氧化法，響應面法

小麥苗是禾本科植物小麥的嫩莖葉，具有良好的藥用價值及豐富的營養。《本草綱目》中寫道“麥苗，辛、寒、無毒。主治暴熱、目黃。煮汁濾服之，除時疾狂熱，退胸隔熱，利小腸。作韭食，甚益顏色”[1]。小麥苗生長迅速，莖葉繁茂，柔嫩多汁。新鮮的麥苗富含維生素、礦物質、酶等多種人體所需營養物質[2]。其中麥苗中豐富的SOD、過氧化氫酶可清除氧自由基，分解體內毒素，具有美容，抗衰老的作用。由于小麥苗最佳營養成分時期時效極短，苗高20cm左右就必須收割、利用[3]，使得這一寶貴資源尚未被充分開發利用。

目前國內外已對SOD的機理、純化、應用作了大量的研究，注意力大都集中在以動物血液為來源制取SOD方面上，存在著成本高、含有致熱因子等缺陷[8]。有資料表明，SOD在小麥苗中的含量高達0.1%，小麥苗中SOD活性最大可達400U·g-1（鮮重）[3]。超氧化物歧化酶是一種酸性金屬酶，廣泛存在于動物、植物、微生物體內。SOD能催化超氧陰離子自由基·O2-發生歧化反應，起到提高機體免疫力、延緩衰老并增強對疾病的抵抗力的作用。它不僅在醫學、保健等領域有廣泛的應用[4-5]，而且是制備功能性食品的理想添加劑。

研究表明，緩沖系統的水溶液對酶穩定性好、溶解度大，是提取酶常用的溶劑[6]。超氧化物歧化酶在pH5.3～9.5范圍內，其穩定性較好，對pH不甚敏感[7]，利用磷酸緩沖溶液處理可以使小麥苗中超氧化物歧化酶很好地溶出，此方法簡單易行，對酶活性的影響很小。本研究利用磷酸鹽緩沖液法提取小麥苗中的超氧化物歧化酶，再用鄰苯三酚自氧化法對超氧化物歧化酶的活性進行測定。在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析方法，并以磷酸緩沖液pH、抽提時間、熱處理溫度、熱處理時間這四個因素，設置不同水平對提取條件進行優化，確定了小麥苗中超氧化物歧化酶的最佳提取條件。本文的創新點在于將最佳營養成分時期的小麥苗作為食品功能性成分提取的原料，這就為小麥苗除在榨汁飲用、提取麥綠素以外開辟了新的利用途徑。若能將小麥苗作為提取超氧化物歧化酶這一功能性成分的原料來使用，不但充分利用了小麥苗這一植物資源，而且還能推動小麥的深加工，增加小麥在農業生產中的價值。這對促進小麥資源化利用，推動農業可持續發展，具有深遠的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川麥107 由四川農業大學小麥研究所提供；三羥甲基氨基甲烷（Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd）、焦性沒食子酸、乙二胺四乙酸二鈉、濃鹽酸、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 成都市科龍化工試劑廠，均為分析純。

Thermo ST16R型臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-3100PC型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；Sartorius CP225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；BP-20型pH計 Sartorius。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥苗預處理 割取生長18d左右、長為20cm左右的小麥苗，洗凈、擦干后密封于保鮮袋，放置在冰箱中保存備用。

1.2.2 提取工藝流程 小麥苗→研磨→過濾（雙層紗布）→抽提（4℃）→離心（8000r/min，20min）→上清液移入試管→熱處理→粗酶液→測定SOD活性。

1.2.3 超氧化物歧化酶活性的測定 參照GB/T5009· 171-2003采用鄰苯三酚自氧化法對實驗中酶的活性進行測定[9]，將25℃時每分鐘反應液中SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需的SOD量為一個活力單位。

SOD活性的計算公式如下：

式中：V1—反應液總體積（mL）；V2—測定樣品體積（mL）；N—樣品稀釋液倍數（本實驗的稀釋倍數為2）；ODA—鄰苯三酚的自氧化速率；ODB—樣品光密度值變化速率。

1.2.4 磷酸鹽緩沖液法提取小麥苗中SOD的主要影響因素單因素實驗 稱取預處理后的小麥苗2g于研缽中，加入一定量與pH的磷酸緩沖溶液，4℃冰箱中提取一定時間，分別以料液比（m/v）、磷酸緩沖液pH、抽提時間、熱處理溫度、熱處理時間5個工藝參數為考察因素，以SOD活性（U·mL-1）為指標，進行單因素實驗，每個處理重復3次。

