超高壓處理對草莓汁品質酶和殺菌效果的影響

柳 青，王 丹，馬 越，常 彥，張 超，趙曉燕，*

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心、果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室、農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京100097；2.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京102442；3.山西農業大學食品學院，山西晉中030801）

超高壓處理對草莓汁品質酶和殺菌效果的影響

柳 青1，2，3，王 丹1，馬 越1，常 彥1，張 超1，趙曉燕1，*

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心、果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室、農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京100097；2.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京102442；3.山西農業大學食品學院，山西晉中030801）

研究了超高壓處理對草莓汁多酚氧化酶、果膠甲酯酶和殺菌效果的影響。結果表明：超高壓處理對草莓汁具有良好的殺菌效果，微生物隨著壓力的增加而顯著減小，300MPa，15min處理草莓汁，菌落總數和霉菌酵母菌均符合商業無菌條件；草莓汁中PPO和PME比較耐壓，中低壓條件下，PPO和PME酶活性被激活，隨壓力增加和時間延長而增大。而中高壓處理后，酶活性顯著減小（p＜0.05），600MPa 25min，PPO及PME殘余酶活力分別降至74.6%和47.0%。

超高壓，多酚氧化酶，果膠甲酯酶，殺菌效果

草莓色澤鮮艷，營養豐富，風味怡人，含豐富的有機酸，維生素、多酚物質及花色苷等。但其屬于熱敏性水果，傳統熱加工會導致褐變和異味的產生[1]，采用非熱力殺菌技術可能是解決草莓汁品質劣變的有效方法。超高壓技術（U ltra High Pressure，UHP）能有效殺死食品中的腐敗微生物和抑制酶的活性，而對食品的香氣、維生素和色澤等品質無破壞作用[2]，可以較好地保持果蔬汁的新鮮度和固有營養成分[3]，符合消費者對食品安全、營養和風味的要求。作為非熱加工技術，超高壓技術近年來已經成為國際的研究熱點，日本、德國、美國等發達國家已有各類超高壓果汁、果醬等產品上市，受到了消費者的青睞。草莓中含有大量的多酚氧化酶（PPO）和果膠甲酯酶（PME），它們是引起果蔬顏色劣變和沉淀的一類重要的內源酶，不僅導致果汁褐變，影響產品外觀，而且其催化產物會影響產品的口感和風味[4]，可將其作為果蔬汁品質評價的指標酶。不同來源的酶在超高壓處理時其活性的變化差異較大，超高壓處理可降低酶的活性，也可能激活酶的活性，這與酶的特性和超高壓作用的條件有關[5]。近年來超高壓技術對草莓及其制品研究主要集中品質變化影響的研究[6-7]，而關于不同超高壓處理條件對草莓汁中PPO和PME的影響報道較少。本文主要研究不同條件超高壓處理對草莓汁品質酶和殺菌效果的影響，以期為草莓的深加工提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓 購于北京新發地市場，品種為豐香，挑揀后分裝，分裝后立即放入-18℃冰箱保存，實驗時取出，4℃解凍，待用；果膠 美國Sigma公司；鄰苯二酚、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP） 天津市福晨化學試劑廠；平板計數培養基、孟加拉紅培養基 北京國藥有限公司。

超高壓處理裝置 英國STANSTED公司；紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；3-18型高速冷凍離心機 德國賽多利斯公司；飛利浦打漿機 飛利浦電子有限公司；水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；高壓均質機 意大利Niro Soavi公司；pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；真空包裝機 北京日上公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 草莓汁的制備 速凍草莓挑選色澤均一無損傷的原料去蒂清洗，于-4℃隔夜解凍，打漿后用打漿機破碎，經過濾、均質后，裝入已滅菌的聚乙烯塑料袋中，用真空封口機封口制得草莓汁。

1.2.2 超高壓處理 將包裝好的草莓汁置于超高壓裝置內，選取200、300、400、500、600MPa，保壓時間5、10、15、20、25m in，溫度設置為25℃，以未經超高壓處理的草莓汁為空白對照組。超高壓處理完樣品于4℃冰箱保存，盡快完成各項指標檢測。

1.2.3 微生物檢測 選取菌落總數、霉菌和酵母菌作為微生物檢測指標，依據食品微生物學檢驗菌落總數測定方法（GB4789.2-2010）和霉菌和酵母菌測定方法（GB4789.15-2010）。為保證實驗數據準確性，實驗結果均為兩個平行樣的三組重復數據平均值。

