一株木質纖維素酶高產菌株的選育及產酶條件研究

陳英連，付 正，張良雨，管 斌，孔 青

（1.中國海洋大學，食品科學與工程學院，山東青島266003）2.山東醫學高等專科學校，山東濟南250002）

一株木質纖維素酶高產菌株的選育及產酶條件研究

陳英連，付 正，張良雨，管 斌*，孔 青

（1.中國海洋大學，食品科學與工程學院，山東青島266003）2.山東醫學高等專科學校，山東濟南250002）

主要通過紫外（UV）和甲基磺酸乙酯（EMS）的交替誘變的方法提高綠色木霉的產酶能力，并成功篩選到了一株產酶活性較高的菌株，其在平板篩選培養基中的透明圈直徑與菌落直徑之比達到2.1，傳代穩定后在產酶培養基中纖維素酶活（CMCase）和濾紙酶活（FDAase）分別達到21.05U/mL和2.4U/mL。之后經培養基的優化進一步提高其酶活，最終誘變菌株在最佳產酶培養基中CMCase達到22.5U/mL，FDAase達到2.52U/mL。

綠色木霉，誘變，纖維素酶，液體發酵

纖維素類物質廣泛存在于自然界中，最為常見的為農作物秸稈。這類物質一般未經處理就被丟棄或者直接將其燃燒，對環境產生了很大污染。而如果通過生物方法將其轉化，得到可以直接被人類或牲畜利用的可再生的生物資源，這不僅可以解決環境污染問題，還能在一定程度上緩解生物資源的短缺[1]。

木質纖維素類物質其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，這三種成分隨植物物種不同含量也有所不同，其中纖維素和半纖維素含量占大部分[1-2]。目前對木質纖維原料的利用主要集中在纖維素和半纖維素的利用，所以原料的預處理即為將木質素分離，得到纖維素半纖維素的混合物，再利用纖維素酶將其分解為還原糖，從而進一步發酵成所需的產物，如酸、酒精、單細胞蛋白等[3]。纖維素酶在生產還原糖這一重要步驟中起到了決定性作用，所以得到高產量的纖維素酶對整個轉化過程起到了關鍵性的作用。纖維素酶來源廣泛，很多植物和微生物都可以生產纖維素酶，而通過微生物發酵產纖維素酶由于其成本低、提取過程簡便、產量高等優點多年來吸引了大批的國內外研究者。

很多微生物能夠產生纖維素酶來分解纖維素成還原糖，研究較多的是絲狀真菌中的木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中木霉屬被廣泛應用，潛力較大的為綠色木霉[4-5]。有研究者利用綠色木霉與其他微生物共同培養，分解大米秸稈為還原糖[3，6]。一般直接從自然界分離的原始菌株其酶產量低，需利用生物學方法提高其酶活，包括理化誘變育種、基因工程育種等。其中誘變育種由于其操作簡單、速度快及收效顯著等特點被廣泛利用[7]。Kridztina kovacsa利用物理化學共同誘變的方法顯著提高了原始菌株的纖維素酶產量，并利用預處理的柳木生產得到了還原糖[8]。本文以綠色木霉為出發菌株，通過物理化學復合誘變得到了一株木質纖維素酶高產菌株，傳代后穩定性良好，進一步通過對其培養基進行了優化，得到產酶最佳培養基。為木質纖維素酶的深入研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色木霉（Trichoderma viride 8140） 由中國海洋大學食品科學與工程學院酶工程研究室保藏，該菌株于PDA斜面培養基[5]上在4℃下保存；平板篩選培養基[9]Mandel’s營養鹽[10]1L，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5g，Triton X-100 1m L，瓊脂15g，pH 5.5；剛果紅溶液 剛果紅染料1g，蒸餾水1L；NaCl溶液1mol/L；液體發酵培養基[7]Mandel’s營養鹽1L，微晶纖維素10g，吐溫-80 2m L，pH 5.5；液體限量培養基：葡萄糖2g，（NH4）SO41g，KH2PO42g，H2O 1000m L，pH 6.0。

SPS202F型電子天平 梅特勒-托利多稱重設備有限公司：ZDX-35B1型高壓消毒鍋 上海申安醫療器械廠；XK 24-1060007型電熱恒溫培養箱、SHZ-C型全溫空氣恒溫振蕩器 上海躍進醫療器械廠；PHS-2F型pH計、722N型可見分光光度計 上海精科電子有限公司；BCM-1000型超凈工作臺 江蘇凈集團安泰公司；電子萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司；LD5-10B型低速離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計 尤尼克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養方法 保藏的綠色木霉菌種接種于PDA斜面進行活化，待形成一層綠色孢子，接種環平板劃線，剛果紅染色，三角瓶搖瓶復篩后得到酶活較高的一株菌作為出發菌株[11]。用無菌水沖洗斜面孢子，按103個/m L接種量接種于液體發酵培養基，裝量為50m L/300m L，于28℃、180r/m in培養8～10d，測定菌體生物量及酶活。

