母乳微生物的研究進展

賈宏信，蘇米亞，陳文亮，郭艷紅，齊曉彥

（光明乳業股份有限公司研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436）

母乳微生物的研究進展

賈宏信，蘇米亞，陳文亮，郭艷紅，齊曉彥

（光明乳業股份有限公司研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436）

傳統培養技術和現代分子學技術已證明母乳內具有多種微生物，包含葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬等。最新研究也證明母乳內的微生物，有些具有特殊的功能如抗HIV、治療乳腺炎及通過孕產婦腸道到達乳腺等。本文就母乳內微生物的來源、種類、鑒定方法、特殊功能及應用的研究進行了綜述，并展望了母乳微生物的研究方向，以期能為母乳微生物的進一步研究和利用提供指導。

母乳，母乳微生物，益生菌，乳腺炎，HIV

母乳是嬰兒最健康的食物，母乳不但能為嬰兒生長提供足夠的營養物質，還能為嬰兒提供腸道生長因子和生物活性物質，提高嬰兒的耐受能力[1]。經母乳喂養的嬰兒其呼吸道和胃腸道抗感染的能力較強[2]，哮喘和過敏性疾病的發病率較低[3]，疾病持續時間較短[4]。這也許與初乳和母乳內所包含的抗體、細胞因子、免疫活性細胞、多胺、低聚糖、乳鐵蛋白和溶菌酶等的作用相關[4-5]。另外母乳內的微生物可以傳遞給嬰兒，對嬰兒腸道內的微生物群系產生一定的影響，某些微生物還具有抑制病原微生物在嬰兒腸道內生長定殖的作用，如雙歧桿菌，乳桿菌等[6-9]。母乳內微生物的特點有：來源安全（具有幾千年被食用歷史）；種類繁多（包含葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、不動桿菌屬等）；具有傳遞性（能夠通過母乳傳遞給嬰兒，并在嬰兒腸道內定殖）；重要的益生菌菌庫（含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬兩大益生菌屬）；不同個體的母乳微生物種類存在差異，且同一產婦其母乳微生物組成和數量具有動態性；另外部分菌株具有抑菌、從產婦腸道通過乳腺進入母乳并傳遞給嬰兒、治療乳腺炎和抗HIV等作用。本文著重介紹研究者所關注的初乳和母乳內微生物的種類，來源和母嬰間微生物的傳遞方式及母乳源益生菌的應用等，以期為母乳內微生物的進一步研究提供參考。

1 母乳微生物的來源

母乳內是否具有微生物一直備受爭議，傳統理論認為母乳由于受到污染才具有的微生物，這些污染源包括孕產婦皮膚和嬰兒口腔內的微生物（主要發生在嬰兒吮吸母乳時），孕產婦的腸道和陰道內微生物（主要發生在孕產婦生嬰兒的過程中）。但是這一理論很難解釋為什么嚴格厭氧菌雙歧桿菌能在母乳內分離得到（表1），以及初乳內能分離得到多種細菌的問題[10]。因此越來越多的研究者相信母乳內的微生物來源存在其他路徑，Perez等[11]2007年證明細菌可通過內生的路徑到達孕產婦的乳腺，而樹突狀細胞（DCs）和巨噬細胞在這一通路的實現上起著重要作用。DCs能打開上皮細胞的緊密連接，把樹突伸向上皮細胞外直接抓取細菌，而無需破壞上皮細胞的完整性[12]。另外DCs還能維持少量的共生細菌在腸系膜淋巴結存活幾天[13]以及受抗原刺激的細胞能從腸粘膜移動到粘膜表面定殖，例如到呼吸道、泌尿生殖道、唾液腺、淚腺、特別是乳腺進行定殖，這些都為細菌伴隨淋巴系統的循環到達人體的其他部位提供了條件。最新研究也證明母乳內微生物的來源存在一個內生的路徑，Jiménez等[14]發現口服乳桿菌（唾液乳桿菌CECT5713和格氏乳桿菌CECT5714）膠囊制劑的乳腺炎患者，30d后乳桿菌能在60%的產婦母乳內分離得到；另外Arroyo等[15]也發現，口服發酵乳桿菌CECT5716的124位乳腺炎患者有67位的母乳內有發酵乳桿菌CECT5716檢出，口服唾液乳桿菌CECT5713的127位乳腺炎患者有68位的母乳內有唾液乳桿菌CECT5713檢出；Makino等[9]2011年研究8對母嬰之間的雙歧桿菌是否存在關聯時發現，兩株Bifidobacterium longum subsp.Longum分別專屬于兩對母嬰，這兩株菌分別都能從產婦的糞便和乳液，嬰兒的糞便內分離得到。

