液態發酵法生產花生抗氧化肽和中性蛋白酶的工藝優化

劉紅梅，師廣波，馬艷芳，李向東，孫中濤，*

（1.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018；2.山東農業大學農學院，山東泰安271018）

液態發酵法生產花生抗氧化肽和中性蛋白酶的工藝優化

劉紅梅1，師廣波1，馬艷芳1，李向東2，孫中濤1，*

（1.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018；2.山東農業大學農學院，山東泰安271018）

以花生粕為原料，采用枯草芽孢桿菌AS1.398進行液態發酵生產抗氧化肽的過程中，可以積累大量的副產物——中性蛋白酶。單因素和中心組合實驗結果表明，同時生產抗氧化肽和中性蛋白酶的最佳工藝條件為接種量1%（v/v），pH自然，發酵溫度34℃，發酵時間71h，在此條件下，發酵液的理論DPPH自由基清除率為81.51%，中性蛋白酶活力為600U/mL。

花生粕，抗氧化肽，枯草芽孢桿菌AS1.398，液態發酵，中性蛋白酶，中心組合實驗

我國花生粕資源豐富，年產量逾150萬t，位列世界首位[1]。花生粕蛋白質含量高達50%左右，氨基酸組成合理，價格相對低廉，是一種優質的蛋白資源。但因其溶解性較差，目前多用作蛋白飼料，在食品工業中應用很少[2]。近年來，采用蛋白酶對花生粕進行適度水解生產抗氧化肽的研究備受關注，花生蛋白水解成低分子肽后，不僅溶解性增強，易于消化吸收，還具有較強的抗氧化性等生理活性，可用于功能性食品以減輕氧自由基對人體的損害，也可作為天然抗氧化劑用于食品工業[3]。

生物體內發生氧化反應時，會產生氧自由基和活性氧簇[4]。氧自由基和活性氧簇如不能及時清除，會引發許多疾病，如中風和癌癥等[5]。在食品工業中，氧自由基和活性氧簇可引起脂質氧化，導致食品變質[6]。花生肽具有很強的抗氧化性，可以狙滅氧自由基和活性氧簇，從而消除其危害性[7]。

花生肽的生產方式有兩種：即酶解法和發酵法。酶解法反應條件溫和、生產周期短，但需消耗大量的食品級蛋白酶制劑，購買酶制劑的費用高達總生產成本的40%～50%。發酵法雖然不需額外添加蛋白酶，但因發酵周期長，發酵過程需通入大量無菌空氣，生產成本也居高不下。發酵法生產花生抗氧化肽的過程中，微生物可以分泌大量的蛋白酶，但目前沒有對其進行綜合利用。本研究以花生粕為原料，采用枯草芽孢桿菌進行發酵，生產抗氧化肽的同時，盡可能提高發酵液的蛋白酶活力。將花生抗氧化肽和蛋白酶兩種產品耦合在同一個生產過程中，可以提高生產收益，降低花生抗氧化肽的生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生粕 購自泰安，蛋白質含量46.88%（w/w）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）自由基、D-果糖與福林酚試劑 均購自Solarbio公司；甘氨酸 購自Sanland-chem International Inc；其他試劑 均為國產分析純；枯草芽孢桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709、植物乳桿菌和米曲霉 均由山東農業大學發酵工程實驗室提供，其中枯草芽孢桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709和植物乳桿菌的菌種保存均采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂2.5g/L；米曲霉的保存采用麩皮培養基：麩皮50g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L；活化培養基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L；發酵培養基：花生粕100g/L；將培養基121℃滅菌20m in，冷卻備用。

SW-CJ-1FD凈化工作臺 常州凈化設備有限公司；THZ-C恒溫搖床 太倉市實驗設備廠；LDZX-40BI型壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；Spectrum lab S22分光光度計 上海棱光技術有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；JA1003電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；Anke TGL-16B離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵菌種的選擇 從菌種斜面上挑取一環菌種，接入發酵培養基中，于180r/min振蕩培養72h。發酵結束后，發酵液于12000r/m in離心5m in，取上清液測定酸溶性多肽含量、水解度及抗氧化能力。

