采后納米氧化鋅對蘋果黑斑病和青霉病的控制

劉瑾瑾，李永才，*，劉昌寧

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

采后納米氧化鋅對蘋果黑斑病和青霉病的控制

劉瑾瑾1，李永才1，*，劉昌寧2

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

通過離體（in vitro）和體內（in vivo）實驗，研究了納米氧化鋅處理對蘋果采后主要致腐病菌Alternaria alternata和Penicillium expansum生長的抑制及對病害的控制效果。結果表明：納米氧化鋅對兩種病菌的菌絲生長均具有明顯的抑制作用，且抑制效果隨濃度的升高而增加，其中20%的納米氧化鋅對A.alternata和P.expansum的抑菌率分別達到86.85%和49.60%，對前者抑制效果顯著優于后者。20%納米氧化鋅處理對A.alternata孢子萌發的抑制較對照下降了87.37%，而15%納米氧化鋅處理對P.expansum孢子萌發的抑制較對照下降了94.56%。同時納米氧化鋅也顯著降低了損傷接種A.alternata和P.expansum蘋果病斑直徑的擴展，其中以5%納米氧化鋅處理效果最好，分別與對照相比降低了76.24%和65.32%，更高濃度處理并沒有增強抑制效果。由此表明，納米氧化鋅可通過直接抑菌作用來減輕蘋果黑斑病和青霉病的發生。

蘋果，納米氧化鋅，互隔交鏈孢，擴展青霉

蘋果（Malus domestica）是我國北方地方廣泛種植的水果，雖然蘋果具有良好的貯藏性，但在貯藏后期腐爛病的發生率仍然較高。蘋果的腐爛病與多種真菌的侵染有關，鏈格孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病以及擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要病害[1]。雖然化學殺菌劑可有效控制蘋果腐爛，但容易造成殺菌劑殘留和環境污染，并能誘導病原物產生抗藥性，從而使其應用受到限制。因此，研究并利用化學殺菌劑的替代物來防治果蔬的病害已勢在必行[2]。

氧化鋅（ZnO）是一種無機金屬型氧化物，能夠補充人體必須的礦物元素鋅，而且納米ZnO與人體細胞有很好的組織相容性[3]，并具有極好的抗氧化和抗腐蝕能力，高的熔點，良好的機電耦合性、屏蔽紫外線能力及殺菌除臭性[4-5]，使其在光電器件、化工、涂料、醫藥等眾多方面有著廣泛的應用。目前，納米氧化鋅的抗菌作用研究主要集中于細菌方面，研究發現納米氧化鋅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抗菌性能，且對大腸桿菌的殺菌效果好于金黃色葡萄球菌，其殺菌機理是利用納米氧化鋅產生的活性氧種造成微生物損傷而實現抗菌，與其光催化機理相似[6-7]。盧亢[8]還發現負載納米氧化鋅的海藻酸纖維能夠在24h內殺滅溶液中2×106cfu/mL的大腸桿菌和4×103cfu/mL的金黃色葡萄球菌，隨鋅含量增加，其抗菌能力提高。為了進一步確定納米氧化鋅對細菌的作用方式和機理，江霞等[9]研究表明，ZnO與大腸桿菌K88作用時，首先被吸附到大腸桿菌K88的表面，隨著作用時間的延長，菌體的細胞壁被破壞，細菌的形態也隨之發生改變，這會使菌體對滲透壓的敏感性增強，最終破裂死亡。近年來研究還發現納米ZnO能有效的抑制鐮刀菌[10]、灰葡萄孢和擴展青霉[11]等真菌的生長。但有關納米氧化鋅對蘋果A.alternata和P.expansum的體外抑菌實驗及對采后病害的控制的研究尚未見報道。因此，本文擬采用離體（in vitro）和體內（in vivo）實驗，研究不同濃度納米氧化鋅對蘋果A.alternata和P.expansum的體外抑制效果和對損傷接種蘋果病斑直徑的影響，以期為蘋果采后病害的防治提供安全有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試紅富士蘋果 2013年4月購于蘭州市安寧區桃海農貿市場，選擇外觀整齊，大小均勻，無病蟲害的果實，單果包紙，紙箱包裝后運抵本校實驗室，室溫（25±2）℃貯藏待用；納米氧化鋅（20%濃度） 購于江蘇逸振科技有限公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；VXH-3型微型漩渦混合器 上海躍進醫療器械廠；CX21FS1C型生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業有限公司；DHP-9272B型恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制作 參照文獻[12]中的方法并進行修改。制作馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PDA，培養基成分：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯切碎，加水煮沸30min后過濾。同時將糖和瓊脂分別溶解后與馬鈴薯過濾液混合，并定容至1000mL。分裝在三角瓶中進行高壓滅菌。滅菌后制備平板PDA。

