食源性活性肽制備與分離純化的研究進展

葛平珍，周才瓊

（西南大學食品科學學院暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶400716）

食源性活性肽制備與分離純化的研究進展

葛平珍，周才瓊*

（西南大學食品科學學院暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶400716）

近年來，食源性生物活性肽在功能食品中的應用越來越廣，從而使其成為食品領域研究的熱點問題。本文對酶解法、微生物發酵法及人工合成法制備食源性性生物活性肽進行簡單介紹，根據食源性活性肽分子量及其所帶電荷，對食源性活性肽的分離純化進行重點概述。

食源性活性肽，制備，分離純化

長期生理失衡及接觸外在有毒物質的人，正常的生理功能會受到影響從而引發各種健康問題。食品中有特定功效的營養性成分與非營養性成分對抑制人體某些疾病的出現有一定的作用。因此，在抑制疾病或維持最佳健康狀態方面，功能食品常作為化學療法的佐劑或替代物[1]。近年來，研究證明食源性活性肽對機體的主要系統（消化系統、心血管系統、神經系統、免疫系統）有一定的保護效用，將具有某特定功能的生物活性肽作為功效成分制備功能食品或直接將活性肽制備成藥品，這些功能食品或藥品對控制或預防疾病有一定的作用[2]。某些食品加工過程能濃縮活性多肽，這些活性肽不僅在營養上可作為必需氨基酸的來源[3]，也能在一定程度上改善人體的多種機能，如阿片樣物質的活性、結合礦物質、免疫調節活性、抗氧化活性、抗菌活性、抗血栓、降血脂及降血壓等。

1 食源性生物活性肽概述

食源性生物活性肽是蛋白質經特定蛋白水解酶酶解或發酵后形成的從二肽到復雜的線性、環形結構的不同肽類的總稱。用于制備活性肽的動植物原料主要包括未充分利用的蛋白質豐富的食物和富含蛋白質的工業副產物，或者蛋白質中含有特定藥理價值的多肽序列或氨基酸殘基[3]。根據制備活性肽的食物來源進行簡要分類。

動物源活性肽，即動物蛋白通過特定水解酶作用而降解為對人體健康有益的片段。用來制備活性多肽的動物蛋白主要有牛奶蛋白（酪蛋白和乳清蛋白）、雞蛋和肉制品中的蛋白質、海洋生物蛋白（魚類、大型藻類等）[3]。以牛奶中的蛋白質為原料，可得到酪蛋白磷酸肽（CaseinPhosphopeptides）、免疫調節酪蛋白肽（Immunomodulating casein peptides）、抗血栓形成肽（Antithromboticpeptides）、抗菌肽（Antimicrobial peptides）、ACE抑制肽（Angiotensinconverting enzyme（ACE）inhibitory peptides）及抗氧化肽（Antioxidant peptides）[4]。

植物源活性肽是植物蛋白通過水解酶酶解或發酵形成的對人體有益的肽段。豆類（扁豆、黃豆等）、谷類（燕麥、小麥、玉米等）、麻類植物的種子和油菜籽[3]等植物中的蛋白質能用于制備生物活性肽。大豆水解物中分離的ACE抑制肽能夠抑制ACE活性，從而降低血壓。以玉米蛋白作為原料，經不同的處理過程能得到抗氧化肽、降壓肽、抗腫瘤肽等不同功能肽，朱艷華等證明玉米多肽具有保護小鼠肝臟線粒體氧化損傷及紅細胞氧化損傷的功效[5]。

2 食源性活性肽的制備方法

食物原料不同，生物活性肽的制備方法也有一定差異。一般是將食物原料中的蛋白質經特定蛋白酶酶解或微生物發酵制備活性肽，可通過物理方法（加熱、劇烈振蕩、超聲波破碎等）將蛋白質變成短肽，也可通過化學方法將氨基酸合成目標肽鏈。在此主要介紹酶水解法和微生物發酵法制備活性多肽。