2 母乳微生物的鑒定和種類

2.1 母乳微生物的鑒定

母乳微生物的傳統分離法為培養基篩選法，該法首先把母乳內的微生物通過一定的選擇性培養基篩選出來，再對菌株進行鑒定。這一方法的優點在于可以得到分離的菌株，可以實現計數，但是該法操作復雜繁瑣，耗時。用于母乳內微生物分離的培養基有：培養非難養細菌、酵母和霉菌的腦心浸液（BHI），培養腸道菌的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），培養難養菌的哥倫比亞萘啶酸瓊脂（CNA），培養乳酸菌的卡那霉素七葉苷疊氮瓊脂（KAA），培養厭氧菌的Wilkinse-Chalgren（WCh），培養乳酸菌和雙歧桿菌的MRS，培養葡萄狀球菌的Baird-Parker氏培養基（BP）以及培養總細菌的營養瓊脂[10，16-18]。通過這些培養基的培養與篩選已分離出大量的母乳細菌（表1）。

母乳微生物的現代分析法為非培養依賴法，即分子學分析法，該法操作簡單，直接進行母乳微生物DNA的多樣性分析就可以得出微生物的種類與構成，但是該法無法分離得到菌株。目前應用于母乳內微生物組成分析的分子學方法有PCR-DGGE/TGGE，實時定量PCR（qRTi-PCR）和454焦磷酸測序等。PCR-DGGE/TGGE分析后可以根據數據庫的比對分析出母乳微生物的種甚至亞種，如Martín等[19]用PCR-DGGE分析母乳細菌多樣性時4個樣品共分析出20多種細菌，包含人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌、輕型鏈球菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌以及不動桿菌屬和韋永氏球菌屬等。而qRTi-PCR卻僅能分析出復雜樣品內某一類群微生物及數量，如Martín等用qRTi-PCR評價母乳內總細菌和雙歧桿菌的數量[17]，比較母乳和嬰兒糞便細菌組成的差異性[16]；Collado等[20]用qRTi-PCR分析母乳內細菌群落的多樣性。qRTi-PCR分析常用的引物[16-17，20]，見表2。454焦磷酸測序因其高通量、快速、準確和靈敏度高等特點已應用于多種微生物區系的分析，Hunt等[21]2011年用454焦磷酸測序首次分析出母乳內存在沙雷氏菌屬（Serratia）、羅爾斯通菌屬（Ralstonia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。這些事例說明兩種母乳菌相構成的分析方法，都存在各自的優越性，分子學可以快速和簡便，而培養基篩選可以分離得到相應的菌株以便對菌株作進一步的研究。

表1 母乳內檢測出的主要細菌菌屬和菌種類別Table.1 Main bacterial genera and species detected in human milk

