不同萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響

田甜甜，王積武，吳志蓮，王洋洋，牛 浩，趙玉平，*

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.綠杰股份有限公司，山東龍口265718）

不同萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響

田甜甜1，王積武2，吳志蓮2，王洋洋1，牛 浩1，趙玉平1，*

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.綠杰股份有限公司，山東龍口265718）

為研究不同的萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響，采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和液液萃取（LLX）對山楂汁中的香氣成分進行富集，并結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）對其進行定性和半定量分析。結果表明，HSSPME共檢測出21種香氣成分，主要是順-3-己烯醇、α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯等，其含量分別為79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；LLX共檢測出20種香氣成分，主要是順-3-己烯醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸，其含量分別67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。通過比較分析可知，不同的方法因工作原理不同，得到的香氣成分不同且含量差異較大。

山楂汁，香氣成分，頂空固相微萃取（HS-SPME），液液萃?。↙LX），氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）

山楂作為傳統的藥食兩用植物，其營養成分極其豐富，且含有黃酮類、酚酸類、有機酸和萜類等物質[1]，具有降血脂、抗癌、抗衰老等功能[2-3]。香氣成分是構成和影響果實及果汁質量與典型性的主要因素[4]。雖然食品中香氣成分的含量非常低，但是這些物質直接影響著人們的食欲，同時在飲料的生產調配過程中也有著重要影響。

國內外有關山楂香氣成分的研究文獻報道較少[5]。近年來，朱曉蘭等[6]采用連續液液萃取技術并結合GC-MS收集山楂中的揮發性物質，認為順-3-己烯醇和丁子香酚等是山楂香氣的代表性化合物；謝筆鈞等[7]采用蒸餾-萃取法收集山楂中的揮發性物質，認為順-3-己烯醇、順-3-乙酸己烯酯和α-萜品醇等是山楂汁香氣成分的代表。HS-SPME技術操作簡便、耗費低、易于實現自動化，而LLX可以充分將樣品中的痕量物質萃取出來。由于山楂汁中的香氣成分較為復雜，各種提取方法的原理不同，所得到的香氣物質是否一致，差異是否顯著，目前尚無相關的報道。本實驗采用HS-SPME和LLX兩種萃取方法并結合GC-MS對山楂汁中香氣成分進行定性和內標法定量分析，并對兩種不同的提取方法進行對比研究，為進一步完善山楂的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮山楂果 山東煙臺，市售，無腐爛，無病蟲害；果膠酶（10U/m L） RAPIDASE公司；NaCl上海國藥集團，分析純；3-辛醇（內標） Sigma公司，色譜純；正十七烷（內標） 天津市彪仕奇科技發展有限公司，色譜純；C10～C25直鏈烷烴標準品 Sigma公司，色譜純；二氯甲烷 天津化學試劑廠，分析純；無水硫酸鈉 青島市盛美化工有限公司，分析純。

GC-MS-2010 日本津島公司；DB-Wax型色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm） 美國Agilent公司；SPME萃取頭（50μm/30μm CAR/DVB/PDMS） 美國Supelco公司；微量進樣器 上海安亭微量進樣器廠；低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；磁力攪拌器 龍口先科儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 選取1kg無腐爛的山楂，去梗后稱重并清洗干凈，按山楂和水質量1∶1，煮至山楂開裂，停止加熱，制成果醬，冷卻至50℃時加入1m L果膠酶，混勻，酶解6h，然后以轉速4000r/m in離心20m in，取上清液，即為山楂汁[8]。

1.2.2 樣品預處理

1.2.2.1 頂空固相微萃取 取5.00m L山楂汁加入20m L的萃取瓶中，加入2.0g NaCl、1μL的內標3-辛醇和轉子，加蓋封口；置于50℃恒溫水浴中預平衡10min，將萃取頭插入樣品瓶中的頂空部分，吸附5m in后進行GC-MS分析。樣品重復6次。

1.2.2.2 液液萃取 取5.00m L山楂汁加入100m L 100g/L食鹽水、100μL的內標正十七烷，充分攪勻后轉移至預先在底部加入10m L二氯甲烷的萃取器后，再向燒瓶中加入40m L二氯甲烷，置于65℃恒溫水浴進行加熱，連續萃取5h。取下裝置后，向二氯甲烷溶液中加入無水硫酸鈉固體，干燥后，濃縮至1m L，取1μL進行GC-MS分析[6]。樣品重復6次。

