響應(yīng)面法優(yōu)化長柄扁桃中苦杏仁苷的提取工藝

許寧俠，陳 邦，申燁華，*

（1.西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安710077；2.西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，新藥研究所，陜西西安710069）

響應(yīng)面法優(yōu)化長柄扁桃中苦杏仁苷的提取工藝

許寧俠1，2，陳 邦2，申燁華2，*

（1.西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安710077；2.西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，新藥研究所，陜西西安710069）

為了綜合利用長柄扁桃，提高利用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以苦杏仁苷提取率為響應(yīng)值，對長柄扁桃中苦杏仁苷的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的最佳工藝條件為：乙醇濃度90%，料液比1∶6g/mL，提取時間55min，苦杏仁苷的提取率為提取率為86.91%。

長柄扁桃，苦杏仁苷，響應(yīng)面

長柄扁桃屬薔薇科桃屬[1]，具有很強(qiáng)的沙漠生存能力和固沙作用，在沙漠的防治方面起到了重要的作用。其種仁中化學(xué)成分豐富，有脂肪油、蛋白質(zhì)、揮以油及糖苷類等。種仁壓榨后的油粕中，苦杏仁苷的含量為3.7%[2]，含量較為豐富。苦杏仁苷（amygdalin）廣泛存在于杏、蘋果、山楂等薔薇科植物的種子中，屬于芳香族氰苷分子，分子式為C20H27NO11，由一單元苯甲醛、一單元?dú)淝杷岷蛢蓡卧咸烟墙M成[3]，在臨床上有鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖和抗?jié)兊茸饔肹4]。目前苦杏仁苷的提取主要來自于苦杏仁等原料，本課題組對長柄扁桃中苦杏仁苷的提取尚屬首次。對長柄扁桃中的苦杏仁苷進(jìn)行有效的提取，即可增加苦杏仁苷的來源，還可提高長柄扁桃植株的綜合利用價(jià)值。長柄扁桃植株的利用研究較多，除了植株可固沙防沙，其種仁可榨油，油粕可提取蛋白粉、苦杏仁苷，果殼可制備活性炭。所以對長柄扁桃中苦杏仁苷進(jìn)行提取，可提高其利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，還有助于種植區(qū)的可持續(xù)發(fā)展。在后期的研究工作中，應(yīng)對苦杏仁苷的分離純化技術(shù)進(jìn)行研究，為苦杏仁苷的臨床應(yīng)用提供條件。

響應(yīng)面分析法廣泛應(yīng)用于多因素間相互作用的研究，以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，研究多因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化，可在整個區(qū)域上研究因素的最佳組合[5-6]。本課題以苦杏仁苷提取率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化長柄扁桃中苦杏仁苷的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長柄扁桃種仁 榆林神木；水 為超純水；乙醇 天津市化學(xué)試劑廠，分析純；甲醇 西安試劑廠，色譜純；苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品 陜西省藥品生物制品檢驗(yàn)所，含量大于98%，批號：110820-201004。

P230型高效液相色譜、UV230紫外-可見檢測器、SinoChrom ODS-BP色譜柱（200mm×4.6mmi.d.，10μm）、EC2000色譜工作站 大連伊利特儀器有限公司；KQ250B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；WND-100型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦杏仁苷的提取方法 長柄扁桃種仁干燥滅酶，粉碎后石油醚去油，抽濾，揮盡石油醚，為脫脂粕。稱取脫脂粕適量，用乙醇加熱回流提取，提取過程不斷攪拌，提取3次，合并濾液。提取液過濾后趁熱抽濾。利用HPLC對提取液中的苦杏仁苷含量進(jìn)行檢測[7]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 通過對苦杏仁苷的提取因素進(jìn)行篩選后，乙醇濃度、料液比與提取時間對提取率影響顯著，在進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)前，先分別考察乙醇濃度、料液比和提取時間對苦杏仁苷提取率的影響。