1.2.2 單因素實驗 從斜面培養基上挑取一環菌種，接入活化培養基，37℃搖床150～180r/min活化培養8～12h后，接入發酵培養基。在選定的溫度和pH下，于150～180r/min進行發酵。發酵結束后，12000r/min離心5m in，測定上清液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力。

發酵時間單因素實驗的發酵條件：接種量1%（v/v）、30℃和自然pH，發酵時間分別為12、24、36、48、60、72h；接種量單因素實驗的發酵條件：37℃、自然pH和72h，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%（v/v）；pH單因素實驗的發酵條件：接種量1%（v/v）、37℃和72h，pH分別為5、6、7、8、9；溫度單因素實驗的發酵條件：接種量1%（v/v）、自然pH和72h，溫度分別為30、33、37、40、44℃。

1.2.3 中心組合實驗 由于接種量對發酵液的DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的影響不顯著，調節pH對產品的質量造成影響，因此選擇發酵溫度和時間兩個因素設計中心組合實驗。固定接種量1%（v/v），pH自然，其余因素與水平見表1。為使擬合方程具有旋轉性和通用性，中心點重復5次。實驗數據采用Design Expert 7.1進行多元回歸分析并構建二次多項式數學模型：

表1 中心組合實驗的因素和水平Table 1 Experimental factors and levels of the independent variables in Central Composite Design

式中，Y：響應值（DPPH自由基清除率和蛋白酶活力）；xi、xj：自變量編碼值；βo：常系數；βi：線性系數；βii：二次項系數；βij：交互項系數。

1.3 分析方法

1.3.1 酸溶性多肽含量測定 發酵液于12000r/m離心5min，取上清液，加入等體積的10%（w/w）的三氯乙酸，混勻后室溫放置10min，再于8000r/min離心20min，取上清液，利用雙縮脲法測定其酸溶性多肽的含量[8]。

1.3.2 蛋白酶活力測定 采用Folin-酚法[9]。發酵液于12000r/min離心5min，取上清液并進行適當稀釋后測定蛋白酶的活力。

1.3.3 水解度的測定 水解度是水解過程中斷裂的肽鍵數占總肽鍵數的百分比。肽鍵斷裂后生成多肽或氨基酸，ɑ-氨基氮含量增加，因此，水解度可根據水解過程中生成的ɑ-氨基氮的數量，依據式（2）計算。

水解后生成的ɑ-氨基氮的量采用茚三酮法[10]測定，樣品總含氮量采用凱氏定氮法[11]測定。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定 采用Yama的方法[12]：發酵液于12000r/m in離心5m in，取上清液并進行適當稀釋。取2m L稀釋液，加入到2m L 0.1～0.2mmol/L的DPPH無水乙醇溶液中，混勻，室溫下避光放置30min，于517nm測定吸光值A1。以95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，按上述方法測定吸光度A2，以95%乙醇溶液代替待檢樣品，按上述方法測定吸光度A3。DPPH自由基清除率按下式計算：

1.4 數據分析

單因素實驗采用DPS 7.05對數據進行顯著性差異分析，中心組合實驗采用Design Expert 7.1對數據進行響應面分析。

2 結果與討論

2.1 不同菌種對多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖1 不同菌種對多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effectof different strains on TCA-soluble polypeptides content，degree ofhydrolysisand DPPH radical scavenging ability

不同菌種對發酵液的酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖1所示。不同菌種的發酵液酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率差異顯著（p＜0.05）。枯草芽孢桿菌AS1.398發酵液的酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率均顯著高于其他菌種的發酵液，尤其是DPPH自由基清除率。這是因為枯草芽孢桿菌AS1.398是酶制劑工業中生產中性蛋白酶普遍采用的菌種，具有很強的產酶能力，對花生蛋白分解能力強。因此，本研究選擇枯草芽孢桿菌AS1.398作為發酵菌種。

