嗜酸乳桿菌對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物區系的影響

王婷婷，李丹鳳，劉 賓，林海君，霍貴成

（東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

嗜酸乳桿菌對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物區系的影響

王婷婷，李丹鳳，劉 賓，林海君，霍貴成*

（東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

分析了小鼠在感染大腸桿菌O157∶H7期間腸道微生物區系的變化及嗜酸乳桿菌KLDS AD1對其腸道微生物的調節作用。結合小鼠表象特征，探討了嗜酸乳桿菌KLDS AD1對小鼠腹瀉的治療效果。研究將小鼠分成3組，分別是PBS對照組、大腸桿菌-PBS對照組和大腸桿菌-KLDS AD1組，對實驗組小鼠連續7d灌胃大腸桿菌致病后，再連續7d灌胃嗜酸乳桿菌KLDS AD1，期間采集小鼠糞便利用選擇性培養基對菌群作平板計數。結果表明：嗜酸乳桿菌KLDS AD1可以極顯著地提高感染大腸桿菌O157∶H7小鼠的體重（p＜0.01）；小鼠在感染大腸桿菌O157∶H7后糞便中致病性大腸桿菌、腸桿菌和腸球菌等條件致病菌數量顯著增加（p＜0.05），乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌顯著減少（p＜0.05）。灌胃嗜酸乳桿菌KLDS AD1后，小鼠糞便中致病性大腸桿菌、腸桿菌和腸球菌均顯著降低（p＜0.05），而乳酸菌和雙歧桿菌增加極顯著（p＜0.01）。證實嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物平衡具有一定的調節作用，對其引起的腹瀉有一定的治療效果。

嗜酸乳桿菌，大腸桿菌，腸道微生物，微生態平衡，疾病

出血性大腸桿菌O157（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）是一種食源性致病菌，能引起以急性出血性腹瀉為典型特征的疾病，典型菌株為EHEC O157∶H7，主要引起嬰幼兒腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒癥等[1]。由于抗生素具有耐藥性、抗藥性、殘留性及毒副作用，在臨床上用于治療疾病時不僅影響動物和人類的健康，而且還導致“超級病毒”的出現，威脅人類的生存。研究表明，一些益生菌能有效地預防和治療大腸桿菌引起的腹瀉[2-3]，作為一種抗生素替代品，受到越來越多的關注。

嗜酸乳桿菌廣泛存在于人和一些動物的腸道中，是益生菌中最具代表性的菌種。嗜酸乳桿菌通過競爭定殖位點、產生有機酸如乳酸和醋酸降低腸道pH、產生細菌素、產過氧化氫等[4]抑制病原菌如致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的定殖生長[5]；通過調節腸道微生物區系[6-7]，預防腹瀉等腸道疾病的發生[8-9]，維護人類健康。

本研究以嗜酸乳桿菌KLDS AD1為目標益生菌，通過建立腸道菌群失調動物模型和灌喂益生菌方法，采用體外微生物培養技術，研究BALB/c小鼠在感染O157∶H7期間及感染后補充嗜酸乳桿菌KLDS AD1期間腸道微生態變化，分析小鼠在患病和補充KLDS AD1期間腸道微生物變化的差異，旨在從腸道微生物區系的動態變化來探討嗜酸乳桿菌KLDS AD1對腹瀉小鼠疾病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7 ATCC 43889） 由黑龍江省出入境檢驗檢疫局提供；嗜酸乳桿菌KLDS AD1（Lactobacillus acidophilus KLDS AD1） 購自東北農業大學教育部乳品科學重點實驗室菌種庫；BALB/c小鼠，雌性，清潔級，6～8周 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，保持飼養環境溫度（23±2）℃，每天人工燈光照明12h，標準小鼠飼料喂養，自由飲水；乳酸菌選擇性培養基（M 17）、雙歧桿菌選擇性培養基（TPY）、腸桿菌選擇性培養基（VRBDA）、大腸桿菌選擇性培養基（麥康凱培養基）、腸球菌選擇性培養基（疊氮鈉-結晶紫-七葉苷培養基） 購自青島海博生物有限公司。

DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海-恒科技有限公司；HVE-50HIRAYAMA全自動高壓滅菌鍋、DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DH-101-3BS電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市中環實驗電爐有限公司；XK96-A快速混勻器 姜堰市新康醫療器械有限公司；Model 680酶標儀 美國Beckman公司；VD-1320潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LD4-2低速離心機 北京醫用離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 灌胃液的制備 將培養至穩定期（18h）的嗜酸乳桿菌KLDS AD1和大腸桿菌菌液5000×g，4℃，10min離心收集菌體，無菌PBS清洗三次，懸浮于一定體積的無菌PBS，調整菌濃度108CFU/mL，4℃儲存備灌胃[10-11]。