續表

2.2 母乳微生物的種類

初乳和母乳內都有復雜的微生物區系存在[10，20]，研究者通過微生物的分離鑒定證明母乳含有的微生物主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterorococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等，而通過現代分子學技術進一步確定了母乳內存在復雜的微生物區系（表1）[8-11，16-34]。如Albesharat等[28]分析的15份母乳樣品內主要細菌為溶血葡萄球菌（Staph.Haemolyticus）、解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus）、前庭鏈球菌（Str.vestibularis）、耐久腸球菌（Enterococcus durans）、海氏腸球菌（E.hirae）、蒙氏腸球菌（E.mundtii）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、口乳桿菌（L.oris）、動物乳桿菌（L.animalis）等；Collado等[20]用qRTi-PCR分析50份母乳細菌群落多樣性發現，50份母乳都能檢出葡萄球菌、鏈球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌，96%的母乳內能檢出梭狀芽胞桿菌XIVa-XIVb，76%的母乳能檢出腸球菌。母乳內微生物得到分離并鑒定的菌株出現頻率較高的為：表皮葡萄球菌、里昂葡萄球菌、人葡萄球菌、金黃葡萄球菌、唾液鏈球菌、輕型鏈球菌、糞腸球菌、發酵乳桿菌、格氏乳桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌（表1）。Jiménez等[10]2008年通過菌株的分離鑒定分析出36個初乳樣品內有30個樣品能檢出表皮葡萄球菌（Staph.epidermidis），8個樣檢出里昂葡萄球菌（Staph.lugdunensis），4個樣檢出人葡萄球菌（Staph.hominis），15個樣檢出糞腸球菌（E.faecalis），9個樣檢出輕型鏈球菌（Str.mitis）和4個樣檢出腸膜明串珠菌（leuconostoc mesenteroides）等。不同的研究者所分析出來的母乳菌相構成有所差別可能與母乳樣品的采集時間和采集個體有關[21，27，35]。Solís等[27]跟蹤分析了20個母乳樣在不同時間內（泌乳1、10、30和60d）乳酸菌和雙歧桿菌的數量變化，發現母乳菌相構成為：1d時鏈球菌65%，葡萄球菌29%，腸球菌和雙歧桿菌各3%；10d時鏈球菌38%，葡萄球菌50%，腸球菌8%，乳酸桿菌4%；30d時鏈球菌36%，葡萄球菌43%，雙歧桿菌11%，乳酸桿菌7%，其他厭氧菌3%；60d時鏈球菌50%，葡萄球菌31%，雙歧桿菌4%，乳酸桿菌11%，其他厭氧菌4%。另外魏斯氏菌屬（Weissella）、沙雷氏菌屬和羅爾斯通菌屬、韋榮球菌屬（Veillonella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘氨醇單胞菌屬僅通過分子學技術得到了鑒定（表1），這可能說明這些菌株很難通過現有的選擇性培養基培養分離得到，也進一步說明分子學技術在分析母乳菌相構成時可能更加客觀。

表2qRTi-PCR引物Table.2 qRTi-PCR primers

3 母乳微生物的功能特性

母乳微生物具有抑制病原微生物生長[24，36]、調節免疫[37-39]、調節腸道健康[40-41]、增強流感疫苗的效果[42]，治療乳腺炎[14-15]、減少嬰兒胃腸道和上呼吸道感染[43]，產生抑菌物質[24，30，44]以及抗HIV[45-46]等作用。

3.1 母乳微生物的抑菌作用

Heikkil?等[24]研究母乳內微生物對一株金黃色葡萄球菌（能引起乳腺炎感染）的抑制時發現，分離得到的所有腸球菌、鼠李糖乳桿菌和彎曲乳桿菌都具有抑制葡萄球菌生長的作用，另外41%唾液鏈球菌及23%的表皮葡萄球菌也具有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。Olivares等[36]發現四株源自母乳的乳桿菌（唾液乳桿菌CECT5713，格氏乳桿菌CECT5714/CECT5715和發酵乳桿菌CECT5716）都能抑制豬霍亂沙門菌和金黃色葡萄球菌，以及部分菌株能抑制埃希氏大腸桿菌，李氏特菌和梭狀芽孢桿菌的作用。Jara等[40]研究來自母乳的乳桿菌對12種胃腸道病原體（4株大腸桿菌，4株志賀氏菌，3株腸炎沙門氏菌和一株假單胞菌）的抑制作用發現，有4株乳桿菌對部分病原菌有抑制作用，2株乳桿菌能抑制這12種致病菌。這說明母乳內的乳桿菌具有較寬的抑菌譜。母乳內的某些菌株能產生抑菌物質，如Shea研究表明30%的母乳含有能產生乳酸鏈球菌肽的乳酸乳球菌[30]，而一株來自母乳的糞腸球菌C901被證明能產生腸道菌素C[44]。母乳微生物的葡萄球菌、鏈球菌、片球菌、乳酸乳球菌特別是乳桿菌還具有抗HIV的作用，如彎曲乳桿菌VM25致死菌體對R5 HIV-1感染的抑制率高達55.5%，格氏乳桿菌VM22的致死菌體對X4 HIV-1感染的抑制率高達81.5%，唾液鏈球菌VM18的致死菌體對X4 HIV-1和R5/X4 HIV-1感染的抑制率分別為81%和64%[45-46]（表3）。

