鹽水鴨中耐壓菌的分離鑒定及特性研究

馮郁藺，王虎虎，葉可萍，徐幸蓮，劉登勇，周光宏，*

（1.南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧錦州121013）

鹽水鴨中耐壓菌的分離鑒定及特性研究

馮郁藺1，王虎虎1，葉可萍1，徐幸蓮1，劉登勇2，*，周光宏1，*

（1.南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧錦州121013）

以確定鹽水鴨中耐壓菌的種類，及其致腐能力、耐鹽能力和在不同溫度下的生長情況等基礎特性為研究目的。采用400MPa（20℃、10min）處理鹽水鴨胸肉，25℃貯藏，以菌落總數判定其貨架期長短。利用傳統微生物學方法分離樣品中存在的耐壓菌，通過菌落形態、革蘭氏染色、細菌形態及Vitek 2系統鑒定耐壓菌種類。同時，研究耐壓菌的致腐能力及在不同NaCl濃度和溫度條件下的生長情況，探討其基礎特性。結果表明，超高壓400MPa（20℃、10min）殺菌處理可以有效抑制鹽水鴨中的細菌，并延長其貨架期。鹽水鴨中耐壓菌包括沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和蠟狀芽孢桿菌。其中，蠟狀芽孢桿菌的致腐能力較強，糞腸球菌產酸能力較強。4種耐壓菌在NaCl濃度低于7%條件下均可以較好的生長，均在35℃表現出最強的生長能力。

超高壓，鹽水鴨，耐壓菌，致腐特性

鹽水鴨是我國特有的低溫肉制品，歷史悠久，顏色潔白、組織細嫩、口感滑潤、風味獨特，深受消費者喜愛[1]。鹽水鴨傳統加工過程中，蒸煮溫度較低，加上蒸煮之后的冷卻、包裝等程序中的二次污染難以控制，導致大量細菌殘留。產品中殘留細菌在適宜條件下生長繁殖，使得鹽水鴨貨架期較短，嚴重制約了其產業的發展。目前，行業內主要采用傳統高溫處理方法作為二次殺菌，以此延長鹽水鴨的貨架期。但是由高溫殺菌引起的汁液滲出、營養成分的損失及風味的變化[2]，已不被追求高營養價值及高食用品質的消費者所接受，極大地影響了其市場的銷售。因此，不改變產品原有感官品質、營養價值及風味的殺菌技術成為研究熱點。

近年來，被譽為“20世紀的十大科技之一”的超高壓殺菌技術，在日本、歐洲各國及美國引起廣泛關注，取得了諸多成果[3]。超高壓殺菌技術以其優質的感官可接受性和微生物安全性備受青睞[4]。超高壓殺菌技術通過對微生物的抑制和鈍化作用延長產品的貨架期，導致肉制品中原有微生物種群結構改變[5]。超高壓處理后，產品中存在的耐壓菌成為貯藏期間的優勢微生物，主導產品的安全性及貨架期長短。因此，確定超高壓處理后產品中的耐壓菌種類及其致腐特性是超高壓實際應用中保證產品微生物安全性和質量的關鍵。

鑒于此，本實驗使用超高壓殺菌技術（400MPa、20℃、10min）處理鹽水鴨，通過傳統微生物方法分離、鑒定鹽水鴨中的耐壓菌，并研究其致腐能力、耐鹽能力和在不同溫度下的生長情況，為超高壓殺菌技術在鹽水鴨行業的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽水鴨 南京某鹽水鴨生產線；PCA平板計數瓊脂、LB液體培養基 北京陸橋有限公司；GN/GP/BCL細菌鑒定卡 法國梅里埃公司；生理生化鑒定所用培養基（產氨、產H2S、葡萄糖發酵） 購于北京陸橋有限公司；蛋白酶、脂肪酶的制備方法見參考文獻[6]。

S-IL-100-850-9-W超高壓設備 Stansted Fluid Power Ltd.，Stansted，UK；MultitronⅡ INFORS恒溫振蕩培養箱 LDX-50KBS；生物安全柜 The Baker Company；均質拍打機 法國Interscience公司；Vitek 2微生物鑒定及藥敏分析系統 法國梅里埃公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備及貯藏 鹽水鴨購于南京某鹽水鴨生產線，樣品不經二次殺菌及不添加任何保鮮防腐劑，用無菌取樣袋包裝，置于冰盒中于1h內送至實驗室，在無菌環境下分割鴨胸肉為研究對象，真空包裝后備用。

將真空包裝后的樣品分成2組，一組為對照組，一組為處理組，超高壓處理條件為：400MPa、室溫（20℃）、10min。超高壓處理后樣品及對照組樣品貯藏于25℃，根據實驗要求于0（各組初始菌落總數），1、2、3、4、5、6、7d分別取樣，每組3個重復，進行菌落總數的測定及單菌落的分離、純化。