1.2.3 GC-MS條件

1.2.3.1 GC條件 色譜柱：DB-Wax柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；升溫程序：初始溫度40℃，保持2m in，然后以6℃/m in升溫至100℃，再以5℃/m in升溫至150℃，最后以10℃/min升溫至230℃，保持4min；溶劑延遲1m in；進樣口溫度和檢測器溫度230℃；載氣（He）流速2m L/m in，壓力61.8kPa；采用不分流進樣模式。

1.2.3.2 MS條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度230℃；掃描范圍：m/z 30～500。

1.3 香氣成分的鑒定

1.3.1 香氣成分的定性 將C10～C25的直鏈烷烴標準品單獨進樣，進行GC-MS分析，得到每一種烷烴的保留時間；根據參考文獻[9]保留指數的計算公式，計算每一種組分的保留指數；與NIST Library工作站標準譜庫自動檢索各組分質譜數據、參照試劑公司提供的標準譜圖對機檢結果進行核對確認以及相關的文獻資料[11，15，18，20]進行比較，進一步確定香氣成分。

1.3.2 香氣成分的定量 根據以下方法計算各組分含量[10-11]：

2 結果與討論

圖1為山楂汁經過不同方法萃取后，在DB-Wax柱上通過GC-MS分析得到的總離子流圖。各組分質譜經NIST Library檢索并根據C10～C25直鏈烷烴標準品和資料分析共檢測出27種香氣成分及含量如表1所示。

所檢測的27種香氣成分中，酯類、萜烯類、芳香類、醇類、酸類、呋喃類和醛類構成了山楂汁的主要的香氣成分。HS-SPME和LLX得到的組分幾乎相同，各有21和20種。每種方法所檢測到的香氣成分相似但又有所差別。就HS-SPME而言，順-3-己烯醇的含量最高，依次是α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯和苯甲醇等。這些組分的大量存在與文獻中的結果是相一致[7]；而LLX萃取到的組分中，順-3-己烯醇的含量最高，依次是順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸等。

圖1 不同方法萃取山楂汁香氣成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of differentextractionmethod on aroma components of hawthorn juice

2.1 酯類組分分析

由表1可以看出，使用HS-SPME共檢測出8種酯類物質，主要包括順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、甲酸己酯、乙酸乙酯和己酸乙酯等；而使用LLX檢測出11種酯類物質，順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丙酮酸乙酯、己酸乙酯和檸檬酸三乙酯等，其中7種物質是兩種方法都檢測到的且各物質之間的含量差異較小。丙酮酸乙酯、肉桂酸乙酯、檸檬酸三乙酯和硬脂酸乙酯這4種物質是LLX檢測到而HS-SPME沒有檢測到的。另外，HS-SPME檢測出乙酸乙酯，而LLX沒檢測出，這是因為LLX容易受到溶劑的干擾，低沸點的物質如乙酸乙酯檢測不出[12]。

表1 山楂汁中各香氣成分及含量Table 1 Aroma components and its contents of hawthorn juice

乙酯類組分的合成由醇類和乙酰-CoA在醇酰基轉移酶的作用下縮合而成的[13]。有研究發現順-乙酸-3-己烯酯的含量可以作為山楂成熟的標志[7]，是主要的香氣成分之一。順-乙酸-3-己烯酯具有山楂汁特有的清香味，甲酸己酯具有蘋果或未成熟梅子香氣，己酸乙酯具有水果味和甜味，而順-丁酸-3-己烯酯具有清香或花香型香氣[11]。

2.2 萜烯類組分分析

本實驗中使用HS-SPME共檢測出5種萜烯類物質，包括α-萜品醇、4-松油醇、里那醇、香葉酮和紫羅蘭酮，其中α-萜品醇、4-松油醇和里那醇的含量非常高；而LLX只檢測到少量的紫羅蘭酮。

揮發性萜類物質如α-萜品醇、4-松油醇和里那醇等物質是由各種化學反應和酶轉移反應形成的[14]。α-萜品醇是酸解后產生的，有鳳梨香氣，4-松油醇具有泥土香氣和香辛料香氣，而里那醇賦予山楂汁強烈的花香并具有柑橘香氣[11，15]。紫羅蘭酮具有紫羅蘭的香氣，它是由檸檬醛與丙酮經縮合、環化直接合成得到的[16]。