表3 母乳乳酸菌對R5-、X4-和R5/X4-HIV-1的抑制作用Table.3 Inhibition of R5-，X4-and R5/X4-Tropic HIV-1 by LAB from Human Breast milk

3.2 母乳微生物的益生作用

菌株的腸道定殖能力以及食用安全是菌株成為益生菌的重要條件。2007年Villoslada等[47]用50只健康的BALB/c小鼠對唾液乳桿菌CECT5713的口服毒性進行了評估，結果表明即使小鼠食用CECT5713的劑量高于人體正常食用的10000倍也是安全的，作者初步得出食用CECT5713是安全的。2010年Maldonado等[48]研究嬰兒食用益生菌食品（含CECT5713）對嬰兒健康的影響時發現，食用CECT5713的嬰兒和對照組嬰兒在臨床和體格檢查上無顯著性差異，而且還證明了食用CECT5713的嬰兒其腹瀉發生率和呼吸道感染率明顯低于對照組。Gil-Campos等[49]的研究表明食用益生菌食品（含CECT5716）的嬰兒和對照組相比嬰兒（4-6mon）的體重和身高無顯著差異，但是對照組嬰兒的胃腸道感染發生率卻是實驗組的3倍。以上說明，CECT5713和CECT5716不但可以作為益生菌被人食用，同時也說明這兩株菌能夠調節人體腸道健康。CECT5713和CECT5716還具有提高人體免疫力的益生作用。Pérez-Cano等[38]2010年發現唾液乳桿菌CECT5713和發酵乳桿菌CECT5716具有加強人體先天性免疫和獲得性免疫的能力，兩株乳桿菌都能激活先天免疫的NK細胞，使CD8+NK亞群大量表達CD69；另外兩株乳桿菌大約能激活9%的與獲得性免疫有關的CD8+T細胞。這兩株乳桿菌在體外還能誘導外周單個核細胞產生細胞因子和趨化因子，包含TNFα、IL-1β、IL-8、MIP-1α、MIP-1β和GM-CSF。

目前母乳來源的益生菌有唾液乳桿菌CECT5713、格氏乳桿菌CECT5714和發酵乳桿菌CECT5716[7]。這些菌株的益生特性表現為：唾液乳桿菌CECT5713具有腸道定殖和產抑菌物質[32]、抑菌[36]、免疫調節[37-38]、抗炎[50]、食用安全[47-48]、抗HIV（表3）[46]、改善成人腸道微生物[41]、治療感染性乳腺炎[14-15]等作用。格氏乳桿菌CECT5714具有腸道定殖和產抑菌物質[31]、抑菌[36]、改善腸道功能[51]、提高人體免疫[39]、治療感染性乳腺炎[14]等作用。發酵乳桿菌CECT5716具有腸道定殖和產抑菌物質[31]、抑菌[36]、減輕腸道炎癥[52]、免疫調節[38]、治療感染性乳腺炎[15]、增強流感疫苗效果[42]、嬰兒食用安全[49]、減少嬰兒胃腸道和上呼吸道感染的發病率[43]等作用。

