響應面法優化毛葉藜蘆環巴胺的提取工藝

溫 文，薛 兵，康靜靜，劉崇波，溫輝梁，*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌航空大學環境與化學工程學院，江西南昌330063）

響應面法優化毛葉藜蘆環巴胺的提取工藝

溫 文1，薛 兵1，康靜靜1，劉崇波2，溫輝梁1，*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌航空大學環境與化學工程學院，江西南昌330063）

采用響應面法優化了從毛葉藜蘆中提取環巴胺的條件。在單因素實驗的基礎上選取提取液料比，提取時間和提取溫度為隨機因子，以環巴胺提取量為響應值，建立三因素三水平Box-Behnken中心組合設計，并建立數學模型對響應值進行分析。結果表明，提取液料比、提取時間和提取溫度對環巴胺的提取量都有極顯著（p＜0.01）的影響，并確定了最佳的提取工藝參數為：提取液料比9∶1（mL/g），提取時間10.0h，提取溫度48.0℃。在此優化條件下，提取10.0g毛葉藜蘆得到環巴胺的理論量為9.38mg，實際提取量為9.19mg，相對誤差為2.02%。

環巴胺，響應面法，優化

藜蘆為百合科植物，為有毒中藥，世界上約有40種，據《中國植物志》記載，我國有其中13種和1個變種[1]。我國盛產藜蘆，作為中藥用于中風痰壅，癲癇、喉痹不通，及疥癬和惡瘡[2-4]。而通過長期研究，Keeler等[5]在羊群食用的藜蘆屬植物山藜蘆（Veratrum californicum）中找到了一種甾體類生物堿環巴胺。直到90年代中期，環巴胺被發現是一種Hedgehog信號通路的抑制劑[6]，Hedgehog信號通路的突變與多種腫瘤的發病有關聯，人們發現環巴胺對多種腫瘤如母髓質細胞瘤、基底細胞癌、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、小細胞肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等均有顯著的抑制活性[7]，對銀屑病也有療效[8]。因此，以環巴胺開發新型抗癌藥物在國內外已經成為研究熱點，環巴胺已經成為新藥開發的重要研究目標。

目前環巴胺的來源主要有三種途徑，一是從植物中提取[9]，雖然含量較低，但是藜蘆屬植物在我國含量豐富，提取的方法經濟快速；二是全合成，全合成的過程復雜且立體選擇性差，產率很低，僅有1%左右[10]；三是半合成，通過對具有類似環巴胺結構的化合物進行化學轉化或者結構改造。張衛東[11]對還原介芬胺得到環巴胺的方法進行了改進，提高了產率，但是沒有避免使用水合肼和高溫（200℃），條件苛刻不適合大量反應，環巴胺的大量獲得還是受到了限制。

為了增加環巴胺的抗腫瘤活性，人們對環巴胺進行了一系列衍生，包括擴環，環巴胺的3-位羥基氧化[12]，N-原子烷基化[13]細胞實驗發現部分衍生物對Shh阻斷作用有顯著增加。Alfredo C C[14]將擴環后化合物的3-位羥基氧化后再衍生出系列產品，然后將A環內的雙鍵還原得到的新化合物的活性是還原前的10～30倍；同樣對環巴胺進行相同處理達到的環巴胺衍生物活性是環巴胺的20倍。

本文對毛葉藜蘆中的環巴胺進行提取優化，并在單因素實驗的基礎上進行響應面法對影響環巴胺提取量的主要因素進行分析，從而確定最優提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛葉藜蘆 四川荷花池中藥材專業批發市場肖草藥中藥行，產地四川；甲醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉 分析純，天津市永大化學試劑有限公司；三氟乙酸 分析純，天津市大茂化學試劑廠；乙腈 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

JJ-1型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；JJ-200型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；島津LC-10AT型高效液相色譜儀 日本島津制造所。

1.2 實驗方法

1.2.1 環巴胺高效液相色譜檢測條件 運用高效液相色譜對提取出來的環巴胺進行檢測，其最優條件為：色譜柱：WATO-54275 waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.01%三氟乙酸（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～16min（90%～65%A）；分析時長：16min；流速：1.0mL/min；檢測波長：215nm；柱溫：25℃。