2.1 酶水解法

該法的關鍵是選擇合適的酶和酶解條件。蛋白水解酶根據來源不同可分為三類：a.動物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等。b.植物蛋白酶如無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶等；c.微生物蛋白酶如細菌膠原酶、嗜熱菌蛋白酶等。每種酶都有其專一切割位點，不同底物選用不同的混合酶，能將蛋白質切割成不同肽段[6]。多種動植物源性生物活性肽均能有酶水解法制備，但此處只各舉兩例簡要說明酶水解法生產活性肽（表1）。

表1 酶水解法生產活性肽Table.1 Enzymatic hydrolysis to produce active peptide

2.2 微生物發酵法

微生物發酵法是利用微生物自身的胞外蛋白酶將蛋白質降解的過程。例如，乳酸菌發酵將牛奶蛋白水解，水解產物中分離出活性多肽[11]，包括血管緊張素轉化酶抑制肽（Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides）、抗血栓肽（Antithrombotic peptides）酪蛋白磷酸肽（Casein phosphopeptides）和細胞生長調節肽（Cytomodulatory peptides）等[12]。國外研究較多的是乳制品，亞洲研究較多的是大豆蛋白，可從發酵豆制品和其他的發酵食品中分離活性多肽。下表中列舉了幾個以大豆蛋白和牛奶蛋白為原料發酵生產活性肽的實例（表2）。

表2 發酵法生產活性肽Table.2 Fermentation of active peptide production

微生物發酵法所需原料必須富含蛋白質，產生的多肽片段有一定隨機性。這種方法生產活性肽與其他方法的最大區別是可以通過食用發酵食品使人體得到一定的活性肽，而其他方法生產的活性肽，常常被添加到功能食品中或以膠囊形式被攝入。

2.3 人工合成法

人工合成法主要有化學合成法和基因工程法，這兩種方法都需建立在已知需合成何種多肽的基礎上?；瘜W合成法一般采用固相合成法，即通過分析出多肽中氨基酸的組成及序列，將起始氨基酸（帶有氨基保護基）的羧基端固定到不溶性樹脂上，脫去樹脂上氨基酸氨基端的保護基團，根據已知的氨基酸組成和序列，以酯鍵的形式按順序將不同的氨基酸連接到固定的氨基酸上，使肽鏈不斷延伸而形成目標肽鏈[17]。基因工程法則是在體外建立多肽合成系統，通過基因重組后在生物體內導入目的基因，利用廉價原料生產目的多肽的過程。這種方法前期基因導入與篩選過程花費大量的人力、物力，但研究成功后其應用前景廣闊[18]。

3 生物活性肽分離純化方法

用不同方法得到的活性多肽，由于其分子量大小、所帶電荷及親水性等性質的差異，則可利用不同的分離純化方法將其分離純化。

3.1 鹽析法

多肽分子表面的親水基團（-OH、-NH2、-COOH等）與水分子相互作用形成水化膜，向溶液中加入大量中性鹽后，表面電荷被大量中和，從而使水化膜破壞，多肽分子相互聚集而沉淀析出，達到初步分離的目的。此法成本低，操作簡單，對多肽有一定的保護作用，但會帶入大量鹽分。余芳等[19]按兩步純化（乙醇提取，硫酸銨沉淀）法提取富含脯氨酸的多肽（proline-rich polypeptides，PRP）。

3.2 超濾法（Ultrafiltration，UF）

在壓力驅動作用下，使待分離的多肽分離通過適合孔徑的濾膜，此法可分離不同大小的多肽，但不能將分子量極其相近的多肽分離。羅非魚魚皮蛋白酶解液[20]與大豆蛋白水解物[21]的分離均可用超濾法進行。