1.2.4 PPO酶活的測定 采用李靜[8]的方法，略作修改。粗酶液的提取：20m L草莓汁中加入1%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），混勻，4℃下放置1h，10000×g，4℃條件下離心20min，上清液冷藏備用。底物溶液的配制：用pH 6.5緩沖溶液配制0.05mol/L鄰苯二酚溶液。PPO酶活性測定：反應體系為2.1m L 0.05mol/L鄰苯二酚溶液，加入0.7m L 4倍稀釋的粗酶液，混勻，室溫條件下，在410nm下測定其吸光值的變化，測定吸光值隨時間的變化曲線，曲線開始時直線部分的斜率代表PPO酶活。殘余酶活計算公式：

其中：反應池中，底物與酶液混合后立即在410nm波長下測定吸光度（A）的變化，每隔30s記錄一次A值，根據酶學反應動力學曲線最初直線部分的斜率（△A/t）代表PPO酶活力。即1m in內引起吸光度增加0.001所需的酶量為一個酶活單位（以U/m in表示）。

1.2.5 PME酶活的測定 采用Sampedro F的方法[9]。

底物溶液的配制：10g/L果膠溶液用適量蒸餾水溶解，預熱至40℃后置于磁力攪拌器上，緩慢加入10g果膠及5.85g NaCl，蒸餾水定容到1000m L，冷藏備用。PME酶活性測定：40m L 10g/L果膠溶液于（30±2）℃水浴鍋中恒溫水浴。2.0mol/L NaOH迅速調節pH至7.0，用0.05mol/L NaOH迅速調節pH至7.5，加入3m L粗酶液，再用0.01mol/L NaOH迅速調節pH至7.5，記錄加入0.01mol/L NaOH的體積，測定溶液pH重新回到7.5的時間，利用時間和體積的變化速率的線性關系表示PME酶活，計算PME殘余酶活。殘余酶活計算公式：

其中：酶活性均以滴定時間變化與0.01mol/L NaOH溶液的體積變化形成直線的斜率表示。

1.3 數據處理

采用Origin8.5軟件制圖并用DPS軟件進行方差分析，顯著性水平為0.05，當p＜0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對草莓汁殺菌效果的影響

2.1.1 超高壓壓力對草莓汁菌落總數的影響 草莓汁的初始菌落總數為4.5Lgcfu/m L。實驗保壓時間設置15min條件下，考察不同超高壓壓力對草莓汁中菌落總數的影響。由圖1可知升高壓力使草莓汁中菌落總數迅速降低。300MPa下殘存菌落數降至1.5Lgcfu/m L，在此基礎上繼續提高壓力（≥300MPa）均可使果汁達到商業無菌標準要求（小于100cfu/m L）。而200MPa下菌落總數雖然顯著降低了1.9個對數值（p＜0.05），但超過了果汁國家標準要求；隨著壓力的增加，菌落總數持續下降，但其差異并不明顯。這是因為每種菌都有耐壓閾值，壓力敏感菌壓力閾值較低，而耐壓菌的閾值較高。低壓條件下，一部分對壓力敏感的細菌迅速被殺滅，而耐壓菌具有較強的耐壓性，600MPa時菌落總數顯著降低（p＜0.05）。與黃麗[10]研究結果類似，當壓力升到200MPa，荔枝汁中的菌落總數迅速下降，降低至170cfu/m L，400MPa時達到商業無菌條件，當壓力大于500MPa時，殺菌效果提高不顯著。

圖1 超高壓壓力對草莓汁中菌落總數的影響Fig.1 Effectof pressure treatment on total bacterial count in strawberry juice

2.1.2 超高壓壓力對草莓汁霉菌和酵母菌的影響霉菌和酵母菌容易引起果蔬腐敗變質，一些霉菌會產生毒素，進而影響果汁的飲用安全。實驗保壓時間設置15m in條件下，考察不同超高壓壓力對草莓汁中霉菌和酵母菌的影響。由圖2可知，草莓汁初始霉菌和酵母菌數為4.4Lgcfu/m L。霉菌及酵母菌對壓力很敏感，300MPa下已無霉菌和酵母菌檢出。Ogawa等[11]研究了溫州蜜橘汁在350～400MPa壓力可以將果汁中霉菌和酵母菌的數量降低5個對數級；潘見[7]研究發現草莓汁中霉菌及酵母菌在350MPa，5m in處理后，草莓汁中的霉菌和酵母菌總數為10cfu/m L，繼續延長保壓時間到10m in后，樣品中檢測不到霉菌和酵母菌。

圖2 超高壓壓力對草莓汁霉菌和酵母菌的影響Fig.2 Effectof pressure treatment onmold and yeast count in strawberry juice