1.2.5 RSA優化超氧化物歧化酶提取工藝 在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken實驗設計的自變量，以SOD活性為響應值，利用Design-Expert 7.0軟件（Response surface analysis，RSA），選取四個對SOD活性影響較顯著的因素，采用4因素3水平的響應面分析方法對小麥苗中SOD的提取工藝進行優化。表1為響應面分析因素與水平。根據Box-Behnken實驗設計，參考丁琳、陳莉等的實驗設計方法[12-13]，綜合以上單因素實驗所得結果，選取緩沖溶液pH、抽提時間、熱處理溫度、熱處理時間四個對SOD活性影響較顯著的因素進行優化。

表1 響應面分析因素與水平表Table.1 Analytical factors and levels of RSM

2 結果與分析

2.1 鄰苯三酚自氧化速率的確定

按照1.2.3的方法，測得30s與90s時光密度值分別為0.936與1.076，兩者之差即為鄰苯三酚自氧化速率，本實驗測得ODA=0.06。

2.2 磷酸鹽緩沖液法提取小麥苗中SOD的主要影響因素分析

2.2.1 料液比對SOD酶活的影響 準確稱取2g小麥苗，在磷酸緩沖液pH為8.0、抽提時間1h、熱處理溫度70℃、熱處理時間15min，料液比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）的條件下，測定SOD酶活，確定最佳料液比。圖1為料液比對小麥苗中SOD活性的影響。由圖1可知，當料液比低于1∶2時，SOD的活性隨料液比的增加而逐漸增大。當料液比為1∶2時，SOD的活性達到最大；而料液比大于1∶2，時SOD的活性逐漸降低。這可能是因為，適當的料液比可以使細胞質和葉綠素的通透性增大，使SOD更好地溶出。但是料液比過高，強離子條件下會使SOD的結構發生改變，穩定性降低，從而影響SOD的活性。因此，綜合考慮，選擇料液比為1∶2為最佳。

圖1 料液比對小麥苗中SOD活性的影響Fig.1 Effect of the ratio of solid to liquid on SOD activity in wheat seedlings

2.2.2 pH對SOD活性的影響 準確稱取2g小麥苗，在料液比1∶2、抽提時間1h、熱處理溫度70℃、熱處理時間15min，pH（7.2、7.4、7.6、7.8、8.0）的條件下，測定SOD酶活，確定最佳pH。圖2為pH對小麥苗中SOD活性的影響。由圖2可知，SOD的活性隨pH的增大而逐漸增大，pH=8時達到最大。這是因為SOD在pH5.3～9.5范圍內，其穩定性較好。在pH=8時接近了酶的最適pH，因此，選擇pH=8為最佳pH。

圖2pH對小麥苗中SOD活性的影響Fig.2 Effect of pH on SOD activity in wheat seedlings

2.2.3 抽提時間對SOD活性的影響 準確稱取2g小麥苗，在料液比1∶2、熱處理溫度70℃、熱處理時間15min，pH為8.0，抽提時間（0.5、1、1.5、2、2.5h）的條件下，測定SOD酶活，確定最佳抽提時間。圖3為抽提時間對小麥苗中SOD活性的影響。由圖3可知，抽提時間在1h之內時，SOD的活性隨抽提時間的增加而增大。當抽提時間在1h時，SOD的活性達到最大，高于1h后SOD的活性開始明顯下降。這說明1h的抽提時間足以使小麥苗中的SOD充分釋放出來，雖然SOD是一類含金屬輔基的酶蛋白，對熱和pH的穩定性較強，但長時間在緩沖溶液中不穩定[11]，因此活性開始降低。因此選擇抽提時間1h為最佳。

圖3 抽提時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.3 Effect of extraction time on SOD activity in wheat seedlings

2.2.4 熱處理溫度對SOD活性的影響 提取溫度對SOD的活性的影響是比較明顯的，適當的提高提取溫度可以促進SOD從細胞質和葉綠體中游離出來，但是溫度過高可能會破壞SOD的結構，使酶失活。本實驗準確稱取2g小麥苗，在料液比1∶2、熱處理時間15min，pH為8.0，抽提時間1h，熱處理溫度（40、50、60、70、80℃）的條件下，測定SOD酶活，確定最佳熱處理溫度。圖4為熱處理溫度對小麥苗中SOD活性的影響。由圖4可知，當熱處理溫度小于70℃時，隨著溫度的升高SOD的活性顯著增加，在70℃時達到最大值。這是由于隨著溫度的升高SOD達到了酶活最適催化溫度。但是當溫度高于70℃后，SOD的活性有所下降，這可能是一方面由于在高溫條件用SOD金屬輔基發生分解、斷裂，導致SOD對熱的穩定性下降；另一方面蛋白質發生變性等化學反應，影響了SOD的活性。