2.2 發酵時間對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

發酵時間對發酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖2所示。隨著發酵時間的延長，蛋白酶活力迅速升高，水解度緩慢升高，但DPPH自由基清除率緩慢降低。DPPH自由基清除率逐漸下降，這是因為發酵過程中一些抗氧化能力強的肽段會因蛋白質的水解而產生，也會因進一步水解成小分子肽或被枯草芽孢桿菌同化吸收而喪失其抗氧化性。此規律與柳杰[13]的研究結果恰巧相反，是因為采用的菌種不同，導致產生的酶系不同，對花生粕的作用機理也就不同。在發酵時間12h時，DPPH自由基清除率比柳杰的高約50%，是因為發酵培養基中花生粕的質量濃度和發酵液的稀釋倍數不一樣。發酵時間短些，雖然發酵液的DPPH自由基清除率較高，但因花生蛋白的水解度低，可溶性的肽含量少，產品收率低，溶解性也差。延長發酵時間，雖然蛋白酶活力增高，產品水解度增大，但其抗氧化性會下降。因此，綜合考慮花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力，宜選擇54h作為最佳發酵時間。

圖2 發酵時間對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effectof fermentation time on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

2.3 接種量對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

接種量對發酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖3所示。當接種量在1%～5%（v/v）之間變化時，DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力差異均不顯著（p＞0.05）。實際生產中，選擇1%～2%（v/v）的接種量即可。

2.4 pH對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

pH對發酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖4所示。在pH 5～9的范圍內，DPPH自由基清除率和水解度變化不顯著（p＞0.05），蛋白酶活力變化顯著（p＜0.05）。在pH 7時，蛋白酶活力最高。發酵液的自然pH為5.7，因其緩沖性較強，如進行調節，會消耗較多的NaOH，導致產品中鹽分含量過高，影響產品質量。因此，綜合考慮產品質量和蛋白酶活力，生產中宜選用自然pH進行發酵。

圖3 接種量對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.3 Effectof inoculum level on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

圖4 pH對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.4 Effectof pH on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

2.5 發酵溫度對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

發酵溫度對發酵液DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖5所示。37℃是枯草芽孢桿菌AS1.398的最佳產酶溫度，此時發酵液的蛋白酶活力最大。水解度受蛋白酶數量和溫度的雙重影響，40℃時蛋白酶產量僅為37℃時的53.6%，但其水解度卻比37℃時高（p＜0.05），其原因是溫度較高時酶促反應速度快，彌補了蛋白酶數量的減少。DPPH自由基清除率的變化比較復雜，溫度在30～44℃之間變化時，DPPH自由基清除率呈現先減小后增加的變化趨勢，但變化幅度不大。DPPH自由基清除率與水解度的變化規律不一致，說明并非水解度越高抗氧化性越強，這與Vilailak的研究結果是一致的[14]。因此，優化生產工藝時，宜以提高抗氧化性為目的，而不是單純的提高水解度。

2.6 中心組合實驗結果

中心組合實驗結果如表2所示。采用Design Expert 7.1軟件對實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得DPPH自由基清除率Y1和蛋白酶活力Y2對溫度（A）和時間（B）兩個因素的回歸方程：

圖5 溫度對DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.5 Effectof temperature on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