1.2.2 實驗動物設計 實驗將小鼠分成三組（Ⅰ組：PBS，Ⅱ組：大腸桿菌-PBS，Ⅲ組：大腸桿菌-嗜酸乳桿菌）。每天中午12：00灌胃，灌喂體積按10mL/kg（菌懸液/小鼠體重）進行[12]。實驗設計方案如表1所示。

表1 小鼠分組及灌胃設計表Table.1 Grouping of mice and corresponding intragastric administration

1.2.3 小鼠的表象觀測 在實驗小鼠灌胃期間，每天觀察并記錄各組小鼠生長狀態，包括進食情況、外觀毛發、糞便形態和體重。

1.2.4 小鼠腸道菌群的檢測 每天早上9∶00用逼迫法無菌采取小鼠糞便，將其溶于相應體積的無菌生理鹽水中[13]，在漩渦振蕩器上將糞便充分溶解，進行10倍梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行平板計數，每個稀釋做3個平行。VRBDA和麥康凱培養基在37℃微好氧條件下培養24h，腸球菌和TPY培養基在37℃厭氧條件下培養72h，M17培養基在35℃厭氧條件下培養72h，取特征性菌落進行形態鑒定，計數平板中菌落數[14]，計算出每g糞便中的菌含量（cfu/g），結果以活菌數對數值lg cfu/g表示[15]。

1.2.5 數據處理 實驗數據采用x±SD表示，EXCEL軟件做t-檢驗。受試樣品是否具有調節腸道菌群作用的判斷參考趙勝娟等的實驗方法[16]。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠表象及體重的影響

在實驗小鼠灌喂期間，每天觀察各組小鼠生長狀態，包括進食情況、外觀毛發、糞便形態和體重。當小鼠出現水樣稀便，進食量減少或毛發無光澤時，可以判斷小鼠已經患病。本實驗通過對小鼠的表象觀察發現，實驗第4d，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠開始精神萎靡，并伴有不同程度的腹瀉現象，小鼠毛發無光澤，進食量減少，表現出明顯的病癥，說明病變模型建立成功。從第8d開始，Ⅲ組小鼠在灌喂L.acidophilus KLDS AD1后進食量逐漸增加，病癥有所緩解。

圖1 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠體重的影響Fig.1 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on weight of mice infected with E.coli O157∶H7

體重變化見圖1。由圖1可知，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠體重在開始灌喂大腸桿菌起就開始明顯減少。從第9d開始，Ⅲ組小鼠體重有所上升，雖仍低于空白組，但與Ⅱ組未補充L.acidophilus KLDS AD1的小鼠相比較，體重差異極顯著（p＜0.01），說明L.acidophilus KLDS AD1可以緩解小鼠由于感染大腸桿菌O157∶H7造成的體重減輕、腹瀉等癥狀。

2.2 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物區系的影響

2.2.1 L.acidophilus KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道致病性大腸桿菌的影響 大腸桿菌作為腸道條件致病菌在菌群失衡的情況下使機體免疫力下降，引起相應的腸道疾病。

圖2 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道致病性大腸桿菌的影響Fig.2 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on Escherichia coli of mice infected with E.coli O157∶H7

由圖2可知，在小鼠灌喂大腸桿菌期間，其腸道內致病性大腸桿菌的數量明顯增加，且在第7d達到最大值，這與小鼠患病表象特征是相對應的，說明腸道致病菌的增加已經引起疾病的發生。Ⅱ組在第8d停止灌喂大腸桿菌后致病性大腸桿菌的數量仍處于較高水平。對Ⅲ組小鼠灌喂L.acidophilus KLDS AD1后，腸道內的致病性大腸桿菌數量明顯減少，活菌數量級從8減少到6，在第11d達到空白組的水平，并且與Ⅱ組未補充L.acidophilus KLDS AD1的小鼠腸道內致病性大腸桿菌有顯著性差異（p＜0.05），說明L.acidophilus KLDS AD1對腸道內的大腸桿菌具有明顯的抑制或排斥作用。

2.2.2 L.acidophilus KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸桿菌類的影響 腸桿菌為條件致病菌，既包括有益菌也包括有害菌，當機體處于健康狀態時，有益菌占優勢，機體維持正常，當受到外界干擾或自身機體失調時，有害菌數量增加，從而引起機體發生病變。

圖3 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸桿菌的影響Fig.3 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on Enterobacteria of mice infected with E.coli O157∶H7