3.3 電泳法

在電場作用下，由于待分離樣品中各種分子大小、形狀及所帶電荷不同，使帶電分子具有不同的遷移速度，從而將樣品進行分離或提純的技術。

3.3.1 毛 細 管 區 帶 電 泳 法（capillary zone electrophoresis，CZE） 此法是利用試樣組分的荷質比不同對樣品進行分離，樣品的流出順序為陽離子、中性粒子、陰離子。黃穎等[22]建立了兩種簡單的毛細管區帶電泳（CZE）對3種肌肽類活性肽（肌肽、鵝肌肽、高肌肽）進行在線富集，即大體積進樣反向壓力排除基體富集和大體積進樣電滲流排除基體富集。

3.3.2 SDS-PAGE電泳法 SDS-多肽復合物帶大量負電荷，且遠大于多肽自身的電荷，則多肽本身所帶電荷對復合物的影響可以忽略不計。因此，SDS-多肽復合物在電場作用下，其淌度（電泳速度）主要取決于復合物分子質量的大小，從而按相對分子質量大小將多肽分離出來。劉麗娜等[23]利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出相對分子量分別為6.5ku和2ku左右的花生多肽。Liu等[24]將膠原蛋白經過一系列處理后，用SDS-PAGE（經離子活化和NBT染色）進行分離，置于考馬斯亮藍染液中，能估計分離多肽的大致質量范圍。

3.4 高效液相色譜法（HPLC）

試樣進入色譜柱后，溶質在兩相間進行多次的連續交換分配，由于溶質在兩相間分配系數、吸附能力、親合力、分子大小不同引起的排阻作用而使多肽得以分離。王勇等[25]用制備型HPLC（流動相為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液）對泰和烏骨雞進行分離后得到的13個組分都具有一定的抗氧化活性。

4 近期生物活性肽分離純化研究方法

在基本分離方法的基礎上發展起來的，或將其他領域的分離純化方法應用于多肽的分離純化方法。

4.1 Tricine-SDS-PAGE

Tricine-SDS-PAGE是建立在glycine-Tris和Tricine-Tris緩沖液系統基礎上的分離蛋白質或多肽的SDS電泳技術。Tricine-SDS-PAGE與其他電泳系統的區別是所使用凝膠中丙烯酰胺含量較低，其分離蛋白質分子的質量范圍為1～100ku，常用于分離分子質量小于30ku的蛋白質[26]。SDS-PAGE分離出相對分子質量為14～28ku小紅豆蛋白，胰蛋白酶水解小紅豆蛋白后，用Tricine-SDS-PAGE分離水解物，得到大多數片段的相對分子質量約為4ku[27]。

4.2 反相高效液相色譜（RP-HPLC）

RP-HPLC的固定相由疏水性功能團構成，在高效分離模式中，流動相的極性一般比固定相強。水解物經RP-HPLC分離后得到的是疏水性不同的多肽分子。流動相較簡單，一般由甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-鹽或甲醇-水-鹽等體系構成，流動相中有機溶劑濃度、pH和鹽濃度的變化影響分離效果。

Castro-Rubio A等[28]利用RP-HLPC分離豆類和谷物中的蛋白質，可將其借鑒用于分離多肽。牛瑞、于建生[29]將鱈魚蛋白水解物依次通過超濾、凝膠過濾層析、陰離子交換層析和RP-HLPC進行分離純化，得到高純度的鱈魚多肽。

4.3 離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）

其分離機理主要是電場的相互作用，其次是非離子性的吸附作用。各種成分與固定相有不同的作用力導致在色譜柱中保留的時間不同而使樣品分離。陰離子分離主要是采用季銨基作功能基的陰離子交換劑（anion-exchanger），陽離子的分離主要采用磺酸基和羧酸基作功能基的陽離子交換劑（cationexchanger）[30]。陽離子交換色譜分離到凈陽離子多肽片段，而陰離子多肽分離到凈陰離子多肽片段。離子交換色譜因固定相種類不同而具有不同的類型，如DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜、SPSephadex C-25陽離子交換色譜。使用時根據待分離多肽所帶電荷不同而選擇不同的離子交換色譜。