2.3 醇類組分分析

從表1中可以看出，使用HS-SPME和LLX都檢測出2種醇類物質，包括順-3-己烯醇和反-3-己烯醇，且這兩種物質的含量差異較大，順-3-己烯醇是含量最高的香氣成分，而反-3-己烯醇含量較少。

山楂中亞油酸和亞麻酸的含量較高，通過脂肪氧化酶的降解途徑，亞麻酸最終轉化為順-3-己烯醇，而順-3-己烯醇具有強烈的新鮮青草香味，而且擴散力強，用于香精中，能產生滿意的新鮮香氣和自然感，并能掩蓋其他不良氣味[6]。

2.4 芳香類組分分析

根據表1所示，在山楂汁中共檢測到5種芳香類物質，其中2種物質是這兩種方法都檢測出的，分別為間二甲苯和鄰二甲苯，兩種物質含量差異較小。苯甲醇和2，4-二叔丁基苯酚是HS-SPME檢測出的，2，4-二叔丁基苯酚有香草味，而含量較大的苯甲醇具有花香味。LLX檢測出具有強烈的丁香氣味的丁子香酚[17]，其含量非常高，HS-SPME沒有檢測出這一物質。雖然有些物質含量很低，但是各香氣成分間的相互作用對山楂汁香氣形成有重要作用，即可構成該果汁的特征香氣成分，賦予山楂汁獨特的香氣風味。

2.5 其他組分分析

根據表1可以看出，HS-SPME和LLX同時都檢測出1種醛和1種呋喃類物質，分別為具有水果味的壬醛和燒烤味的糠醛[18]，且不同方法檢測出的各物質的含量差異不是很明顯。糠醛是由戊聚糖在酸的作用下水解生成戊糖，再由戊糖脫水環化而成。LLX中還檢測到檸檬酸，檸檬酸是山楂汁中重要的物質[19]，酸類化合物的產生源于脂肪酸合成酶的合成以及脂質β-氧化的降解。

3 結論

HS-SPME利用萃取頭直接頂空吸附樣品，吸附的物質主要是低沸點的酯類、醇類、萜烯類和芳香類等，LLX萃取的物質除了低沸點的酯類、醇類、芳香類外，還有高沸點的酸類和酯類等。HS-SPME和LLX分別檢測出21和20種香氣成分，其中酯類、醇類、芳香類和萜烯類是對香氣貢獻最大的四類組分。對于HS-SPME來說，順-3-己烯醇、α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯是主要香氣成分，其含量分別79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；對于LLX，順-3-己烯醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸是主要香氣成分，其含量分別67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。各香氣成分含量之間存在較大差異，但是各香氣成分間相互作用，共同賦予山楂汁獨特的香氣風味。

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Effect of different extraction method on the identification of aromatic com ponents of haw thorn juice

TIAN Tian-tian1，WANG Ji-wu2，WU Zhi-lian2，WANG Yang-yang1，NIU Hao1，ZHAO Yu-ping1，*
（1.College of Life Science，YantaiUniversity，Yantai264005，China；2.LvJie Co.，Ltd.，Longkou 265718，China）

To study the effect of different extrac tion methods on the aromatic com ponents of haw thorn juice，headspace solid phase m icro-extraction（HS-SPME）and liquid-liquid extraction（LLX）coup led w ith gas chromatog raphy mass spectrometry（GC-MS）were developed and app lied for the qualitative and sem iquantitative characterization of aroma com ponents of haw thorn juice.The results showed that a total of 21 com pounds were identified by HS-SPME.（Z）-3-hexen-1-ol，α-terp ineol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，benzyl alcohol and hexyl formate were the main com ponents，and its contents were 79.4，68.1，60.4，60.1，49.9，33.2μg/L，respec tively.Compared w ith HS-SPME，6 main aroma components were found by LLX，such as（Z）-3-hexen-1-ol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，eugenol，ethyl pyruvate and citric acid，and its contents were 67.9，63.4，57.4，51.4，34.5，30.3μg/L，respectively.Nevertheless，based on different p rincip les，the contents of aroma components were obvious d ifferences in contents w ith differentmethods.

haw thorn juice；aroma com ponents；HS-SPME；LLX；GC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.024

2013－12－09 *通訊聯系人

田甜甜（1987-），女，碩士研究生，研究方向：蒸餾酒風味分析。

山東省自然科學基金（ZR2011CM206）。