殼聚糖雙胍鹽酸鹽抑菌活性及其涂膜保鮮圣女果的研究

陳佳陽，羅永祥，陸旺金，傅夏兵，樂學義，*

（1.華南農業大學理學院應用化學系，廣東廣州510642；2.華南農業大學園藝學院，廣東廣州510642）

殼聚糖雙胍鹽酸鹽抑菌活性及其涂膜保鮮圣女果的研究

陳佳陽1，羅永祥1，陸旺金2，傅夏兵1，樂學義1，*

（1.華南農業大學理學院應用化學系，廣東廣州510642；2.華南農業大學園藝學院，廣東廣州510642）

測定了殼聚糖雙胍鹽酸鹽（CGH）對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和番茄絲核菌的抑菌能力；并通過涂膜的方法處理圣女果，測定貯藏過程中果實失重率、硬度、可溶性固形物含量（TSS）、維生素C（VC）含量、細胞膜透性和總酸含量的變化。結果表明，相對于殼聚糖（CTS），CGH對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有較強的抑菌能力，其最小抑菌濃度（MIC）分別為0.31mg/mL和0.62mg/mL；當CGH濃度達到2.00mg/mL時對番茄絲核菌菌絲生長抑制率可達到100%。以質量濃度為3%的CGH涂膜處理的圣女果在（28±2）℃存放12d后，失重率僅為7.5%，硬度仍有21.121N/cm2，TSS為7.2%，VC含量為21.70mg/100g FW（鮮重），膜滲透率為27.4%，可滴定酸含量為0.35%。與對照（CK）相比，顯著保持了果實的品質。

殼聚糖雙胍鹽酸鹽，圣女果，抑菌，保鮮

利用涂膜的技術對果蔬進行保鮮，成本低，易于操作，已受到國內外學者的關注[1-4]。殼聚糖（CTS）屬于天然高分子化合物，無毒、可生物降解，理化性能相對穩定，具有成纖成膜性[5]和抗菌性[6]，目前已經有大量文獻報道其對果蔬具有顯著的抗菌保鮮作用[7-10]。但是，由于殼聚糖整個大分子鏈上有較高密度的分子內和分子間氫鍵使之不溶于水也不溶于堿溶液，只溶于小部分有機酸溶液，導致它在應用上受到極大限制[11]。將具有抑菌作用的小分子基團接枝到殼聚糖上，既能改善殼聚糖的水溶性又能增強其抗菌性和防止小分子抑菌劑對人體的毒害作用[12]。本文將具有廣譜抗菌作用的雙胍基[13]接枝到殼聚糖結構單元上后制得具有一定保鮮抗菌能力的高分子化合物殼聚糖雙胍鹽酸鹽（CGH）。該殼聚糖衍生物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及常見的致使水果腐爛的真菌均具有較好的抑制作用。將CTS應用于圣女果的研究已有報道[14-15]，但將CGH應用于圣女果的保鮮工作目前尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圣女果 市售，選擇果實新鮮，表面光滑，大小、成熟度基本一致，無機械損傷和病蟲害的圣女果進行實驗；金黃色葡萄球菌（S.Aureus）、大腸桿菌（E. Coli）和番茄絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn） 均由華南農業大學資源環境學院提供；殼聚糖（脫乙酰度≥85%） 山東奧康生物科技有限公司；2，6-二氯酚靛酚鈉鹽 為生物純；草酸 優級純；無水乙醇、氫氧化鈉、冰乙酸、標準抗壞血酸（VC） 均為分析純；高嶺土 化學純；殼聚糖雙胍鹽酸鹽 為自制，經元素分析測定其接枝率為50.5%。

DDS-12A型電導率儀 上海精密科學儀器有限公司；果蔬材料硬度測試機 美國Instron公司；PR-α型數顯折光儀 日本ATAGO公司；SW-CI-IF型潔凈工作臺 上海博迅實業有限公司；LRH-250-S（Ⅱ）型微電腦控制恒溫恒濕培養箱 廣東省醫療器械廠。

1.2 CGH的體外抗菌實驗

1.2.1 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用 采用二倍稀釋法[16]測定CTS和CGH對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2 對番茄絲核菌菌絲體徑向生長的影響 將CTS和CGH分別配制成不同濃度的溶液，用1mol/L NaOH調節溶液pH=5～6。配制含藥品濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00mg/mL的PDA培養基，在已經培養成熟的菌落（真菌PDA培養基）邊緣打取直徑5mm供試菌餅移入到含藥培養基中心，28℃恒溫培養，待對照組（CK，0mg/mL）菌落長滿平板時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率[17]。