1.2.2 病原菌的分離純化 參照文獻[12]中的方法。分別采集典型蘋果黑斑病和青霉病的病果，用70%酒精表面消毒，無菌水沖洗后，切取病健交界處組織，在無菌操作條件下移置到馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA平板上，于25℃保溫培養，待長出分生孢子后，進行單孢分離、純化后在PDA培養基上保存待用。

1.2.3 不同濃度納米氧化鋅處理對A.alternata和P.expansum菌落直徑的影響 參照范青等[13]方法，先分別將1mL 5%、10%、15%和20%的納米氧化鋅溶液溶于滅菌后的150mL PDA培養基中，以不添加納米氧化鋅作為對照，混合均勻后再分別倒入90mm的培養皿內，待培養基冷卻后，將用無菌打孔器打好的A.alternata和P.expansum菌餅（直徑10mm）接種于培養基中央，25℃避光培養。當對照皿中菌體長至培養皿邊緣時，測定病斑直徑。并按下式計算抑菌率。每處理設平行3個，重復3次。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-原菌餅直徑）×100

1.2.4 孢子懸浮液的制備 參照文獻[14]中的方法并修改。取25℃下培養7d的帶菌PDA平皿一個，加入含0.05%Tween80的無菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的A.alternata和P.expansum孢子，然后轉入50mL三角瓶中，在微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋至所需濃度（1×105孢子/mL）。

1.2.5 不同濃度納米氧化鋅處理對A.alternata和P.expansum孢子萌發的影響 參照孫小娟[15]方法。用打孔器取直徑為10mm的2%瓊脂培養基并將其置于滅菌的載玻片上，然后分別加入10μL 5%、10%、15%和20%納米氧化鋅溶液于培養基上，以添加相同量的無菌水作為對照，再在其上加入10μL孢子懸浮液。置于25℃下，連續數小時鏡檢萌發率，直到對照基本完全萌發。每次鏡檢100個孢子，重復3次。

1.2.6 不同濃度納米氧化鋅處理對損傷接種蘋果病斑直徑的影響 參照畢陽[16]方法并修改。選擇外觀整齊，無病蟲害的蘋果果實，2%NaClO進行浸泡消毒2～5min，再用清水沖洗掉，待晾干后用70%酒精表面消毒，再用滅菌鐵釘（直徑3mm）在果實上均勻刺3mm深的傷口4個，15min待孔內汁液晾干后，分別向孔內注射1×105個/mL的A.alternata孢子懸浮液20μL，3h后，再分別用濃度為5%、10%、15%、20%的納米氧化鋅溶液浸泡3min。用同樣的方法接種P.expansum，并用同樣濃度的納米氧化鋅進行處理，以接種后無菌水處理為對照。果實處理后，用PE薄膜包裹，在（20±2）℃下貯藏。每處理用果3個，每處理重復3次。

1.3 數據處理

接種青霉的果實在8d后測定發病率及病斑直徑，接種鏈格孢的果實在10d后測定發病率及病斑直徑。發病率以發病病斑數占接種病斑數的百分率計，病斑直徑采用十字交叉法測量。數據處理采用Excel 2007和SPASS17.0統計軟件進行鄧肯氏多重差異分析（p＜0.05）。柱形圖中豎線代表標準誤差，不同字母表示在p＜0.05水平上的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 納米氧化鋅處理對A.alternata和P.expansum菌落直徑的影響