1.2.2 環巴胺標準曲線的繪制 配制濃度分別為：0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL的環巴胺標準品，利用高效液相色譜測定紫外吸收。

1.2.3 環巴胺提取量的計算 由高效液相色譜測得的峰面積根據標準曲線得出環巴胺濃度后，環巴胺含量按下式計算：

環巴胺含量（mg）=測量濃度（mg/mL）×樣品體積（mL）

1.2.4 單因素實驗設計 將10g毛葉藜蘆粉碎，以甲醇為提取溶劑，在液料比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL/g），提取時間2、4、6、8、10、12h，提取溫度25、30、35、40、45、50℃的條件下進行提取，再將提取液用旋轉蒸發儀旋干，得到粗提物后用甲醇將粗提物定容于10mL容量瓶中，并用高效液相色譜進行檢測分析。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，用Deign-Expert軟件進行響應面法的提取優化設計，并對結果進行分析[15]。以環巴胺提取量為指標，采用3因素3水平的Box-Behnken的中心設計組合[16]，對液料比、提取時間、提取溫度三個因素進行優化。因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平表Table.1 Factors and levels of Box-Behnken central component experiments design

1.2.6 數據處理 本實驗用Deign-Expert軟件進行響應面法的提取結果進行分析，得出各因素對環巴胺提取的影響程度以及最優的提取工藝參數。

2 結果與討論

2.1 環巴胺標準曲線

環巴胺濃度為x，各個濃度紫外吸收峰面積為y，得到標準曲線為：y=0.7814x+0.0007，R2=0.9997（圖1）。

圖1 環巴胺標準曲線Fig.1 Cyclopamine standard curve

2.2 環巴胺提取的單因素實驗

2.2.1 提取液料比對環巴胺提取量的影響 固定提取溫度為30℃，提取時間為10h對環巴胺提取量進行分析。從圖2中可以看出，隨著液料比的增大，環巴胺的提取量逐步增加，在液料比為8∶1時達到最大，再增加液料比，環巴胺的提取量變小。在最初時，隨著液料比變大，環巴胺在甲醇中的溶解量逐步增大，而在液料比達到8∶1之后，在提取時毛葉藜蘆中同屬于生物堿的藜蘆胺與環巴胺呈現競爭關系，在此液料比之后藜蘆胺競爭性更強，使得環巴胺提取量變少，故選擇提取液料比為8∶1。

圖2 液料比對環巴胺提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on cyclopamine extraction

2.2.2 提取時間對環巴胺提取量的影響 固定提取液料比為8∶1，提取溫度為30℃對環巴胺提取量進行分析。從圖3可以看出，隨著提取時間的加長，環巴胺的提取量增加，在10h時達到最大，但是之后隨之減小，是因為提取時間過長，使得環巴胺分解而降低得率，故選擇提取時間為10h。

圖3 提取時間對環巴胺提取量的影響Fig.3 Effect of time on cyclopamine extraction

2.2.3 提取溫度對環巴胺提取量的影響 固定提取液料比為8∶1，提取時間為10h對環巴胺提取量進行分析。從圖4中可以看出，隨著溫度的提高，環巴胺的提取量也在增大，這說明環巴胺在溶劑中的溶解性增大，但考慮到環巴胺在高溫下容易變質，而且提取量上升幅度已經很小，從節能和防止變質的基礎考慮，最佳提取溫度為45℃。

2.3 響應面法優化環巴胺的提取條件

圖4 提取溫度對環巴胺提取量的影響Fig.4 Effect of time on cyclopamine extraction

實驗設計共有17個點，其中12個析因點，5個中心點。實驗設計方案和結果見表2。

對響應面結果進行多元回歸擬合，從而得到響應回歸方程為：

Y=9.09+0.59A+0.28B+0.22C+0.26AB+0.46AC+ 0.43BC-0.76A2-0.72B2-0.48C2。

回歸統計分析結果見表3。從表3中可以看出，以環巴胺提取量為響應值時，模型p＜0.0001，表明該二次方程模型極顯著。同時失擬項p=0.5258＞0.1，不顯著，模型擬合度較好。該分析統計結果說明實驗方法是可靠的，能很好的描述實驗結果，用該方程代替真實的實驗點進行分析是可行的。