式中，D空白為對照菌落直徑，D藥品為處理菌落直徑。

1.3 圣女果的涂膜處理

制取0.5%（V/V）殼聚糖乙酸溶液，并用1mol/L NaOH溶液調至pH=5～6；用去離子水溶解不同質量的CGH制成質量分數分別為1%、2%和3%的膜溶液[18]，同時調節pH=5～6。挑選新鮮、且果皮顏色和大小均勻，無明顯病蟲害的圣女果為樣品，隨機分成5組（每組100個果實），其中一組將作為對照。將上述5組分別浸入制好的殼聚糖乙酸溶液中，靜置3min，瀝干，分別放入大小相同的籃中，室溫（28±2）℃下存放。

1.4 測試指標及方法

圣女果于購買當日分別進行重量、可滴定酸（TA）含量、可溶性固形物（TSS）含量、VC含量、果實硬度、果皮細胞膜滲透率指標的測定，貯藏期間每2d測定1次，每次每組隨機抽取果實10個，重復3次。

1.4.1 失重率測定 采用稱重法，分別測定待貯存的圣女果質量（m0）與貯存一定時間后的質量（mt）。

1.4.2 可滴定酸（TA）含量的測定 參照文獻[19]的方法，取10g果肉，用研缽磨碎，加以煮沸、冷卻、去除CO2的蒸餾水25mL，在沸水浴中提取30min，冷卻，過濾，移入50mL容量瓶中，定容至50mL，每次取10mL，加酚酞指示劑2滴，用0.1mol/L NaOH標準溶液滴定至微紅色在1min內不褪色為終點。

式中：N：NaOH標液的摩爾濃度，mol/L；V：消耗NaOH標液的體積，mL；W：樣品用量；K：換量為適當酸的系數（以蘋果酸為標準；K=0.067）。

1.4.3 可溶性固形物（TSS）含量測定 采用PR-32α數顯折光儀進行測定。

1.4.4 VC含量測定 參考2，6-二氯酚靛酚法[20]準確稱取10g左右的圣女果，加入30mL 2%草酸，打成漿狀，離心，準確吸取上清液5mL，用標定好的2，6-二氯酚靛酚鈉鹽滴定。另取5mL 2%草酸作空白對照滴定。

式中，w：100g樣品（鮮重，FW）含VC毫克數，VA：滴定樣品所耗用的染料平均體積，mL；VB：滴定空白對照所耗用的染料的平均體積，mL；VT：樣品提取液的總體積，mL；VS：滴定時所取樣品提取液體積，mL；A：1mL染料能氧化抗壞血酸量，mg/mL；W：待測樣品的質量，g。

1.4.5 硬度的測定 用果蔬材料硬度測試機測定圣女果的硬度。所選擇探頭為圓錐形，基部直徑為4mm，硬度值用N/cm2表示。

1.4.6 細胞膜透性測定 根據文獻[21]將圣女果果肉切成5mm×5mm塊狀，混勻后稱取5.0g于50mL燒杯中，加40mL蒸餾水，用電導率儀測出電導率（P0），浸泡10min后測出電導率（P1），再將燒杯放置于水浴鍋中，加熱煮沸10min后補足失去的水分，冷卻后測定電導率（P2）。

1.5 統計方法

每處理3個重復，數據用SPSS軟件進行統計，用最低顯著性差異法（LSD）在0.05水平上進行顯著性差異檢驗。

2 結果與分析

2.1 體外抑菌實驗結果

2.1.1 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用 通過二倍稀釋法測得CGH對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別為0.31mg/mL和0.62mg/mL，而CTS對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別的0.62mg/mL和1.25mg/mL，由此可得出CGH抑制這兩種細菌的活性強于CTS，并且CGH對G+的抗菌性要強于G-。這可能同菌細胞壁組成相關，大腸桿菌比金黃色葡萄球菌多了一層外層膜（outer membrane），外層膜中除了含有脂多糖、核糖和O抗原外，還有孔蛋白，而這種孔蛋白只允許特定的分子通過，所以CGH對其抑制活性較弱[22]。