納米氧化鋅處理可顯著抑制A.alternata和P.expansum菌落直徑的擴展，且抑制效果隨濃度的升高而增強（圖1A，圖1B）。其中5%的納米氧化鋅顯著抑制了A.alternata菌落生長（p＜0.05），菌落直徑僅為對照的47.32%，當濃度逐漸增至20%時，菌落直徑僅為對照的23.49%（圖1A）。P.expansum對納米氧化鋅處理表現出較好的耐受性，當濃度增至20%時才明顯抑制P.expansum的菌落擴展，菌落直徑僅為對照的66.43%（圖1B），可見納米氧化鋅能有效的抑制該菌的生長。

圖1 納米ZnO處理對A.alternata（A）和P.expansum（B）菌落直徑的影響Fig.1 Effects of nano-zinc oxide on mycelial growth of A.alternata（A）and P.expansum（B）

2.2 納米氧化鋅處理對A.alternata和P.expansum孢子萌發的影響

圖2 納米氧化鋅處理對A.alternata（A）和P.expansum（B）孢子萌發的影響Fig.2 Effects of nano-zinc oxide on spore germination of A.alternata（A）and P.expansum（B）

納米氧化鋅可有效抑制A.alternata（圖2A）和P. expansum（圖2B）的孢子萌發。在5%～20%的處理濃度范圍內，二者的孢子萌發率均顯著低于對照。當濃度為5%時，A.alternata和P.expansum的孢子萌發率分別為對照的39.07%和18.13%，隨著納米氧化鋅濃度的增加抑制效果也越好，當濃度為15%時，A.alternata和P.expansum的孢子萌發率與同期對照相比分別降至13.54%和29.99%；當濃度進一步增加至20%時，納米氧化鋅對A.alternata與P.expansum孢子萌發的抑制并未進一步增強，與15%濃度納米氧化鋅相比，差異不顯著（p＜0.05）。

2.3 納米氧化鋅處理對損傷接種病斑直徑的影響

納米氧化鋅處理可有效抑制損傷接種蘋果病斑直徑的擴展，其中以濃度為5%時的處理效果最好，對損傷接種A.alternata（圖3A）和P.expansum（圖3B）病斑直徑的抑制分別為同期對照的23.76%和34.68%。但隨著濃度的升高，A.alternata病斑直徑并沒有減小，且高濃度對病斑直徑的抑制效果差異不顯著（p＜0.05）。同樣，5%～20%的納米氧化鋅處理均能顯著減小損傷接種P.expansum蘋果的病斑直徑，各處理病斑直徑均明顯低于對照，其中15%和20%濃度的納米氧化鋅處理后，蘋果病斑直徑分別為對照的43.12%和43.55%，但二者之間無顯著差異。

圖3 納米氧化鋅處理對損傷接種A.alternata（A）和P.expansum（B）蘋果病斑直徑的影響Fig.3 Effects of nano-zinc oxide on lesion diameters of apple inoculated with A.alternata（A）and P.expansum（B）

3 討論

本研究結果表明，納米氧化鋅處理可有效的抑制A.alternate和P.expansum的菌落生長和孢子萌發。尤其菌落生長的結果發現隨著納米氧化鋅的濃度的增加，其對兩種真菌的抑制效果亦顯著增加，且納米氧化鋅對A.alternate的抑制作用較P.expansum強，可見納米氧化鋅對不同病原物的抑制作用存在差異，這可能是由于不同病原物對其的敏感性不同或納米氧化鋅對不同病原物的作用方式不同。Lili等[11]研究發現納米ZnO對兩種植物真菌B.cinerea和P.expansum的抗菌機制不同，他們認為納米ZnO是通過破壞細胞的功能和引起真菌菌絲變形來抑制B.cinerea的生長，而對P.expansum則是通過抑制分生孢子梗和分生孢子的生長來抑制其生長。而Haghighi等[17]的研究也表明TiO2/ZnO納米復合材料能夠在可見光下有效地光降解白念珠菌的生物膜從而抑制白念珠菌的繁殖。另外何臨海等[18]還發現納米ZnO對其他真菌具有良好的抗菌作用，但其具體作用機理尚需進一步研究。

