高產(chǎn)胞外多糖干酪乳桿菌的太空誘變選育

李雄超，張衛(wèi)兵，*，梁　琪，李學(xué)朋，張　炎，宋雪梅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）

高產(chǎn)胞外多糖干酪乳桿菌的太空誘變選育

李雄超1，2，張衛(wèi)兵1，2，*，梁琪1，2，李學(xué)朋1，2，張炎1，2，宋雪梅1，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）

為了提高干酪乳桿菌G5的胞外多糖產(chǎn)生能力，采用太空誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行選育，從中篩選出高產(chǎn)胞外多糖菌株。通過富集培養(yǎng)、平板篩選、脫脂乳發(fā)酵和遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，最終得到兩株高產(chǎn)胞外多糖且遺傳穩(wěn)定性較好的突變株EPS-33和EPS-43。突變株EPS-33和EPS-43在25℃發(fā)酵脫脂乳，發(fā)酵結(jié)束時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量分別220.42和198.49mg/L，為出發(fā)菌株的1.9倍和1.7倍。2個(gè)突變菌株與出發(fā)菌株產(chǎn)胞外多糖的變化趨勢基本相同，但產(chǎn)量大幅增加。

太空誘變，干酪乳桿菌，胞外多糖

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是由微型藻類或細(xì)菌在生長過程中分泌到細(xì)胞外的一類糖類化學(xué)物。已報(bào)道的產(chǎn)胞外多糖細(xì)菌有乳酸菌、腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖有的依附于微生物細(xì)胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的進(jìn)入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖，這兩者都屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，分子量一般在4.0×104～6.0×106u之間[1-3]。乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖可賦予食品特殊的口感和風(fēng)味，增強(qiáng)食品的穩(wěn)定性和持水性，可作為食品添加劑被廣泛地運(yùn)用在食品加工中。并且胞外多糖還具有促進(jìn)腸道菌群生長、增強(qiáng)免疫活性、抗腫瘤及降低結(jié)腸癌發(fā)病率等多種功能，可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[4-5]。

太空誘變技術(shù)是利用衛(wèi)星、飛船等返回式航天器將菌株搭載到宇宙空間中，在微重力、高真空、強(qiáng)輻射、交變磁場、超凈環(huán)境等太空誘變因子的作用下使菌株的遺傳性狀發(fā)生改變[6]的相對(duì)常規(guī)的物理或化學(xué)誘變技術(shù)，太空誘變技術(shù)具有誘變率高、誘變多向、育種周期短等特點(diǎn)。近年來，太空誘變技術(shù)在微生物育種方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用，通過太空誘變技術(shù)得到許多性狀優(yōu)良的菌株，其中包括可高效利用木糖生產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌、高產(chǎn)山梨糖的生黑醋酸桿菌、高產(chǎn)泰樂菌素的弗氏鏈霉菌等[7-9]。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室篩選的干酪乳桿菌G5[10]為出發(fā)菌株，利用太空誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變處理，以期獲得高產(chǎn)胞外多糖的突變株。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

菌粉干酪乳桿菌凍干成菌粉后搭載神州八號(hào)飛船進(jìn)行太空誘變；脫脂乳粉購自完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司。

YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)杭州雷磁儀器分析廠；754PC型紫外可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；Yx-280A型手提式壓力蒸汽滅菌器合肥華奉醫(yī)療設(shè)備有限公司；BP121S型電子天平德國賽多利斯集團(tuán)；LVDV-1型粘度計(jì)上海萬磁儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)流程出發(fā)菌株→凍干粉→太空誘變→復(fù)水→富集培養(yǎng)→平板篩選→脫脂乳發(fā)酵→高產(chǎn)突變株篩選→遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)→產(chǎn)胞外多糖曲線。

1.2.2培養(yǎng)基MRS固體培養(yǎng)基[11]：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-80 1m L，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，瓊脂15g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.4，121℃滅菌20m in。

MRS液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分同固體培養(yǎng)基，不加瓊脂。

脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：脫脂乳粉9g，蒸餾水100m L，115℃滅菌15m in。調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0。