2.1.2 對番茄絲核菌的抑制作用 CTS及CGH對番茄絲核菌的抑制作用如圖1所示。

圖1表明，CTS與CGH對番茄絲核菌絲生長都具有抑制活性。當濃度為2.00mg/mL時，CGH對番茄絲核菌的抑制率為100%，而CTS為80.4%，說明CGH的抑菌作用明顯強于CTS。這可能源于CGH胍基易質子化而導致其正電性大于CTS，更有利于吸附在菌體細胞上，擾亂細胞的正常生理活動而抑制病菌的生長。

圖1CTS及CGH對番茄絲核菌的抑菌率Fig.1 The fungistasis activities of various concentrations of CTS and CGH against Rhizoctonia solani Kuhn

2.2 失重率的變化

測定了不同涂膜的圣女果在貯藏過程中果實失重率的變化，結果如圖2所示。

圖2CTS和CGH涂膜對圣女果室溫貯藏期間失重率變化的影響Fig.2 Effect of CTS and CGH coatings on mass loss of cherry tomatoes during room temperature storage

結果表明，平行3次測定失重率偏差很小，導致圖2中偏差線不明顯。由圖2可見，隨著圣女果存放時間延長，各組失重率不斷上升，經過12d室溫存放后，經過3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜處理的圣女果的失重率分別為7.8%、8.9%、8.1%和7.5%，而對照樣為10.4%。在同樣為3%的濃度下，用CGH處理過的圣女果失重率低于CTS，表明3%CGH對圣女果的保鮮作用優于3%CTS。另外，1%CGH和2%CGH涂膜效果不如3%CTS好，原因可能是由于膜厚度不夠，導致果實中水分蒸發相對較快。

2.3 TA含量的變化

測得不同涂膜圣女果在相同存放條件下TA含量的變化如圖3所示。

結果表明，在貯藏過程中，由于存放條件為室溫，溫度和濕度變化較大，導致圣女果中TA含量出現波動，但其總體趨勢是波動下降的。另外，從貯藏后期的結果發現，經過12d后，由3%CTS、3%CGH涂膜處理的圣女果的可滴定酸含量分別為0.32%、0.35%，而對照組可滴定酸含量為0.16%。其中，12d后3% CGH涂膜的圣女果可滴定酸含量是對照組的2倍，這可能源于CGH涂膜處理后減少了圣女果中水分的蒸發，抑制了水果的呼吸，從而延緩了果實新陳代謝的速度。由此可得幾組涂膜處理中，3%CGH對圣女果酸含量的保持效果最好。

圖3 圣女果貯藏過程中TA含量的變化圖Fig.3 Effect of CTS and CGH coatings on TA content of cherry tomatoes during room temperature storage

2.4 TSS含量的變化

測得不同涂膜的圣女果在貯藏過程中可溶性固形物含量的變化如圖4所示。

圖4 圣女果貯藏過程中TSS含量的變化Fig.4 Effect of CTS and CGH coatings on TSS content of cherry tomatoes during room temperature storage

可溶性固形物含量是指該果實中包含的能溶于水的糖、酸、礦物質等占果實總質量的百分率[23]。可溶性固形物的積累與果實在貯藏過程中細胞壁結構的變化和多糖降解為低分子糖相關[24]。當果實成熟后，可溶性固形物含量將呈上升趨勢[25]。結果表明，貯藏6d后，對照組的可溶性固形物含量上升速度增快，12d后達到9.2%，而經3%CGH涂膜的增長速度較緩，12d后可溶性固形物含量為7.2%，并且低于3% CTS涂膜的7.5%。

2.5 VC含量的變化

圣女果中含有豐富的VC，是普通番茄的1.7倍。眾所周知，VC是衡量水果營養價值的重要指標，通常因貯存時間的延長使果實中的VC氧化分解而快速下降，所以常以VC的含量損失來評價水果的品質。測得不同涂膜條件下圣女果在貯藏過程中VC含量的變化如圖5所示。

圖5表明，所有圣女果在貯藏期間VC含量均有所下降，但涂膜組圣女果VC含量降低的速度均小于對照，說明涂膜具有一定的保鮮效果。其原因可能是在果皮中形成的膜阻止了空氣中部分氧的進入而減少VC的氧化。并且研究發現，常溫下貯存12d后，測得經3%CTS處理的圣女果VC含量為21.03mg/100g FW，而3%CGH處理的圣女果VC含量達到21.70mg/100g FW，表明CGH保鮮作用優于CTS。

圖5 圣女果貯藏過程中VC含量的變化圖Fig.5 Effect of CTS and CGH coatings on VCcontent of cherry tomatoes during room temperature storage