納米材料因其粒徑及各種特殊的性質，已廣泛應用于催化、生物醫藥、精細化工等多個行業，其在果蔬防腐保鮮上的應用已成為目前的研究熱點。Maneerat等[19]用納米TiO2粉末和涂有TiO2的塑料薄膜對P.expansum和果實進行實驗，將青霉菌孢子和TiO2粉末均加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）中，發現光催化型TiO2能夠有效減少病原真菌孢子的萌發。另外，隨著TiO2添加量的增加，它通過光催化反應抑制青霉菌的能力越強，培養基中活的菌落數越少，且無論選擇不同種類的果實接種擴展青霉，納米TiO2粉末和涂有TiO2的膜都表現出了抗真菌活性，控制了果實的腐爛。此結果說明二氧化鈦光催化反應對擴展青霉顯示了抗菌活性，其對控制采后病害存在巨大潛力。本研究結果顯示，納米氧化鋅處理可抑制損傷接種蘋果果實的青霉病和黑斑病的病斑擴展，其中5%的納米ZnO對蘋果青霉病和黑斑病的抑制效果最好，隨著濃度的增大，抑制效果并沒有增強，這可能與納米ZnO的作用機理[20]有關，即在一定濃度下，隨著納米ZnO質量濃度的提高，光催化作用及鋅離子溶出原理增強，二者之間也具有協同或相加作用從而發揮更強的抗菌作用，但超過一定濃度后，納米氧化鋅的凝聚作用也增強，使得局部鋅離子濃度降低，反而影響了抗菌作用的發揮。另外高濃度納米氧化鋅可能影響果實的生理狀態而降低了對病原物的抗性，具體原因還需進一步探討。

4 結論

4.1 5%～20%的納米ZnO均能抑制A.alternate和P.expansum菌落生長，且抑制效果隨著濃度的增加而增加，對A.alternate的抑制效果優于P.expansum。

4.2 納米ZnO可明顯抑制A.alternate和P.expansum的孢子萌發，且作用效果不同。納米ZnO濃度從5%增加到20%時，A.alternate的孢子萌發率從39.1%降到12.6%，而P.expansum在15%時孢子萌發率最低，僅為5.4%。

4.3 納米氧化鋅處理可抑制損傷接種A.alternata和P.expansum蘋果果實的病斑擴展，在納米ZnO濃度為5%～20%范圍內，抑制效果并沒有隨濃度的升高而增強，其中，5%的納米氧化鋅對蘋果青霉病和黑斑病的控制效果最好。

綜上所述，雖納米ZnO在果蔬采后病害控制中具有潛在的應用價值，但其具體作用機理及采后規范化應用技術還需進一步深入研究。

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Effects of nano-zinc oxide treatment on black spot and blue mold of postharvest apple

LIU Jin-jin1，LI Yong-cai1，*，LIU Chang-ning2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

The effect of nano-zinc oxide at different concentrations against A.alternata and P.expansum of pathogenic bacteria in postharvest apple was demonstrated.Results indicated that nano-zinc oxide inhibited significantly the mycelium growth of A.alternata and P.expansum，and the inhibition efficacy was greatly enhanced when the concentration of nano-zinc oxide was increased.The inhibited ratio of 20%of nano-zinc oxide was respectively up to 86.85%and 49.60%，the former inhibitory effect was significantly better than the latter.The spore germination of A.alternata were 87.37%lower than the control after treatment with 20%zinc oxide.While the concentration of 15%zinc oxide treatment on P.expansum spore germination，the germination rate had dropped by 94.56%compared with the control.Lesion diameter of apple inoculated with A.alternata and P.expansum were decreased by nano-zinc oxide treatment when concentration at 5%showed the most effective，the lesion diameter reduced by 76.24%and 65.32%compared with the control.The higher concentration treatment did not increase the effect.It was suggested that nano-zinc oxide treatment could directly inhibit pathogens to decrease black spot and blue mold of postharvest apple.

apple；nano-zinc oxide；alternaria alternata；penicillium expansum

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0327-04

2013－05－27 *通訊聯系人

劉瑾瑾（1989-），女，碩士研究生，研究方向：采后生物學。