由圖3可知，Ⅰ組小鼠腸道內腸桿菌數量相對較低且保持穩定，只是從7d開始有上升的趨勢，在15d時增加了一個數量級，可能是由于小鼠個體機能的差異所致，相對于其他兩組的變化，空白組仍在可控制之內[15]。Ⅱ組和Ⅲ組在灌喂大腸桿菌后腸桿菌數量明顯上升，活菌數量級分別由6增加到8和9，且Ⅱ組在第9d停止灌喂大腸桿菌后仍有上升的趨勢。在灌喂L.acidophilus KLDS AD1后，Ⅲ組小鼠腸道內腸桿菌數量開始下降，在第15d，與Ⅱ組未補充L.acidophilus KLDS AD1的小鼠有顯著性差異（p＜0.05），與Ⅰ組差異不顯著（p＞0.05），說明L.acidophilus KLDS AD1可以有效地抑制腸道內的條件致病菌。

2.2.3 L.acidophilus KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸球菌的影響 由圖4可知，三組小鼠腸道內腸球菌數量都有所上升，且灌喂大腸桿菌的Ⅱ組和Ⅲ組與Ⅰ組沒有顯著性差異（p＞0.05），說明大腸桿菌在前期對腸道內腸球菌影響較小，可能是由于小鼠腸道微生物對其有一定的調節作用，或者是小鼠自身對致病菌有一定的防御能力。Ⅱ組腸球菌在第9d仍保持較高水平，結合小鼠的表象特征發現，雖然停止灌喂大腸桿菌，但體內較多的大腸桿菌已經導致腸道內微生物菌群失衡，使得條件致病菌數量增加，從而引起腹瀉的發生，而Ⅲ組在補充了L.acidophilus KLDS AD1后，腸球菌數量明顯下降，從第11d開始與Ⅱ組相比具有顯著性差異（p＜0.05），說明L.acidophilus KLDS AD1可以通過抑制腸道內條件致病菌而調節腸道微生物菌群平衡，從而抑制腹瀉的發生。

圖4 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸球菌的影響Fig.4 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on Enterococcus of mice infected with E.coli O157∶H7

2.2.4 L.acidophilus KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道乳酸菌的影響 乳酸菌作為益生菌和腸道微生物的主要成員，具有調節腸道微生態平衡和增強機體免疫系統的功能，乳酸菌等有益菌的變化與機體健康有密切的關系。

由圖5可知，Ⅰ組乳酸菌數量維持在較高水平，Ⅱ組和Ⅲ組在灌喂大腸桿菌后乳酸菌類數量下降，第5d時與Ⅰ組具有顯著性差異（p＜0.05），其中Ⅱ組在停止灌喂大腸桿菌后仍有下降的趨勢；Ⅲ組補充L.acidophilus KLDS AD1后，于第9d后乳酸菌類數量明顯增加，甚至超過Ⅰ組，與Ⅱ組相比，差異極顯著（p＜0.01）。說明L.acidophilus KLDS AD1在抑制有害菌的同時，也增加了有益菌的生長，并改善了患病小鼠腸道內微生物菌群。

2.2.5 L.acidophilus KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道雙歧桿菌的影響 由圖6可知，Ⅰ組雙歧桿菌數量相對穩定，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠在灌喂大腸桿菌后第3d數量下降顯著（p＜0.05），其中Ⅱ組小鼠在停止灌喂大腸桿菌后仍有下降的趨勢；Ⅲ組小鼠補充L.acidophilus KLDS AD1后，雙歧桿菌數量明顯增加，到15d幾乎增加三個活菌數量級，并與未補充L.acidophilus KLDS AD1的Ⅱ組相比，差異性極顯著（p＜0.01）。說明L.acidophilus KLDS AD1對腸道雙歧桿菌的增殖具有明顯的促進作用，對感染大腸桿菌后腸道微生物菌群失調具有明顯的改善作用。

圖5 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠乳酸菌的影響Fig.5 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on Lactobacillus of mice infected with E.coli O157∶H7

圖6 嗜酸乳桿菌KLDS AD1對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠雙歧桿菌的影響Fig.6 Effect of L.acidophilus KLDS AD1 on Bifidobacterium of mice infected with E.coli O157∶H7

2.3 討論

實驗初期，小鼠腸道中乳酸菌和雙歧桿菌初始濃度較高，可以在短時間內通過與病原菌競爭黏附位點、釋放抑菌物質等作用抑制病原菌的繁殖，然而持續增加的大腸桿菌O157∶H7利用腸道內蛋白質和氨基酸產胺，刺激黏膜導致內毒素、外毒素的吸收，致使腸道內滲透壓升高，使小鼠在第3d開始出現腹瀉現象。腸道內營養物質被致病菌過多利用致使乳酸菌和雙歧桿菌數量減少，條件致病菌大量繁殖，擾亂了腸道微生物平衡，進而會引起消化不良、腸炎、腹瀉等一系列腸道疾病，及時補充益生菌對治療腸道疾病具有顯著的作用[17]。嗜酸乳桿菌KLDS AD1的補充不僅增加了乳酸菌本身的活菌數，而且促進了雙歧桿菌的繁殖，并減少了大腸桿菌、腸桿菌和腸球菌的數量。結合體外實驗分析，一方面是由于嗜酸乳桿菌KLDS AD1對大腸桿菌等致病菌具有抑制作用[5]，另一方面，益生菌可以增強腸道黏膜免疫屏障作用，調節免疫系統，預防和治療腸道感染[18]。雙歧桿菌的增加可能是由于嗜酸乳桿菌KLDS AD1產酸能力強[19]，在代謝過程中產生乳酸等有機酸，降低了腸道內pH，并產生一些短鏈脂肪酸[20]，促進了雙歧桿菌的生長繁殖。Yamano等[21]也認為雙歧桿菌的增加可能是由于約氏乳桿菌La1發酵乳中乳酸等其他代謝物降低了腸道內pH。Spanhaak等[22]研究發現干酪乳桿菌發酵乳使得雙歧桿菌和乳桿菌數量增加，而腸桿菌和梭狀芽孢桿菌數量減少。