1.2.3富集培養(yǎng)將5m L無菌生理鹽水加入經(jīng)太空誘變的凍干菌粉，充分溶解后取1m L菌液接入10m L MRS液體培養(yǎng)基中，25℃厭氧培養(yǎng)48h。連續(xù)進(jìn)行3次富集培養(yǎng)后，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4平板篩選取1m L富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數(shù)的菌液涂布在MRS平板上，25℃厭氧培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)特征。用無菌牙簽接觸菌落，輕輕挑起并垂直離開，觀察菌落在培養(yǎng)基表面的拉絲情況[12-14]。挑選粘性菌落進(jìn)行MRS平板劃線分離，25℃厭氧培養(yǎng)24h后將轉(zhuǎn)接入MRS斜面培養(yǎng)基，25℃厭氧培養(yǎng)24h，待長好后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5發(fā)酵性能測定挑取一環(huán)斜面菌種接入10m L脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃厭氧培養(yǎng)，連續(xù)活化3次。活化后的菌株按3%（V/V）的接種量接種到150m L脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃厭氧培養(yǎng)，記錄其凝乳時(shí)間和凝乳狀態(tài)。發(fā)酵結(jié)束后測定粘度和滴定酸度[11]。

1.2.6胞外多糖的提取精確量取10m L發(fā)酵乳，沸水浴加熱30min后，10000r/min、4℃離心5min，去除沉淀，向上清液中加入1m L 15%TCA后充分?jǐn)嚢瑁o置30m in后10000r/m in、4℃離心15m in，去除沉淀后取上清液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8，然后于10000r/m in、4℃離心15m in，去除沉淀后取上清液，向其中按1∶5（V/V）加入無水乙醇，使乙醇的濃度大于80%，4℃靜置12h；然后于15000r/m in、4℃離心30m in，棄去上清液，取沉淀用無水乙醇洗滌；將洗滌過的沉淀用10m L蒸餾水溶解，蒸餾水透析48h，每4h換一次水[15]。透析后用蒸餾水定容到100m L待用。

1.2.7胞外多糖產(chǎn)量的測定胞外多糖產(chǎn)量的測定使用苯酚硫酸法[15-17]，用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖1.00g，置于1000m L容量瓶中，蒸餾水定容。再分別吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0m L加入100m L容量瓶中定容，蒸餾水做空白對(duì)照。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1m L，于室溫下向其中加入5%苯酚1m L并搖勻，再快速向其中加入5m L濃硫酸。待反應(yīng)結(jié)束溶液冷卻至室溫時(shí)，用紫外分光光度計(jì)于490nm處測其吸光度。空白樣以1m L蒸餾水按照同樣的步驟進(jìn)行。

取1m L樣液，于室溫下向其中加入5%苯酚1m L并搖勻，再快速向其中加入5m L濃硫酸。待反應(yīng)結(jié)束溶液冷卻至室溫時(shí)，用紫外分光光度計(jì)于490nm處測定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算樣品中胞外多糖含量：

式中：C—胞外多糖含量，單位為毫克每升（mg·L-1）；100—表示樣品定容到100m L；10—表示發(fā)酵乳樣品體積為10m L；A—樣品在490nm處的吸光度。

1.2.8遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將篩選出來的高產(chǎn)胞外多糖菌株按3%（V/V）的接種量，接種到脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)15代，測定其第1～15代的胞外多糖產(chǎn)量，考察菌株產(chǎn)胞外多糖的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響將篩選出來的高產(chǎn)胞外多糖菌株與出發(fā)菌株以3%（V/V）的接種量，分別接種到脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃厭氧培養(yǎng)，每1h測定一次胞外多糖含量，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1平板篩選結(jié)果

經(jīng)太空誘變的菌株富集培養(yǎng)后用MRS平板分離，部分菌株在MRS平板上的菌落形態(tài)特征如表1所示。

從表1可以看出，在太空誘變前，菌株表面無光澤，菌落呈隆起狀。經(jīng)過太空誘變后，部分菌株菌落變?yōu)楸砻嬗泄鉂桑浔馄剑溥吘壒饣秸３霭l(fā)菌株沒有出現(xiàn)拉絲，為非粘菌落；誘變后部分菌株呈現(xiàn)出拉絲狀，為粘絲菌落，可根據(jù)菌落的這一特性對(duì)高產(chǎn)胞外多糖的菌株進(jìn)行初篩。從中共篩選出44株菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2發(fā)酵性能測定