在提取過程中，以料比為1∶10，改變乙醇濃度，攪拌回流，提取90min，研究乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）對提取率的影響；以乙醇濃度為80%，提取時間為90min，研究不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL）對提取率的影響；以料液比1∶10，乙醇濃度為80%，分別回流不同時間（10、30、60、90、120min），研究提取時間對提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平 在單因素實(shí)驗(yàn)中，通過改變乙醇濃度、料液比和提取時間，以提取液中的苦杏仁苷含量作為指標(biāo)進(jìn)行研究，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)原理[8]，每個因素選3個水平，每個因素水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼，以提取率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table.1 Factors and levels of the response surface experiment

1.2.4 苦杏仁苷含量的高效液相測定 色譜條件：SinoChrom ODS-BP（200mm×4.6mm i.d.，5μm）色譜柱；UV1201紫外可見檢測器，檢測波長220nm；流動相為V（甲醇）∶V（水）=30∶70，流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。

對照品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品50.00mg于100.0mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得500μg/mL苦杏仁苷對照品溶液，使用前經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過。

1.2.5 苦杏仁苷提取率的計(jì)算 利用HPLC對提取液的苦杏仁苷的含量進(jìn)行測定，按下式計(jì)算苦杏仁苷的提取率：

提取率（%）=（提取液中苦杏仁苷含量（g/mL）×提取液體積（mL））/（脫脂粕質(zhì)量（g）×脫脂粕中苦杏仁苷含量（g/g））×100

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將苦杏仁苷對照品分別配制成濃度為50、100、150、200、250μg/mL的溶液，按色譜條件進(jìn)樣測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=4.7117X-10.124（R2=0.9993），說明在50～250μg/mL線性關(guān)系良好。

圖1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of amygdalin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對提取的影響 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%～80%時，苦杏仁苷的提取率隨乙醇濃度的增加而增加，在80%左右達(dá)到穩(wěn)定，當(dāng)濃度超過80%后，提取率雖然有所增加，但增加幅度不大。原因可能是苦杏仁苷在80%乙醇時基本上已經(jīng)溶出，再增加乙醇濃度對苦杏仁苷的提取率影響不大；同時考慮到乙醇濃度過大，會增加經(jīng)濟(jì)成本，所以選取為70%、80%、90%的乙醇濃度作為響應(yīng)面分析來確定最優(yōu)的提取濃度。

圖2 乙醇濃度對提取的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration to extraction of amygdalin

2.2.2 料液比對提取的影響 由圖3可知，當(dāng)料液比從1∶5增加到1∶15時，提取率也相應(yīng)增加，當(dāng)料液比為1∶15達(dá)到最大，當(dāng)高于1∶15時，提取率反而有所下降。這是因?yàn)殡S著料液比的增大，濃度差提高，有利于傳質(zhì)，而當(dāng)料液比達(dá)到1∶15后，苦杏仁苷的溶出已經(jīng)基本達(dá)到了動態(tài)平衡狀態(tài)，再增加料液比，溶劑量增加，還會加大溶劑回收或濃縮溶液的工作量。綜合考慮，料液比選擇1∶10、1∶15、1∶20作為響應(yīng)面分析的條件，以確定最優(yōu)的料液比。

圖3 料液比對提取的影響Fig.3 The effect of liquid ratio to extraction of amygdalin

2.2.3 提取時間對提取的影響 由圖4可知，隨著提取時間的延長，提取率也相應(yīng)增加，在60min左右即可達(dá)到較高值，再延長時間，提取率有所下降，這是因?yàn)榭嘈尤受盏慕鲂枰欢ǖ臅r間，所以適當(dāng)延長提取時間，提取的時間越長，提取率就越高；在60min時，溶劑與溶質(zhì)之間的物料傳遞比較充分，提取率也相應(yīng)增加；達(dá)到最大值后，再延長時間，提取率不再增加，反而會增加雜質(zhì)的溶出量，同時時間延長還會增加提取成本，所以綜合考慮，繼續(xù)選擇提取時間以30、60、90min作響應(yīng)面分析以確定最優(yōu)的提取時間。

圖4 時間對提取的影響Fig.4 The effect of extraction time to amygdalin

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用SAS軟件進(jìn)行分析結(jié)果見表2，得二次回歸方程為：

Y=2.43+0.045A+0.11B+0.094C-0.025AB+0.13AC+ 0.012BC-0.089A2-0.10B2-0.15C2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2 Results of the response surface experiment