益生菌得以在腸道中發揮益生作用，不僅是因為可以調節腸道微生態失衡，還可以通過刺激腸道黏膜免疫系統分泌抗體、細胞因子等免疫分子，增強機體免疫力，抵御病原菌的入侵。副干酪乳桿菌可以有效地增強抗原呈遞細胞的活性，從而抵抗大腸桿菌O157∶H7的感染，并使感染后的小鼠體重迅速恢復正常[23]。嗜酸乳桿菌作為益生菌的重要成員，也具有免疫增強的作用[24]。因此，對于嗜酸乳桿菌KLDS AD1是否是通過免疫增強的作用預防和治療腹瀉等疾病還有待進一步研究。

3 結論

嗜酸乳桿菌用于治療不同腹瀉，如抗生素腹瀉、急性胃腸炎、旅行者腹瀉，難辨梭菌導致的反復腹瀉[25]。本研究使用嗜酸乳桿菌KLDS AD1對小鼠腹瀉模型灌胃后，與對照組相比，致病性大腸桿菌、腸桿菌和腸球菌數量降低，而乳酸菌和雙歧桿菌數量增加，且小鼠體重有一定的恢復。嗜酸乳桿菌不僅對大腸桿菌等致病菌具有抑制作用，而且通過代謝作用為雙歧桿菌的生長創造有利條件，同時嗜酸乳桿菌和腸道內雙歧桿菌等有益菌結合，具有良好的益生作用[26]。因此，嗜酸乳桿菌KLDS AD1可以通過調節腸道內致病菌和有益菌而調節腸道微生物區系的平衡，對小鼠感染大腸桿菌O157∶H7引起的腹瀉有一定的治療作用。

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Effects of Lactobacillus acidophilus KLDS AD1 on intestinal microbiota of Escherichia coli O157∶H7 infected mice

WANG Ting-ting，LI Dan-feng，LIU Bin，LIN Hai-jun，HUO Gui-cheng*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Gut microbiota changes were investigated in the present study after infection with Escherichia coli O157∶H7 and treated with Lactobacillus acidophilus KLDS AD1.Appearance characteristics were employed to identify the preventive roles of L.acidophilus KLDS AD1 in the mice infected with E.coli O157∶H7.Mice were randomly allocated to nonchallenged control（Ⅰ），E.coli-PBS treatment（Ⅱ）and E.coli-L.acidophilus treatment（Ⅲ）groups.After oral administration of E.coli O157∶H7 for 7 days，the infected mice were fed with L.acidophilus KLDS AD1 for another 7 days，and the numbers of bacteria in the faeces of mice were counted. Results indicated that L.acidophilus KLDS AD1 could result in the weight gain significantly of E.coli O157∶H7 infected mice（p＜0.01）.Faecal Lactobacillus，Bifidobacterium counts were significantly decreased（p＜0.05），while Enterococcus，Enterobacteria and E.coli counts were obviously increased（p＜0.05），in groupsⅡandⅢafter E.coli O157∶H7 challenge compared with groupⅠ.After oral administration of L.acidophilus KLDS AD1，the number of Enterococcus，Enterobacteria and E.coli were significantly lower（p＜0.05），while Lactobacillus，Bifidobacterium counts were obviously higher（p＜0.01）in groupsⅢthan groupsⅡ.These results demonstrated that L.acidophilus KLDS AD1 was effective in regulating the intestinal microbiota and ameliorating diarrhea in E.coli O157∶H7 infected mice.

Lactobacillus acidophilus；Escherichia coli；intestinal microflora；eubiosis of microflora；disease

Q939.11+7

A

1002-0306（2014）04-0341-05

2013－07－30 *通訊聯系人

王婷婷（1988-），女，碩士研究生，研究方向：乳品科學與微生物。

國家“863”項目（2011AA100902）；國家“863”計劃（2012AA022108）；食品安全與營養協同創新中心。