2.1.3 保壓時間對草莓汁菌落總數的影響 由圖3可知，300MPa下保壓5m in之內，細菌存活量下降速率大；隨著保壓時間延長，曲線逐漸平緩，細菌存活量下降速率明顯減弱。可能由于一部分耐壓力弱的微生物迅速死亡，而隨著處理時間的延長，部分耐壓菌仍然可以存活。當細菌殘留率達到一定值后，單純的增加超高壓處理時間，殺菌效果并不明顯，需要結合其他的處理方式如協同溫度、脈沖加壓等方式可進一步提高殺菌效果。Baymdirli等[12]研究發現350MPa協同40℃條件下處理蘋果柑橘汁5m in可全部殺滅果汁中的微生物。

圖3 保壓時間對草莓汁中菌落總數的影響Fig.3 Effect of UHP treatment time on total bacterial count in strawberry juice

2.1.4 保壓時間對草莓汁霉菌和酵母菌的影響 由圖4可知，300MPa保壓時間為5m in，草莓汁中霉菌和酵母菌全部殺滅，相比細菌，霉菌和酵母菌對壓力更為敏感。劉野[13]研究超高壓對鮮榨西瓜汁殺菌效果結果表明，600MPa下，0～15m in范圍內，霉菌和酵母菌數迅速降低至10cfu/m L，而后隨著處理時間的延長保持不變，當達到60m in時霉菌和酵母菌數降為2cfu/m L。

圖4 保壓時間對草莓汁中霉菌和酵母菌數量的影響Fig.4 Effect of UHP treatment time onmold and yeast count in strawberry juice

2.2 超高壓處理對草莓汁PPO活性的影響

2.2.1 超高壓壓力對草莓汁PPO活性的影響 由圖5可知，不同超高壓壓力處理草莓汁的PPO酶活性整體呈降低趨勢。400、500、600MPa，處理15m in，PPO殘余酶活力分別降至83.96%、78.78%、80.67%，處理壓力在PPO的鈍化效果上起主要作用，且PPO酶出現鈍化和激活兩種現象。200、300MPa分別處理5m in，200MPa處理10min，PPO活性較空白對照組（100%）顯著升高（p＜0.05），分別增加了15.52%、4.31%、2.64%，低壓短時處理草莓汁，使酶從草莓汁細胞碎片附著而被束縛的狀態中解離出來，先游離出來的部分酶變性失活，使PPO酶活性升高[14]；宋丹丹[15]研究胡蘿卜草莓復合汁中酶和微生物的影響時也發現，PPO在200MPa下被激活，酶活提高24%，300、400MPa時分別失活12%、36%，500MPa時略有回升。

圖5 超高壓壓力對草莓汁PPO酶活性的影響Fig.5 Effectof pressure treatmenton PPO activity in strawberry juice

2.2.2 保壓時間對草莓汁PPO活性的影響 果蔬加工需抑制或鈍化酶的活性以保證產品質量。PPO和PME易引起酶促褐變，導致果汁沉淀，從而影響草莓汁的品質。由圖6可知，隨保壓時間延長，草莓汁的PPO酶活性整體呈降低趨勢。400～600MPa，15～25m in條件下，PPO酶活性降低程度較小，600MPa，25min處理PPO殘余酶活力為74.6%。因此，保壓時間并非越長越好，繼續延長處理時間，酶活變化不顯著。與前人對辣椒、荔枝、鱷梨等來源的酶耐壓性相比，草莓汁中PPO仍具有較高的相對活性，可能與草莓的品種及存在的介質、體系pH相關[16]，草莓對壓力的耐受能力較強而不易被鈍化。有研究表明，當壓力在200～600MPa、溫度為60℃，處理10～20m in能將新鮮荔枝PPO的相對活性降到20%以下，但荔枝果醬PPO的相對活性仍保持在40%～60%[17]。

圖6 保壓時間對草莓汁PPO酶活性的影響Fig.6 Effectof UHP treatment time on PPO activity in strawberry juice

2.3 超高壓處理對草莓汁PME酶活性的影響

圖7 超高壓壓力對草莓汁PME酶活性的影響Fig.7 Effectof t pressure treatmenton PME activity in strawberry juice