3.3 母乳微生物的生物治療作用

分離自母乳的益生菌（CECT5713、CECT5714和CECT5716）具有作為生物治療劑的潛力。乳腺炎是產婦哺乳期常見的疾病，一般認為金黃色葡萄球菌是引起急性乳腺炎的病原體，而表皮葡萄球菌與慢性或亞急性乳腺炎有關。上面提到來自母乳的微生物大多有抑制金黃色葡萄球菌的能力，而Jiménez等[14]和Arroyo等[15]的實驗證明哺乳期產婦口服CECT5713、CECT5714和CECT5716能治療乳腺炎。Jiménez把20位患有乳腺炎的患者隨機均分為兩組，實驗組每天口服含有益生菌CECT5713和CECT5714的甲基纖維素膠囊，對照組僅服用無益生菌的膠囊。實驗開始前兩組患者母乳內葡萄球菌的數量無顯著差異，母乳都無乳桿菌的檢出。14d后實驗組的患者已無乳腺炎的臨床癥狀，30d后實驗組患者母乳內葡萄球菌的數量為2.96lg CFU/mL，遠低于對照組（4.97lg CFU/mL），而且有6位患者的母乳內分離得到了CECT5713和CECT5714。Arroyo卻以患者分別服用CECT5713和CECT5716治療乳腺炎的實驗組（兩組：A，n=124；B，n=127）和一組進行抗生素治療的對照組（C=101）相比證明這兩株益生菌都能治療乳腺炎。0d時3組患者的母乳內葡萄球菌的數量無顯著差異，并且無乳桿菌的檢出。21d時實驗組患者母乳內葡萄球菌的數量為2.61和2.33lg CFU/mL，對照組為3.28lg CFU/mL，并且能在服用益生菌的對應母乳內分離得到CECT5713或CECT5716。該實驗也證明了益生菌治療康復的乳腺炎患者，乳腺炎的復發率遠低于抗生素治療的患者。Jiménez和Arroyo的實驗提醒我們，母乳分離得到的菌株可開發為具有特殊功能作用的生物治療劑，同時鑒于母乳內有些微生物還具有抑制HIV的能力，因此母乳可以作為一個篩選益生菌的重要菌庫，有待于進一步的開發利用。

4 展望

健康產婦母乳內微生物的研究現在還處于起步階段，僅僅有十來年的歷史。現已研究發現健康產婦的母乳內含有多種微生物，包含葡萄球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和腸球菌屬等。雖說隨著科學技術的進步和現代分子學的發展，母乳內的微生物被發現的越來越多，但是母乳內微生物的具體種類還不完全清楚，特別是有些菌株還不能由培養基分離得到，僅能由分子學方法鑒定得出，因此對母乳內微生物種類還需要更進一步的分析研究。母乳內分離得到的微生物被證明具有特殊的功能特性，如抑菌，可由腸道到達乳腺，抗HIV，治療乳腺炎等，說明母乳可以作為篩選具有特殊功能益生菌的菌庫。因此篩選具有特殊益生特性的菌株應該是研究工作者重點關注的一個研究方向，同時有關菌株由腸道遷移至乳腺的機制也是不容忽視的研究課題。

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Research progress in the microorganism in breast milk

JIA Hong-xin，SU Mi-Ya，CHEN Wen-Liang，GUO Yan-Hong，QI Xiao-Yan
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy and Food Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Traditional culture techniques and modern molecular techniques have showed many microorganisms are in the breast milk including Staphylococcus，Streptococcus，Enterococcus，Lactobacillus and Bifidobacterium，etc.Recent studies have demonstrated that some microorganisms in breast milk have special function such as anti-HIV，curing mastitis，getting into breast through the intestinal and so on.It was reviewed that the source，type，identification methods，special function and application of the breast milk microorganisms.This paper also provided an outlook of the research direction for microorganisms in breast milk and provided some guides for the further research and utilization of microorganisms in breast milk.

breast milk；breast milk microorganisms；probiotics；mastitis；HIV

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0350-08

2013－08－02

賈宏信（1985-），男，碩士研究生，研究方向：乳品科學。

科技部農業科技成果轉化資金（2012GB2CO00141）；上海市科委國際合作項目（11290704400）。