1.2.2 菌落總數 無菌取25g樣品，稀釋于裝有225m L、0.85%的無菌生理鹽水的拍打袋中，以8次/s的速率均質拍打1m in，取1m L上清液依次進行10倍遞增稀釋，選3個合適的稀釋度，每個稀釋度做2個平行，按照《GB 4789.2-2010食品微生物學檢驗菌落總數測定》[7]進行測定。

1.2.3 耐壓菌的分離及純化 計數完畢，于400MPa處理組的不同貯藏期檢測培養基中，挑選菌落數在30～300個的平板，從中無菌挑取形態差異不同的菌落，平板劃線法反復進行分離、純化（3次），得到純菌，觀察其菌落形態，進行革蘭氏染色判斷其陽性或陰性，并觀察菌株個體形態。獲得的純種細菌-2℃條件下保存在含有70%的LB液體培養基和30%的滅菌甘油溶液中，待菌種鑒定。

1.2.4 耐壓菌的鑒定 取培養24h的單一菌落，置于裝有0.45%生理鹽水的試管中，用標準比濁計測菌液濃度，最終配制成0.5～0.7（芽孢桿菌為2）麥氏單位的菌懸液。將試管放到樣品架上，依據革蘭氏染色結果，選擇陽性、陰性細菌或芽孢桿菌鑒定卡，將測試卡放在載卡架上，輸樣管浸入裝有待測菌液的標準管中。將載卡架放入儀器的填充倉，掃描卡片信息結束后，取出載卡架并放入裝載倉。自動進行封口和上卡，進行生化鑒定。

1.2.5 致腐特性的測定

1.2.5.1 產粘 將分離得到的細菌菌株分別接種于營養瓊脂培養基，37℃培養24h，接種環挑取菌落判斷其粘性。

1.2.5.2 產氨 將分離得到的細菌菌株分別接種于產氨培養基中，37℃培養24h，滴加3～5滴氨試劑，觀察沉淀生成情況，產生黃色或棕紅色沉淀者為陽性，否則為陰性，3個重復。

1.2.5.3 產H2S 將分離得到的細菌將分離得到的細菌菌株分別穿刺接種于H2S培養基中，37℃培養2d，沿穿刺線產生黑色沉淀的為陽性，否則為陰性，3個重復。1.2.5.4 產酸 將分離得到的細菌菌株分別接種于液體培養基，37℃培養24h，測定其pH，5個重復。

1.2.5.5 產氣 將分離得到的細菌菌株分別接種于葡萄糖發酵培養基中，37℃培養24h，杜氏小管內有氣泡產生者為陽性，否則為陰性，3個重復。

1.2.5.6 蛋白酶活力的測定 將分離得到的細菌菌株分別接種于LB液體培養基中，37℃培養24h，8000×g離心5min，收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水清洗兩次，再以無菌生理鹽水制成菌液。取0.05m L菌液涂布于酪蛋白培養基上，37℃培養5d，于菌落周圍滴加10%（v/v）三氯乙酸，觀察菌落周圍是否出現透明圈并測其直徑d（d＜0.1cm為產酶能力弱，0.1cm＜d＜0.5cm為產酶能力中等，d＞0.5cm為產酶能力強），3個重復。

1.2.5.7 菌株脂肪酶活力測定 將分離得到的細菌菌株分別接種于LB液體培養基中，37℃培養24h，8000×g離心5m in，收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水清洗兩次，再以無菌生理鹽水制成菌液。取0.05m L菌液涂布于豬背脂培養基上，37℃培養5d，觀察菌落周圍是否出現透明圈并測其直徑d（d＜0.1cm為產酶能力弱，0.1cm＜d＜0.5cm為產酶能力中等，d＞0.5cm為產酶能力強），3個重復。

1.2.6 耐鹽特性 將分離得到的細菌菌株分別接種于NaCl濃度為1%、4%、7%、10%、13%和16%（w/v）的液體培養基中，37℃培養24h，測其OD600值，以未接菌株的培養基作為空白對照，3個重復。

1.2.7 不同溫度條件下的生長 將分離得到的細菌菌株接種于LB液體培養基中，分別在4、15、25、35、45、55℃培養24h，測其OD600值，均以未接菌株的培養基作為空白對照，3個重復。

1.3 數據處理

數據統計采用SPSS 18.0進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重比較（p＜0.05）；圖形制作使用Origin 9.0。