表2 中心組合實驗結果Table 2 Experimental results of central composite design

方差分析結果如表3所示。DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的兩個回歸模型均高度顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），相關系數R2分別為0.9917和0.9732，表明其擬合度和可信度均較高，能夠很好的對發酵過程進行描述與預測。模型的一次項B、交互項AB和二次項A2、B2對DPPH自由基清除率的影響極顯著（p＜0.01），一次項A對DPPH自由基清除率的影響顯著（p＜0.05）；一次項A和B、交互項AB和二次項A2對蛋白酶活力的影響極顯著（p＜0.01），二次項B2對蛋白酶活力的影響顯著（p＜0.05）。為了更直觀地描述溫度與時間對DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的影響，利用Design Expert 7.1軟件繪制其響應面圖，如圖6所示。由圖6（a）可知，當時間不變時，隨著溫度的升高，DPPH自由基清除率先增大后趨于平穩，變化幅度較大；當溫度不變時，隨著時間的延長，DPPH自由基清除率先增大后減小，變化幅度較大。綜合得出，當溫度在36.82℃，時間在57.70h時，DPPH自由基清除率達到極值85.45%。由圖6（b）可知，固定時間不變，當時間較短時，隨著溫度的升高，蛋白酶活力先升高后趨于平穩，變化幅度較小；當時間較長時，隨著溫度的升高，蛋白酶活力逐漸減小，變化幅度較大。固定溫度不變，當溫度較低時，隨著時間的延長，蛋白酶活力逐漸增大，變化幅度較大；當溫度較高時，隨著時間的延長，蛋白酶活力變化不明顯。由此可以看出，溫度和時間對蛋白酶活力的交互影響比較大。在實際生產中必須兼顧DPPH自由基清除率和蛋白酶活力，因此，我們將二者設定為相同的權重進行優化求解，模型預測的最佳點的編碼值為A=-0.73、B=0.94，解碼后可得其真實值，即溫度34℃，時間71h，在此條件下，理論DPPH自由基清除率為81.51%，蛋白酶活力為600U/m L。

表3 中心組合實驗的回歸分析結果Table 3 Regression results from the data of Central Composite Design

圖6 溫度和時間對DPPH自由基清除率（a）與蛋白酶活力（b）影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing effectof temperature and time on DPPH radical scavenging ability（a）and protease activity（b）

3 結論

采用枯草芽孢桿菌AS1.398對花生粕進行液態發酵生產抗氧化肽的同時，可以產生大量的中性蛋白酶，對此副產物進行回收利用，可以提高經濟效益。研究結果表明，同時生產抗氧化肽和中性蛋白酶的最佳工藝條件為接種量1%（v/v），pH自然，溫度34℃，時間71h，在此條件下，發酵液的理論DPPH自由基清除率為81.51%，中性蛋白酶活力為600U/m L。本文將花生肽的生產和蛋白酶的生產耦合到同一個發酵過程中，對花生肽、大豆肽等肽類生產過程中如何充分利用副產物蛋白酶，以及對蛋白酶生產過程中如何充分利用副產物小分子肽都具有參考價值。

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Optim ization of the production of peanut antioxidative peptides and Neutrase using liquid state fermentation

LIU Hong-mei1，SHIGuang-bo1，MA Yan-fang1，LIXiang-dong2，SUN Zhong-tao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China；2.College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

A large amount of by-p roduc t-Neutrase could be accumulated during the liquid state fermentation of Bacillus sub tilis AS 1.398 to p roduce antioxidant pep tides w ith peanut meal as raw material.The results of sing le factor investigations and central com posite design showed that，the op timum conditions to p roduce antioxidantpep tides and Neutrase at the same time were inoculation amountof 1%（v/v），naturalpH，fermentation tem perature of 34℃，fermentation time of 71h.Under these cond itions，the DPPH rad ical scavenging ability of fermentation liquid p redicted was 81.51%and the activity of Neurtase was 600U/m L.

peanutmeal；antioxidative pep tides；Bacillus sub tilis AS 1.398；liquid state fermentation；Neutrase；central com posite design

TS218

A

1002-0306（2014）18-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.029

2013－12－09 *通訊聯系人

劉紅梅（1988-），女，碩士研究生，研究方向：發酵工程與酶工程。