圖4 熱處理溫度對小麥苗中SOD活性的影響Fig.4 Effect of heat treatment temperature on SOD activity in wheat seedlings

2.2.5 熱處理時間對SOD活性的影響 準確稱取2g小麥苗，在料液比1∶2、pH為8.0，抽提時間1h，熱處理溫度70℃，熱處理時間（10、15、20、25、30min）的條件下，測定SOD酶活，確定最佳熱處理時間。圖5為熱處理時間對小麥苗中SOD活性的影響。由圖5可看出，當熱處理時間小于15min時，隨著時間的增加SOD的活性也逐漸增加，在15min時達到最大值。但是當時間大于15min后，SOD的活性開始下降。這可能是因為長時間在較高溫度下SOD結構被破壞，從而影響SOD的活性。因此，綜合考慮，選擇熱處理時間為15min為最佳。

圖5 熱處理時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.5 Effect of heat treatment timeon SOD activity in wheat seedlings

2.3 響應面分析法優化小麥苗中SOD提取工藝

2.3.1 結果分析 表2為Box-Behnken實驗設計及結果，表3為方差分析表。利用Design Expert 7.0軟件對表2中的實驗數據（響應值）進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，分析結果如表3所示。從表3中可以看出，該模型回歸顯著（p＜0.0001），其中X1、X2、 X3、X4、X1X3、X2X3、X2X4對實驗結果的影響是極顯著的，而X1X2、X1X4、X3X4對實驗結果的影響是顯著的；失擬項為0.39，值很小，這說明方程在0.05水平下不顯著，并且該模型的R2=0.9905，R2Adj=0.9811，說明該回歸方程對實際實驗擬合情況較好，證明這種實驗方法是可靠的。各自變量和響應值之間線性關系顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序為X3＞X2＞X4＞X1，即熱處理溫度＞抽提時間＞熱處理時間＞緩沖溶液pH。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table.2 Box-Behnken design and test results

各因素經二次多項回歸擬合后，得到SOD活性對緩沖溶液pH、抽提時間、熱處理溫度、熱處理時間四個因素的二次多項回歸方程為：

Y=292.28－21.34X1+31.38X2+80.35X3－30.15X4－22.60X1X2+48.97X1X3－22.60X1X4－41.45X2X3+60.22X2X4+

式中，Y為SOD活性（U/mL）；X1為緩沖溶液pH；X2抽提時間（h）；X3為熱處理溫度（℃）；X4為熱處理時間（min）。

圖6 pH與抽提時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.6 Effect of pH and Extraction time on SOD activity in wheat seedlings

圖7 pH與熱處理溫度對小麥苗中SOD活性的影響Fig.7 Effect of pH and Heat treatment temperature on SOD activity in wheat seedlings

圖8 pH與熱處理時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.8 Effect of pH and Heat treatment time on SOD activity in wheat seedlings

2.3.2 因素間的交互影響 圖6～圖11直觀的反映了各因素對響應值的影響。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩者交互左右不顯著，而橢圓形則表示兩者交互作用顯著。如圖6所示，在pH與抽提時間的等高線中，沿抽提時間軸向等高線變化密集，而pH軸向等高線變化相對稀疏，說明抽提時間對響應值峰值的影響比pH大。而如圖7所示，在pH與熱處理溫度的等高線中，沿熱處理溫度軸向等高線變化密集，而堿pH軸向等高線變化相對稀疏，說明熱處理溫度對響應值峰值的影響比pH大。又如圖8所示，在pH與熱處理時間的等高線中，沿熱處理時間軸向等高線變化密集，而pH軸向等高線變化相對稀疏，說明熱處理時間對響應值峰值的影響比pH大。在圖9中，沿熱處理溫度軸向等高線變化密集，而抽提時間軸向等高線變化相對稀疏，說明熱處理溫度對響應值峰值的影響比抽提時間大。同樣的在圖10、圖11中，我們可以分別看出抽提時間對響應值峰值的影響大于熱處理時間，熱處理溫度對響應值峰值的影響大于熱處理時間。

表3 方差分析表Table.3 Analysis of varianc

圖9 抽提時間與熱處理溫度對小麥苗中SOD活性的影響Fig.9 Effect of extraction time and heat treatment temperature on SOD activity in wheat seedlings

圖10 抽提時間與熱處理時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.10 Effect of extraction time and heat treatment time on SOD activity in wheat seedlings