李蓉等[31]建立高效陽離子交換色譜法分離純化蛋清中的溶菌酶，用氯化鈉將蛋清樣品勻漿初步純化（鹽析法）后用合成的弱陽離子交換柱XIDACEWCX進一步分離。程林友[32]在玻璃海鞘多肽的分離純化中，通過70%丙酮沉淀、超濾截留、DEAESepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜、Superdex-75凝膠過濾層析、HPLC、Tricine-SDS-PAGE等手段逐步分離得到玻璃海鞘多肽（Met-Val-Val-Pro-Pro-Asp-Gly-Gln-Ser-Glu-Cys-Pro-Asp-Gly-Asn）。

4.4 凝膠色譜法（gel chromatcgraphy，GC）

凝膠色譜又稱分子篩過濾、體積排阻色譜、大小排阻/尺寸排阻色譜、凝膠排阻/過濾層析。利用分子篩作用對大小、形狀不同的分子進行分離。當樣品組分隨溶液進入凝膠柱后，不同大小的組分進入到相應的凝膠孔徑內，大于所有孔徑的組分分子不能進入凝膠顆粒內部，只能沿著凝膠顆粒的縫隙隨溶液流動[33]。質量越小的分子在凝膠顆粒之間流動的時間越長，質量較大的分子則會較早流出，從而根據分子質量的不同將混合物進行分離。

周國儀等[34]以雞卵清蛋白為原料，利用酶工程法制得雞卵清蛋白多肽，采用SephadexG-25和Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析、高效液相體積排阻色譜（HPSEC）、RP-HPLC等方法對雞卵清蛋白多肽進行分離純化。

4.5 親和層析法（Affinity chromatography，AC）

親和層析（affinity chromatography，AC）具有高選擇性、高分離性及較大的載量[35]，將待純化的某種多肽的特異配體通過一定的化學反應共價連接到載體表面的功能基上構成配基，多肽能自由通過載體。當含有目的多肽的混合樣品通過該配基時，目的多肽與特異性配體結合而吸附在配基表面，其他物質則被洗出[35]。選擇合適的洗脫液改變多肽與配基的結合條件而將多肽分離，用此方法分離多肽時需要選擇能吸附待分離多肽的特異性配基。

劉柳等[36]以納豆激酶的作用底物纖維蛋白為配基制備親和層析膠，分離純化納豆激酶，且用瓊脂糖包埋纖維蛋白制備的層析膠能夠用于納豆激酶的快速分離純化。

4.6 離子交換離心分配色譜法

離子交換離心分配色譜是將離子交換色譜和離心分配色譜相結合的分離方法。通過加入液態的脂溶性弱陰（陽）離子交換樹脂，使水相中待分離組分的陰（陽）離子和樹脂絡合的陰（陽）離子進行可逆交換進入有機相，其洗脫方式需根據流動相和固定相的相對密度決定：若下相為流動相，則用下降式洗脫模式；若上相為流動相，則用上升式洗脫模式；若分離可離子化成分，則采用pH區帶精制模式洗脫[37]。

Boudesocque L等[38-39]用離子交換離心分配色譜法對多肽進行分離，其色譜體系及洗脫模式構成為：脂溶性的二（2-乙基己基）磷酸（DEHPA，di（2-ethylhexyl）phosphoric acid）作陽離子交換樹脂，置換劑為CaCl2和HCl，采用下降式洗脫模式，其洗脫溶液體系是體積比為2∶1∶2∶5的甲基叔丁基醚/乙腈/正丁醇/水（methyl-tert-butylether/acetonitrile/n-butanol/ water）體系，用這個體系對苜蓿白色蛋白水解物中的降高血壓肽（L-valyl-L-tryptophan（VW））進行分離，也用同樣體系的離子交換離心分配色譜對GG（Gly-Gly）、GY（Gly-Tyr）、AV（Ala-Tyr）、LV（Leu-Var）及LY（Leu-Tyr）進行分離。