將篩選得到的44株菌進(jìn)行脫脂乳發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，記錄各菌株的發(fā)酵時(shí)間，并觀察其凝乳狀態(tài)，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，相比出發(fā)菌株G5，大部分突變株的發(fā)酵時(shí)間保持不變，僅有EPS-1、EPS-17、EPS-40三株菌發(fā)酵時(shí)間變長。大部分突變株的滴定酸度保持不變，滴定酸度在81～85°T范圍內(nèi)，少部分突變株如EPS-10、EPS-43的滴定酸度略有提升，達(dá)到89°T。大部分突變株發(fā)酵乳的組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)相比出發(fā)菌株G5有所改善，粘度都有所提高。其中菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43在25℃發(fā)酵乳粘度較高，分別為2.704、3.271、2.947Pa/s。這是因?yàn)榫戤a(chǎn)生的胞外多糖可起到增稠劑或膠凝劑的作用，從而會(huì)增加發(fā)酵乳的粘度[16]。

表1　乳酸菌菌落特征及粘絲性能Table 1　Colony characteristic and sticky silk performance of Lactic acid bacteria

表2　菌株的發(fā)酵性能Table 2　Performance of strains

2.3胞外多糖產(chǎn)量的測定

將得到的發(fā)酵乳采用熱處理、TCA處理、堿沉淀、乙醇溶解和透析處理去除其中的蛋白質(zhì)和小分子糖成分，再測定其中的胞外多糖含量，各菌株胞外多糖的產(chǎn)量如表3所示。

表3　菌株胞外多糖的產(chǎn)量Table 3　Exopolysaccharides production of strains

從表3中可以看出，突變菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43具有較高的產(chǎn)胞外多糖的能力。菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43的胞外多糖產(chǎn)量分別為180.56、220.42、198.49mg/L。相比而言，出發(fā)菌株G5的胞外多糖產(chǎn)量為116.38mg/L，突變菌株EPS-19、EPS-33和 EPS-43的產(chǎn)胞外多糖能力分別為出發(fā)菌株G5的1.6、1.9和1.7倍。

2.4遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將胞外多糖產(chǎn)量較高的菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43連續(xù)培養(yǎng)15代，測定其第1～15代的胞外多糖產(chǎn)量，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，菌株EPS-33的胞外多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在215.61～224.98mg/L之間，菌株EPS-43的胞外多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在196.43～ 204.72mg/L之間，二者胞外多糖產(chǎn)量基本保持不變。菌株EPS-19的胞外多糖產(chǎn)量隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減少，第15代時(shí)，其胞外多糖產(chǎn)量僅為132.41mg/L，所以突變菌株EPS-19的高產(chǎn)胞外多糖性能不具有遺傳穩(wěn)定性。因此選擇菌株EPS-33和EPS-43作為高產(chǎn)胞外多糖的菌株。

圖1　突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.1　Genetic stability ofmutant strains

2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

將出發(fā)菌株、突變菌株EPS-33和EPS-43以3%（V/V）的接種量，分別接種到脫脂乳發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔1h測定胞外多糖含量，直至發(fā)酵結(jié)束。脫脂乳發(fā)酵期間，EPS-33和EPS-43胞外多糖產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間延長的變化情況如圖2所示。

圖2　胞外多糖產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線Fig.2　The curve of exopolysaccharides production alongwith the fermentation time

從圖2可以看出，三個(gè)菌株產(chǎn)胞外多糖的變化趨勢基本相同，在脫脂乳發(fā)酵前6h，三個(gè)菌株的胞外多糖產(chǎn)量均較低。出發(fā)菌株G5胞外多糖產(chǎn)量在7h時(shí)開始快速增加，14h后增長速度逐漸放緩。菌株EPS-33和EPS-43的胞外多糖產(chǎn)量在6h開始迅速增加，16h后增長速度逐漸放緩。菌株G5胞外多糖產(chǎn)量在發(fā)酵結(jié)束時(shí)最高，達(dá)到116.38mg/L；菌株EPS-33和EPS-43的胞外多糖產(chǎn)量在發(fā)酵結(jié)束時(shí)也達(dá)到最高，分別為220.42、198.49mg/L。

3　結(jié)論

采用太空誘變育種技術(shù)對(duì)一株干酪乳桿菌G5進(jìn)行誘變，通過富集培養(yǎng)、平板篩選、脫脂乳發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，篩選得到多株形態(tài)特征和發(fā)酵性能變化的突變株，其中突變菌株EPS-33和EPS-43在25℃下發(fā)酵脫脂乳，胞外多糖產(chǎn)量分別可以達(dá)到220.42、198.49mg/L，為出發(fā)菌株G5的1.9倍和1.7倍。2個(gè)突變菌株與出發(fā)菌株產(chǎn)胞外多糖的變化趨勢基本相同，但產(chǎn)量大幅增加，說明太空誘變對(duì)干酪乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量的提高效果顯著。本研究可為太空誘變?cè)谌樗峋x育中的應(yīng)用和乳酸菌胞外多糖的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1]旭日花，李平蘭.乳酸菌胞外多糖研究新進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2009，37（12）：41-50.