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table.3 Analysis of variance（ANOVA）for optimization of amygdalin

圖5 乙醇濃度與料液比對苦杏仁苷的影響Fig.5 The effect of Ethanol concentration and Solid-Liquid ratio on amygdalin extraction

從表3的分析結(jié)果可以看出，整體模型的“Pro＞F”值為0.0005，小于0.01，說明該二次方程模型高度顯著，此模型是可靠的，模型的決定系數(shù)是95.86%，說明此模型的相關(guān)度很好，即相應(yīng)值的變化有95.86%是來自于所選變量，同時CV值為0.1874，大于0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，說明實(shí)際值與預(yù)測值有很好的擬合度。回歸方程中各變量對指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，也可由Pro＞F值來判斷，由表3可以看出，各因素中一次項(xiàng)B、C是極顯著的，二次項(xiàng)A2、B2、C2也是極顯著的，交互項(xiàng)AC也是極顯著的，即各實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有影響。由F值可知，三個因素的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋咎崛r間＞料液比。交互項(xiàng)響應(yīng)曲面圖見圖5～圖7。

圖6 提取時間與料液比對苦杏仁苷的影響Fig.6 The effect of time and solid-liquid ratio on amygdalin extraction

圖7 提取時間與乙醇濃度對苦杏仁苷的影響Fig.7 The effect of time and ethanol concentration on amygdalin extraction

比較響應(yīng)面最高點(diǎn)，利用回歸方程可確定苦杏仁苷的最佳提取工藝是：料液比為1∶5.9，乙醇濃度為92.0%，提取時間為54.6min，在此條件下，提取率為87.53%。

取長柄扁桃脫脂粕3份，根據(jù)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)條件，校正料液比為1∶6，乙醇濃度為90%，提取時間為55min，按此工藝進(jìn)行提取，測得苦杏仁苷的實(shí)際提取率分別為86.42%、86.81%、87.50%，平均為86.91%，結(jié)果表明，實(shí)際提取率與理論提取率相對誤差為0.71%，說明響應(yīng)面法對苦杏仁苷提取工藝的優(yōu)化條件是可行的。

3 結(jié)論

對長柄扁桃中苦杏仁苷進(jìn)行提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面分析法對乙醇濃度、料液比和提取時間進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件為料液比為1∶6g/mL，乙醇濃度為90%，提取時間為55min，以此條件下提取苦杏仁苷的提取率（86.91%）與理論提取率（87.53%）相差不大，說明此工藝在實(shí)際生產(chǎn)中是合理可行的，也可為大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

[1]蘇貴興，姚玉卿.我國的野生扁桃資源[J].野生植物研究，1983（2）：7-11.

[2]張萍，申燁華，王曉玲，等.高效液相色譜法測定長柄扁桃仁中的苦杏仁苷[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2007，26（10）：50-83.

[3]CHO A Y，CHUNG J，RHIM J H，et al.Detection of abnormally high amygdalin content in food by an enzyme immunoassay[J]. Molecules and Cells，2006，21（2）：313-318.

[4]南京藥學(xué)院.藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：524.

[5]張紅城，尹策，董捷，等.杏花花粉中苦杏仁苷的提取工藝的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（7）：236-241.

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Optimization extracting process of amygdalin from Amygdalus pedunculatus pall by response surface analysis

XU Ning-Xia1，2，CHEN Bang2，SHEN Ye-hua2，*
（1.The Medicine College of Xi’an International University，Xi’an 710077，China；2.Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecule Chemistry of the Ministry Education，Institute of Drug Discovery，College of Chemistry and Materials Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

In order to optimize the extraction of amygdalin from Amygdalus pedunculatus pall to improve its value，the effects of operation parameters were discussed in this research.The response surface methodology was used to optimize influence of these three factors to the extraction.It indicated that the optimum conditions were as follows：the ethanol concentration of 90%，solid-liquid ratio 1∶6g/mL，extraction time 55min，the extraction percentage was 86.91%.

Amygdalus pedunculatus pall；amygdalin；response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306（2014）04-0270-04

2013－07－18 *通訊聯(lián)系人

許寧俠（1973-），女，碩士研究生，主要從事天然植物產(chǎn)品開發(fā)方面的研究。