各因素對環巴胺提取率的影響程度大小依次為：A（提取液料比）（p＜0.0001，極顯著）＞B（提取時間）（p=0.0009，極顯著）＞C（提取溫度）（p=0.0035，極顯著）。由方差分析可知，AB、BC、AC之間交互作用都極顯著，即提取液料比與提取時間、提取液料比與提取溫度、提取溫度與提取時間的交互作用對環巴胺提取量都有極顯著的影響，繪制響應曲面圖，如圖5～圖7所示。

表2 Box-Behnken實驗設計及其結果Table.2 Arrangement and results of the three-variable/threelevel central composite design

表3 二次多項模型方差分析表Table.3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

由圖5可知，液料比（A）與時間（B）的等高線呈橢圓形，響應面走勢陡峭，說明一次項A、B對Y有極顯著的影響。環巴胺的提取量隨著提取液料比增大和提取時間加長先增大后減少，且提取量在提取液料比約為8.5∶1提取時間約為10.5h時候達到最大；同理，由圖6可知，一次項A、C對Y有極顯著影響，提取量在提取料液比約為8.5∶1提取溫度約為45℃時達到最大；由圖7可知，一次項B、C對Y有極顯著的影響，提取量在提取時間約為10.5h提取溫度約為45℃時達到最大。

圖5 提取液料比與提取時間交互作用對環巴胺提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction time interaction on the cyclopamine extraction

圖6 提取液料比與提取溫度交互作用對環巴胺提取量影響的響應面圖Fig.6 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

圖7 提取時間與提取溫度交互作用對環巴胺提取量影響的響應面圖Fig.7 Response surface graph of effct of extraction time and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

由軟件分析得出優化的參數為：提取液料比為9.11∶1（mL/g）；提取時間為10.31h；提取溫度為48.36℃，此時環巴胺提取量為9.38mg。為了檢驗響應面法優化環巴胺提取工藝的可靠性，進行驗證實驗，考慮到實際操作性，將優化后的工藝參數調整為料液比9∶1（mL/g）、提取時間為10.0h、提取溫度為48.0℃。進行三次平行實驗，環巴胺平均提取量為9.19mg，相對誤差為2.02%，說明響應面法得到的模型參數準確可靠。

3 結論

本實驗通過響應面法優化了毛葉藜蘆中環巴胺的提取工藝。由方差分析得知，各因素對環巴胺的提取量有極顯著的影響（p＜0.01），影響次序為：A（提取料液比）＞B（提取時間）＞C（提取溫度）。最優工藝參數調整為料液比9∶1（mL/g）、提取時間為10.0h、提取溫度為48.0℃，環巴胺平均提取量為9.19mg，與理論值9.38mg相差2.02%，兩者吻合較好，說明響應面法得到的模型參數準確可靠。

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Optimization of cyclopamine extraction from Veratrum grandiflorum Loes by response surface methodology

WEN Wen1，XUE Bing1，KANG Jing-jing1，LIU Chong-bo2，WEN Hui-liang1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.School of Environment and Chemical Engineering，Nanchang Hangkong University，Nanchang 330063，China）

Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions of cyclopamine from Veratrum grandiflorum.Based on single factor experiments，the liquid-to-material ratio extraction time，extraction temperature were chosen as causal factors and the extraction of cyclopamine was chosen as response value which was then analyzed by models.In this way，the three-factors-three-levels Box-Behnken central composition experiments were designed.Results showed that liquid-to-material ratio，extraction time，extraction temperature had significant effects（p＜0.01）on extraction of cyclopamine.Optimal conditions for achieving the high extraction of cyclopamine were liquid-to-material ratio 9∶1（mL/mg），extraction time 10.0h，extraction temperature 48.0℃. Under these optimized conditions，with 10.0g raw materials extraction get cyclopamine 9.38mg in the abstract，the actual extraction of cyclopamine was 9.19mg，and the model prediction was worth 2.02 percent error.

cyclopamine；response surface methodology；optimization

TS201.1

B

1002-0306（2014）04-0219-04

2013－06－06 *通訊聯系人

溫文（1988-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學。

國家自然科學基金資助項目（21264011，20961007）。