[2]張麗，張?zhí)m威，韓雪.乳酸菌胞外多糖的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（17）：378-381.

[3]張福利，呂宜娜.產(chǎn)胞外多糖乳酸菌混合培養(yǎng)對(duì)酸奶品質(zhì)的影響[J].輕工科技，2012（5）：30-51.

[4]Ruas-Madiedo P，Hugenholtz J，Zoon P.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].International Dairy Journal，2002，12（2）：163-171.

[5]Seema P，Avishek Majumder，Arun Goy，et al.Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria[J].Indian JMicrobiol，2012，52（1）：3-12.

[6]樊秋玲，劉敏.空間育種研究進(jìn)展[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2002，15（6）：231-235.

[7]侯艷梅，江均平，蔣立文.利用木糖生產(chǎn)L-乳酸高產(chǎn)菌太空誘變育種[J].食品工業(yè)科技，2008，29（2）：74-76.

[8]荊士華，安海英，李春杰，等.生黑醋酸桿菌的太空誘變選育[J].生物技術(shù)，2011，21（1）：76-78.

[9]魏麗勤，方曉梅，李寧梅，等.太空搭載泰樂菌素高產(chǎn)菌株的選育[J].工業(yè)微生物，2007，37（1）：1-7.

[10]李靜.甘南牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中低溫乳酸菌的分離篩選及安全性評(píng)價(jià)[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[11]凌代文，東秀珠.乳酸菌的分類鑒定及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1993.

[12]田豐偉，丁虎生，丁納.產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌的簡便篩選與鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：15-19.

[13]劉先，康小紅，孫軍德.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與初步鑒定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010，（3）：38-40.

[14]范麗平，王亞峰，霍貴成.產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定及發(fā)酵性能研究[J].食品與機(jī)械，2010，26（3）：14-17.

[15]羅玲泉，劉成國，黃永鋒.酸乳EPS的提取研究[J].四川食品與發(fā)酵，2006，42（5）：23-26.

[16]Patel S，A Goyal.Isolation，characterization and mutagenesis of exopolysaccharide synthesizing newstrains of lactic acid bacteria[J].The Internet Journal of Microbiology，2010，8（1）：1-12.

[17]Bouzar F，Cernin J，Desmazeaud M.Exopolysaccharide production and texture promoting abilities of mixed-starter cultures in yoghurts production[J].Journal of Dairy Science，1997，80（10）：2310-2317.

[18]Jung S，Kim WJ，Lee KG，et al.Isolation and identification of lactic acid bacteria from sourdoughwith high exopolysaccharide production ability[J].Food Science and Biotechnology，2009，18（2）：384-389.

[19]劉燕.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[20]Aly S，Cheik A T Ouattara，Paul W Savadogo，et al. Identification ofexopolysaccharides-producing lactic acid bacteria from Burkina Faso fermented milk samples[J].African Journal of Biotechnology，2004，3（3）：189-194.

[21]孫軍德，劉先.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（1）：90-93.

Mutation of Lactobacillus casei with high production of exopolysaccharides by space mutagenesis

LIXiong-chao1，2，ZHANGWei-bing1，2，*，LIANG Qi1，2，LIXue-peng1，2，ZHANG Yan1，2，SONG Xue-mei1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Functional Dairy Engineering Laboratory of Gansu Province，Lanzhou 730070，China）

A starting strain of Lactobacillus casei G5 was mutated by space mutagenesis technology to screen strains w ith high p roduction of exopolysaccharides.Through enrichment culture，p late screening，skim m ilk fermentation and genetic stability experiment，we finally got two stab le mutant strains EPS-33 and EPS-43 w ith high p roduction of exopolysaccharides.while mutant strains EPS-33 and EPS-43 fermented in skim m ilk at 25℃，the yield of exopolysaccharides were 220.42mg/L and 198.49mg/L，which were 1.9 and 1.7 times of starting strain.Exopolysaccharides p roduc tion of the two mutant strains had the same change trend as starting strain，but the twomutant strains had a significant increase in p roduction.

space mutagenesis；Lac tobacillus casei；exopolysaccharides

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.031

2013－12－18*通訊聯(lián)系人

李雄超（1989－），男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物。

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012GB2G100461）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100903）；蘭州市科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃項(xiàng)目（2011-1-144）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（NCET-10-0015）。