2 結果與討論

2.1 菌落總數的變化

超高壓處理組及對照組樣品在25℃貯藏過程中菌落總數的變化如圖1所示。樣品的初始菌數在2.80lg CFU/g，超高壓處理后，菌落總數未能檢出，說明超高壓對微生物抑制效應較為明顯。在貯藏前期，超高壓處理后存活的耐壓菌受到抑制難以檢測，因此處理組樣品中的細菌表現為一段時間的遲滯生長。隨著貯藏時間的延長，處于受傷狀態的耐壓菌利用肉制品的營養基質進行修復，快速增長，在第4d超過鹽水鴨可接受的最大菌落總數值（4.9lg CFU/g），到達貨架期終點。對照組樣品在第2d超過4.9lg CFU/g，到達貨架期終點。

表1 分離菌株的菌落特征和細菌個體形態Table 1 Characteristics of Community and Morphology of Isolation Strains

圖1 各組樣品在25°C貯藏過程中菌落總數的變化Fig.1 Microbial growth of different samples during storage at25℃

由菌落總數的變化可以得出，400MPa的殺菌處理能夠有效地抑制細菌的生長，并延長鹽水鴨胸肉的貨架期。這與眾多研究[8-10]表明超高壓可以顯著延長肉制品的貨架期結果一致。但是，400MPa殺菌處理后，細菌表現出的遲滯期較短，之后迅速增長，這可能與貯藏溫度（25℃）有關，研究證實超高壓受傷細菌在適宜的溫度下，2～4h即可修復[11]。Linton等[12]研究表明500MPa處理的雞肉產品在貯藏182d時菌落總數仍未發生顯著性變化。因此，不同貯藏溫度對超高壓的抑菌效果有較大影響，本實驗中的25℃適宜細菌生長，受傷的耐壓菌迅速恢復其生長繁殖能力，導致貯藏后期產品中菌落總數快速增長。

2.2 菌株的菌落特征和細菌個體形態

400MPa處理鹽水鴨胸肉在25℃貯藏過程中，從PCA培養基上具有典型的菌落共挑選出35株純菌株，經反復進行形態學觀察和比較，最后確定4株在菌落形態或細菌個體形態上有差異的純菌株。分離菌株的菌落特征、細菌個體形態及革蘭氏染色結果見表1。

2.3 耐壓菌的生化鑒定

分離菌株通過Vitek2微生物自動鑒定系統鑒定，結果見表2。其中，沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）及糞腸球菌（Enterococcus faecalis）鑒定結果相似性分別達到98%、99%和97%，準確性高。由于芽孢桿菌屬中的蠟狀芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的形態特征和生理生化特征非常相似[13]，Vitek2鑒定結果為相似細菌，因此，采用補充實驗加以區分。通過是否存在伴孢晶體及根狀菌落的形態區分上述三種細菌，補充實驗結果表明分離得到的純菌為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

表2 耐壓菌Vitek2鑒定結果Table 2 Identification results of pressure-resistantbacteria by VITEKⅡsystem

由鑒定結果可知，沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和芽孢桿菌是超高壓（400MPa）處理后鹽水鴨中主要的存活細菌，即鹽水鴨胸肉中的耐壓菌。4種耐壓菌均為革蘭氏陽性菌，與近年來研究表明革蘭氏陽性細菌對壓力表現出一定的耐受性結果一致[14]。葡萄球菌是禽類及加工環境中常存在的細菌，也有研究表明其具有較好的耐壓特性[15]。糞腸球菌存在許多肉制品中，能夠在高鹽、低水分活度條件下生長，并且對超高壓表現出很強的抵抗作用[16]。芽孢桿菌被證實是對超高壓具有抵抗力最強的細菌種類，對蠟狀芽孢桿菌抑制作用也是超高壓殺菌技術中較難解決的問題之一[17]。

2.4 致腐能力

鹽水鴨胸肉中耐壓菌的致腐特性見表3。4種耐壓菌均不產氣，均具有產氨的能力，產酸能力測定中空白培養基的pH為6.98，接種4種耐壓菌的液體培養基pH均低于6.98，說明4種耐壓菌均具有產酸能力。接種糞腸球菌液體培養基的pH為6.12，說明產酸能力在4種耐壓菌中最強，但是其產酪蛋白酶和脂肪酶的能力相對較弱，對肉制品中的蛋白質的分解利用程度較低，致腐能力較弱。蠟狀芽孢桿菌產酸能力相對較弱，產粘、產酪蛋白酶及脂肪酶的能力相對較強，這與Valerie等[18]對蠟狀芽孢桿菌分泌蛋白酶和脂肪酶能力的研究結果基本相同。蛋白酶的分泌可以引起蛋白質分解，造成肉制品腐敗變質；脂肪在細菌分泌的脂肪酶作用下，發生水解，導致肉制品酸敗變質。同時，蠟狀芽孢桿菌產H2S，可能會使產品產生異味。因此，蠟狀芽孢桿菌的致腐能力較強。