2.6 硬度變化

果實的硬度是指果肉抗壓力強弱的程度，果肉抗壓力愈強，果實的硬度就愈大。果實硬度的大小可以反映貯藏過程中及貯藏結束時果實品質的優劣。測得不同涂膜處理的圣女果在貯藏過程中硬度的變化如圖6所示。

圖6 圣女果貯藏過程中硬度的變化圖Fig.6 Effect of CTS and CGH coatings on firmness of cherry tomatoes during room temperature storage

圣女果采收后，使其軟化的生理生化因素很多，但主要是通過果實內果膠物質含量變化引起的。果實中脂氧合酶（LOX）、果膠酶等酶的活性隨果實成熟度的增加而迅速增加，使果實硬度下降[26]。結果表明，在貯藏的中前期，圣女果保持鮮脆狀態，硬度變化不大，而在貯藏后期，果實由于失水硬度迅速下降。并且發現，在常溫條件下存放12d后，空白樣的圣女果硬度為19.139N/cm2，而經過3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜處理的圣女果的硬度分別為21.082、20.101、20.827、21.121N/cm2，表明CTS和CGH對圣女果均有保鮮作用，但是在同是3%的濃度下，CGH對圣女果硬度的保持效果優于CTS。

2.7 細胞膜滲透性的變化

隨著果實采后存放時間的延長，果實中細胞膜滲透性逐漸改變甚至喪失，引起細胞內物質大量外滲[27]，因而細胞膜滲透性可作為果實衰老的重要指標。測得不同涂膜的圣女果在貯藏過程中細胞滲透率的變化結果如圖7所示。

圖7 圣女果貯藏過程中細胞膜滲透率的變化圖Fig.7 Effect of CTS and CGH coatings on ion leakage of cherry tomatoes during room temperature storage

圖7表明，隨著存放期增長，各實驗組圣女果的細胞膜滲透性均逐步增加。存放12d后，測得3%CGH和3%CTS涂膜的圣女果細胞膜滲透率分別為27.4%和31.3%，均明顯低于對照組的42.4%，表明CGH和CTS涂膜都具有保鮮作用。并且發現，從第4d開始，同樣是3%濃度的涂膜，用CGH涂膜處理的圣女果細胞膜滲透率就明顯低于CTS的涂膜處理。由些可見，圣女果在常溫貯藏過程中，3%CGH涂膜處理比3%CTS更有助于保持圣女果細胞組織的完整性。

3 結論

體外抗菌實驗表明，CGH對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和番茄絲核菌的生長抑制作用均強于CTS，當CGH濃度為2.00mg/mL時，可完全抑制番茄絲核菌的生長。與CTS相比，CGH溶液涂膜處理圣女果可顯著減緩果實質量的損失，保持TA、TSS和VC的含量以及果實的硬度，減緩細胞膜滲透率的增長，有效地延緩了果實的衰老過程，起到了保鮮保質的作用。然而，為了進一步提高該類殼聚糖衍生物膜的保鮮作用，其抗菌作用機理有待于進一步研究，需要進一步改善膜力學性能等。

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Effects of chitosan biguandine hydrochloride coating on storage quality of cherry tomato and its antimicrobial activities

CHEN Jia-yang1，LUO Yong-xiang1，LU Wang-jin2，FU Xia-bing1，LE Xue-yi1，*
（1.Department of Applied Chemistry，College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The antimicrobial activities of Chitosan biguandine hydrochloride（CGH）against S.Aureus，E.Coli and Rhizoctonia solani Kuhn were studied，respectively.Cherry tomatoes mass-loss ratio，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content was examined attentively after fresh-keeping process with CGH as coating film.The minimal inhibited concentrations（MIC）against S.Aureus and E.Coli were 0.31 and 0.62mg/mL，respectively.CGH at 2.00mg/mL had a total antifungal effect on Rhizoctonia solani Kuhn.CGH with concentration of 3%coated on the cherry tomatoes showed a better preservation effect after 12d storage under（28±2）℃.The mass-loss，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content were 7.5%，21.121N/cm2，7.2%，21.70mg/100g FW（fresh weight），27.4%and 0.35%，respectively.

chitosan biguandine hydrochloride；cherry tomatoes；antibacterial activity；fresh-keeping

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0306-05

2013－06－21 *通訊聯系人

陳佳陽（1986-），女，碩士研究生，研究方向：生物材料及水果保鮮。

廣東省科技計劃項目（2011B020310005）；華南農業大學211工程基金項目（2009B010100001）。