圖11 熱處理溫度與熱處理時間對小麥苗中SOD活性的影響Fig.11 Effect of heat treatment temperature and heat treatment time on SOD activity in wheat seedlings

2.3.3 最佳提取工藝的確定 通過Design Expert 7.0軟件求解方程，求出模型的極值點為：X1=8.00，X2=1.00，X3=70.00，X4=15.06，Y=580.49。即最佳工藝條件為磷酸緩沖溶液pH為8，抽提時間為1h，熱處理溫度為70℃，熱處理時間為15.06min，SOD的活性為580.49U/mL，根據實際操作情況，將該實驗條件稍作改動進行三次平行驗證實驗，在提取條件為磷酸緩沖溶液pH為8，抽提時間為1h，熱處理溫度為70℃，熱處理時間為15min下得到SOD的活性為587.60U/mL，實驗結果與模型預計理論值相差很小，其誤差僅為1.2%。這說明，響應面分析法能優化該實驗工藝參數，利用響應面優化得到的實驗參數真實可靠，具有一定的實用價值。

3 討論

3.1本實驗利用磷酸鹽緩沖溶液法提取小麥苗中的超氧化物歧化酶。磷酸鹽緩沖溶液是SOD的良好溶劑，適當的料液比可以使SOD很好的溶出。從圖2與圖4可以看出，小麥苗中SOD在較高的pH與較高的溫度下表現出異常的穩定。這可能是因為，一方面SOD的這種特性一般認為與其是金屬酶有關，主要發揮作用的是其中的金屬輔基。金屬輔基的不同其穩定性也有差異[14]。另一方面也與SOD本身結構有關，例如：Cu/Zn-SOD[15]含有大量β-折疊（45%）其亞基由8股逆向平行肽鏈的β—折疊構成桶狀結構，十分穩定。

3.2從植物組織中提取SOD，要考慮多種干擾因素，如植物組織中的酸類、其他酶類、金屬離子等。所以SOD活力跟蹤測定較之動物組織和血液更復雜。本實驗選擇鄰苯三酚自氧化，該方法所用試劑和儀器比較普通，測試方便，靈敏度高，是目前應用最廣泛的一種測試方法，但對溫度、pH、鄰苯三酚濃度、SOD待測液存放時間等諸因素比較敏感[16]，因此測定時要嚴格控制這些因素。

4 結論

本研究利用磷酸鹽緩沖液法提取小麥苗中的超氧化物歧化酶并采用鄰苯三酚自氧化法對SOD活性進行測定。在單因素實驗的基礎下，進行了響應面優化實驗，得到了最佳提取工藝：磷酸緩沖溶液pH為8，抽提時間為1h，熱處理溫度為70℃，熱處理時間為15min。在該條件下SOD的理論酶活為580.49U/mL，通過驗證實驗得到SOD的實際活性為587.60U/mL，誤差為1.2%。結果表明，該模型可以較好的反應出小麥苗中SOD的提取條件，可將這技術應用到生產實際中。

本實驗以廉價易得的小麥苗作為原料，所采用的試劑價廉、儀器簡單、操作簡便。該技術可為小麥苗深加工提供一定的技術參考依據，同時也為小麥苗的綜合利用提供了新的思路。近年來，利用SOD能清除O2-的功能，SOD產品不斷推出，應用于食品、保健、醫療等諸多行業。因此，利用廉價易得的原料，通過簡單的加工過程而制備具有重要應用價值的SOD，其前景是十分廣闊的。

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Study on optimization of SOD extraction conditions from wheat seedlings

CONG Jun，XU Jie，REN Fei，ZHANG Zhi-qing*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

The phosphate buffer was used to extract SOD，the antioxidant component of wheat seedlings.Four key extraction process parameters factors selected for single-factor tests were phosphate buffer pH value，extraction time，heat treatment temperature，and the heat treatment time.Four factors and three levels of response surface analysis（RSA）was used to determine the optimum levels of four factors above.Then activity of the SOD was measured by adjacent benzene three phenolic autoxidation method.RSA results indicated that the optimal levels of these parameters were as follows：phosphate buffer pH value 8.0，extraction time 1h，the heat treatment temperature 70℃and the heat treatment time 15min.Under these conditions，the activity of the SOD was up to 587.60U/mL.This study provided a new direction for the comprehensive utilization of wheat seedlings.

wheat seedlings；superoxide dismutase；adjacent benzene three phenolic autoxidation method；response surface analysis

Q937.1

B

1002-0306（2014）04-0213-06

2013－07－04 *通訊聯系人

叢軍（1988-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

四川省教育廳重點項目（09ZA081）。