4.7 探針分離多肽

將要分離的純多肽作為抗原，在生物體合成抗體（多肽），用固相酶聯免疫吸附技術將合成的抗體分離。由于分離的抗體分子量較小，將其與其他的蛋白質（如BSA）結合，以達到制備探針的最佳分子量，蛋白質-抗體與特定的金屬顆粒結合制備特定的分離探針，用這種探針來分離水解混合物中的特定活性多肽，結合到探針上的多肽用特異洗脫液洗脫下來。該法比其他的方法的分離時間短，且能節約分離時間，對功能性食品與醫療食品的發展有重要的意義。Fields C等[40]以純化的BBI作為抗原，在生物體中合成出抗BBI的抗體（多肽），用固相酶聯免疫法分離抗體，將分離抗體與BSA結合，然后與特定的氧化鐵磁性粒子結合，制備成新穎的多肽分離探針。這種探針能快速分離大豆蛋白水解物中的BBI，分離效果高于其他傳統的分離方法。

4.8 溫度響應型聚合物刷分離多肽

通過ATRP（原子轉移自由基聚合）反應在有氣孔的基體表面接入溫度響應型聚合物刷，將裝載了聚合物刷的基體填入不銹鋼柱中，將填充好的柱子連接到溫度響應的HPLC中進行多肽的分離[41]。Mizutani A等[42]通過ATRP反應在多孔聚苯乙烯小珠上接入溫度響應型聚合物刷（聚（N-異丙基丙烯酰胺）刷，即PIPAAm刷），將這種聚苯乙烯小珠當作填料填充柱子（4.6mm i.d.×150mm），填充好的柱子接入HPLC中，分離多肽的洗脫過程為熱響應洗脫，能將血管緊張素亞型分離。Mizutani A等[43]還通過ATRP反應將聚N-異丙基丙烯酰胺-共-N-叔丁基丙烯酰胺刷接入聚羥基甲基丙烯酸酯（水解的聚甲基丙烯酸縮水甘油基酯-共-乙二醇二甲基丙烯酸酯）多孔小珠上，這種小珠可作為溫度響應型色譜的固定相，可以將峰相近的多肽分離開，且分別率很高。

表3 部分活性肽生產關鍵方法和作用Table.3 Critical production method and function of parts of the active peptide

綜合制備與分離純化全過程，部分活性多肽生產過程中的關鍵方法和技術見表3。

在實驗室分離純化活性肽的過程中，一般是先用強酸型離子交換樹脂和強堿型離子交換樹脂進行脫鹽處理，通過超濾的方法將帶分離的活性肽分成不同分子量范圍的肽段，再經過Tricine-SDS-PAGE、RP-HPLC、質譜等進一步純化。根據分離活性肽的特性，選擇合適的方法對其進行分離純化。

5 展望

食源性活性肽的制備多采用酶解法和生物發酵法。蛋白質預處理技術、可控酶解技術、定向分離純化技術是活性肽生產過程中的關鍵技術，在以后的研究中，需要注意發展這些關鍵技術的簡易方法。在活性肽的分離純化過程中要充分利用各種分離方法的優勢，將其結合起來從蛋白水解液中定向分離出活性肽。同時要充分利用其他領域的分離方法，探索生物活性多肽分離純化的有效方法。

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Research progress in the preparation，separation and purification of bioactive peptide derived from food

GE Ping-zhen，ZHOU Cai-qiong*
（Engineering&Technology Research Centre of Characteristic Food，Food Science College，Southwest University，Chongqing 400716，China）

In recent years，the bioactive peptide derived from food was more increasingly applied to functional foods，leading to the research on active peptide become a hot study topic on the food field.Preparation methods of bioactive peptide derived from food，containing enzymatic preparation，microbial fermentation and synthetic preparation，were introduced briefly，according to molecular weigher and electric charge of food-borne bioactive peptide.It was focused on the separation and purification of bioactive peptide derived from food.

active peptide derived from food；preparation；separation and purification

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0363-06

2013－07－18 *通訊聯系人

葛平珍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制。