2.3.1 超高壓壓力對草莓汁PME酶活性的影響 PME酶與果汁的穩定性和果蔬質地密切相關。PME酶耐壓性較強。由圖7可知，不同超高壓壓力處理草莓汁的PME酶活性并未呈現明顯的規律，分別出現激活和降低兩種現象。600MPa下處理草莓汁25m in，PME酶活下降幅度較大，降至47.0%；200MPa，5min，PME活性較空白對照組增加了9.9%（p＜0.05）；400MPa處理草莓汁5m in，PME酶被激活，顯著升高了8.0%（p＜0.05）。Cano等[18]研究超高壓對橙汁中PME的鈍化效果時發現，20～25℃下，200～400MPa處理橙汁，使PME出現不同程度的激活現象，且隨著壓力增加PME活性變化很小。較低壓力下能展開蛋白質鏈，改變酶的三維構造，暴露活性位點，但此變化一般是可逆的。而在較高壓力下酶的三維構象發生不可逆分解，所以存在酶激活的現象。一般情況下，超高壓處理時，壓縮的能量將提高食品的溫度，每增加100MPa壓力，溫度大約升高2～3℃，這取決于食品原料的成分。本實驗中，超高壓設備具有控溫設施，可根據實驗需要設置處理溫度，且當樣品袋浸沒于高壓容器傳壓油中，升壓和卸壓時間很短，在1～2s即可完成升壓和卸壓過程，可以保持樣品溫度在保壓過程中不會發生較大波動。

2.3.2 保壓時間對草莓汁PME酶活性的影響 由圖8可知，隨著保壓時間的延長，草莓汁的PME酶活性整體呈降低趨勢。低壓短時處理，PME酶活性未發生顯著變化。200～500MPa，延長保壓時間，PME酶活性降低不明顯；600MPa，15m in條件下，PME酶活性降至84.0%，在此基礎上增加保壓時間PME酶被急劇鈍化，失活程度加深。PME在較低壓力條件下活性上升，只有當壓力達到一定程度時，酶活性才有所減少[19]。陳賀慶等[16]研究超高壓對橙汁中PME活性的影響，結果表明隨著處理時間延長，高壓條件下，PME殘留活性顯著下降，600MPa、20m in處理橙汁殘留酶活性達17.41%。保壓時間并非越長越好，PPO和LOX在10m in POD在15m in時分別失活最大，繼續延長處理時間酶活變化不顯著。

圖8 保壓時間對草莓汁PME酶活性的影響Fig.8 Effect of UHP treatment time on PME activity in strawberry juice

3 結論

3.1 超高壓處理對草莓汁具有良好的殺菌效果。草莓汁中微生物隨著壓力的增加而顯著減小，細菌比霉菌、酵母菌耐壓，延長處理時間對草莓汁殺菌效果不顯著。300MPa，15m in以后，草莓汁中菌落總數和霉菌酵母菌數均符合商業無菌條件。

3.2 升高壓力增強草莓汁PPO和PME酶的鈍化效果，進一步延長保壓時間PPO酶活性降低不明顯。低壓短時間處理草莓汁，200、300MPa，5m in和200MPa，10m in，PPO活力較空白對照組分別提高了15.52%、4.31%和2.64%（p＜0.05）；中高壓處理后，PPO酶活性顯著減小，600MPa，25min，PPO殘余酶活力降至74.6%。200MPa下，處理5m in對PME酶有激活現象；600MPa，25min時，PME活性顯著減小（p＜0.05），殘余酶活力降至47.0%。

3.3 草莓汁中PPO和PME比較耐壓，僅增加壓力與處理時間并不能使酶完全失活，還需結合其他因素的作用，如協同溫度、加壓方式以及協調食品中糖、酸、脂肪、蛋白質和可溶性鹽等的介質影響，以此達到更好的殺菌鈍酶效果。

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Effectof high hydrostatic pressure processing of quality enzyme and sterilization in strawberry juice

LIU Qing1，2，3，WANG Dan1，MA Yue1，CHANG Yan1，ZHANG Chao1，ZHAO Xiao-yan1，*
（1.Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing Key Laboratory of Agricultural Products of Fruits and Vegetables Preservation and Processing，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvementof Horticulture Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China；2.Food and Bioengineering Department，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China；3.College of Food Science，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

The effect of high p ressure treatment on polyphenol oxidase，pectinesterase and sterilization in strawberry juice were investigated.The results showed that：high p ressure treatment had good effec t on sterilization，m icrobial decreases significantly w ith the increase of p ressure.300MPa，15m in，total bacterial count and mold yeast count in strawberry juice were in accordance w ith commercial asep tic cond itions.PPO and PME were resistance to p ressure，on low p ressure cond ition，the activity of PPO and PME were activated which increased w ith p ressure and time.Well，the enzyme activity was significantly decreased（p＜0.05）on high p ressure.600MPa，25m in，PPO and PME residualenzyme activity d ropped to 74.6%and 47.0%respectively.

high hyd rostatic p ressure；polyphenoloxidase；pectin methylesterase sterilization

TS255.1

A

1002-0306（2014）18-0144-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.022

2013－11－11 *通訊聯系人

柳青（1982-），女，博士，講師，研究方向：食品營養與檢測。

現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-25）；北京市農林科學院科技創新能力建設專項（KJCX201102002）。