表3 耐壓菌的腐敗特性Table 3 Spoilage characteristics of pressure-resistantbacteria

2.5 耐鹽特性

鹽水鴨胸肉中耐壓菌在不同NaCl濃度條件下的生長情況如圖2所示。結果表明，耐壓菌的生長量均隨NaCl濃度的增加而降低，4種耐壓菌在NaCl濃度小于7%均有很好的生長能力。在10%NaCl濃度液體培養基中，沃氏葡萄球菌的OD600值在0.14，仍存在生長，其他3種耐壓菌的OD600值均小于0.05，生長很弱。NaCl濃度大于13%時，4種耐壓菌的OD600值分別為0.019、0.006、0.015和0.013，幾乎沒有生長能力。

圖2 耐壓菌在不同NaCl濃度條件下生長情況Fig.2 Effect of NaCl concentrations on the growth ofpressure-resistantbacteria

綜上可知，4種耐壓菌均有較好的耐鹽能力，其中沃氏葡萄球菌的耐鹽能力在4種耐壓菌中最強，與研究表明葡萄球菌具有較高的耐鹽特性的結果一致[19]。同樣，糞腸球菌可以在6.5%NaCl濃度下生長也被證實[20]。由于鹽水鴨的含鹽量為4.0%左右，因此在鹽水鴨胸肉中4種耐壓菌都能正常生長。

2.6 不同溫度條件下的生長情況

鹽水鴨胸肉中耐壓菌在不同溫度條件下的生長情況如圖3所示。可以得出，4種耐壓菌在4℃和15℃條件下，生長能力很弱；隨著溫度的升高，4種菌生長能力逐漸增強，在35℃時到達最佳生長狀態；在45℃時，4種耐壓菌生長能力減弱；在55℃時，基本不生長。

綜上可知，4種耐壓菌均不耐低溫及55℃高溫，在25～45℃有較好的生長能力，最適宜生長溫度均為35℃，此時生長能力最強。這解釋了本實驗超高壓殺菌后樣品中細菌迅速增長的原因，即4種耐壓菌在貯藏溫度條件下（25℃）有很好的生長能力，同時利用樣品中的營養價值進行修復，從而快速恢復其生長繁殖能力。這與研究表明超高壓受傷菌在適宜的溫度下可快速修復受損細胞結果一致[21]。

圖3 耐壓菌在不同溫度條件下生長情況Fig.3 Effectof temperature on the growth of pressure-resistantbacteria

3 結論

超高壓（400MPa）殺菌處理可以有效抑制鹽水鴨中的細菌，并延長其貨架期。鹽水鴨中耐壓菌包括沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和蠟狀芽孢桿菌。其中，蠟狀芽孢桿菌的致腐能力較強，糞腸球菌產酸能力較強。4種耐壓菌在7%NaCl濃度條件下均可以較好的生長，在35℃均表現出最強的生長能力。

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Study on identification and basic characteristics of the pressure-resistant bacteria isolated in Nanjing water-boiled salted duck

FENG Yu-lin1，WANG Hu-hu1，YE Ke-ping1，XU Xing-lian1，LIU Deng-yong2，*，ZHOU Guang-hong1，*
（1.Key Laboratory ofMeat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Food Science Research Institute，BohaiUniversity，Jinzhou 121013，China）

The p ressure-resistant bacteria in Nanjing water-boiled salted duck，and evaluate the spoilage capability，the tolerance to NaCl and grow th at d ifferent tem peratures of the p ressure-resistant bac teria were determ ined.The breast of the duck was treated by 400MPa（20℃，10m in）and stored at 25℃，and the total number of colonies was used to tell the shelf-life.We used culture-dependentmethod to isolate the p ressureresistant bacteria，which were identified by colony morphology，Gram stain，bacterialmorphology and VitekⅡsystem.What’s more，the spoilage capability and the g row th at d ifferent NaCl concentrations and different tem peratures were stud ied.The results showed that high p ressure 400MPa（20℃，10m in）treatment con effectively inhibit the bac teria in the breast and p rolong its shelf life.The p ressure-resistant bacteria inc luded Staphylococcus warneri，Staphylococcus ep iderm id is，Enterococcus faecalis and Bacillus cereus.Among them，Bacillus cereus had potential spoilage capability，and Enterococcus faecalis had acid p roduction capacity. These p ressure-resistant bacteria could grow well at 7%NaCl concentration，and showed the strongest ability to g row at35℃.

high p ressure；Nanjing water-boiled salted duck；p ressure-resistantbacteria；spoilage characteristics

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.027

2013－12－18 *通訊聯系人

馮郁藺（1988-），女，碩士研究生，研究方向：肉品質量安全控制。

中央高校基本科研業務費專項資金（KYZ201155）；十二五支撐計劃（2012BAD28B03）。