1.2.2 粗酶液提取 取培養6d的發酵液，置于離心管中4000r/min離心10min，取上清液為粗酶液，適當稀釋后測定酶活。

1.2.3 葡萄糖標準曲線制作 取8支25m L比色管，分別加入2m L葡萄糖溶液，使葡萄糖含量分別為0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg，并分別加入2m L DNS，沸水浴5m in，定容至刻度，540nm處測定吸光值，制作吸光值與葡萄糖含量的標準曲線[12]。

1.2.4 菌種誘變[12]

1.2.4.1 采用紫外誘變與硫酸二乙酯物理化學復合誘變 分別進行了兩輪處理，PDA斜面培養7d的菌株，生理鹽水沖洗，脫脂棉過濾，得到孢子懸液，接入液體限量培養基中，28℃搖床培養8～10h，3000r/m in離心10min去除培養液，生理鹽水洗滌2～3次，脫脂棉過濾除去菌絲體，血球板計數法計數[11]，調整孢子濃度為108個/m L。采用物理化學復合誘變，其木質纖維素酶高產菌株的育種方案如圖1所示。

1.2.4.2 菌種初篩 將誘變后的菌液適當稀釋后涂布于平板篩選培養基上，28℃恒溫培養3～4d，剛果紅染色并用NaCl溶液洗滌，對比透明圈的大小。選擇透明圈直徑/菌落直徑（Hc）≥1.5的菌落進行復篩。

圖1 纖維素酶高產菌株的育種過程Fig.1 The developmentof high cellulase producingmutants with UV-lightand EMS treatment

1.2.4.3 菌種復篩[12]初篩后的菌株，接種于液態產酶培養基中，培養7d，取培養液抽濾，得到濾液，5000r/m in，離心10m in，取上清液，適當稀釋測定酶活。

1.2.5 誘變菌株部分培養基的優化[9，14-15]對培養基的最佳碳源及其含量、最佳氮源、pH、金屬離子進行了優化。

1.2.5.1 碳源的優化 培養基其他成分不變，將培養基的碳源分別設定為10g/L的微晶纖維素，10g微晶纖維素＋5g麩皮/L，10g微晶纖維素＋10g麩皮/L，10g微晶纖維素＋20g麩皮/L，5g微晶纖維素＋5g麩皮/L，5g微晶纖維素＋10g麩皮/L，5g微晶纖維素＋20g麩皮/L，20g麩皮/L。培養6d后測定酶活，確定最佳碳源。

1.2.5.2 氮源的優化 碳源確定不變后，培養基其他成分不變，把培養基中的氮源分別用2g的無機氮源磷酸氫二銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鈉代替。培養6d后測定酶活，確定最佳無機氮源。

1.2.5.3 金屬離子的優化 分別研究了鎂離子和鈣離子對菌株產酶的影響，分別在培養基中添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的硫酸鎂，培養7d后測定酶活，確定硫酸鎂的添加量。分別在培養基中添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的無水氯化鈣，培養7d后測定酶活，確定氯化鈣的添加量。

1.2.5.4 pH的優化 從相關文獻分析得知，綠色木霉的產酶最適pH范圍為4～7，所以設定pH梯度為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7。

1.3 測定方法

1.3.1 酶活測定方法

1.3.1.1 β-1.4-葡萄糖內切酶活性（CMCase）的測定[13]向比色管中加入1.5m L的1%的醋酸纖維素鈉底物，50℃保溫，然后加入0.5m L適當稀釋的粗酶液，50℃下準確反應30min，2m LDNS終止反應，沸水浴5min，定容至比色管刻度，混勻，540nm處測定吸光值。

1.3.1.2 濾紙酶活（FDA）的測定[13]向比色管中加入1.5m L pH為4.8的檸檬酸緩沖液和1cm×6cm大的濾紙條，50℃保溫，然后加入0.5m L適當稀釋的粗酶液，50℃下準確反應60m in，2m L DNS終止反應，沸水浴5min，定容至比色管刻度，混勻，540nm處測定吸光值。

式中：n為0.5m L酶液所生成的葡萄糖毫克數；0.5為所加酶液體積；30/60為反應時間；0.18為mg和μmol的換算；所得酶活乘以稀釋倍數即為每毫升培養液的酶活。

1.3.2 菌體生物量的測定 以菌體干重（Dry Cell Weight）指示菌體生物量，取3m L適當稀釋的發酵液，加3m L 1mol/L HClO4，沸水浴中準確反應20m in，取出后冷卻至室溫，冷凍離心機6000r/min離心10min，于紫外分光光度計260nm波長下測OD值，定為A。以離心去除菌體的澄清發酵液經上述實驗作為對照調零，則每升發酵液菌體干重DCW=0.65×A×n[1]

式中，n：為發酵液稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

根據葡萄糖標準曲線制作方法，葡萄糖標準曲線制作以OD值為縱坐標，以葡萄糖含量為橫坐標，如圖2所示。葡萄糖標準曲線方程：y=0.5659x-0.013，R2=0.9981。

圖2 葡萄糖的標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2 平板初篩的結果

出發菌株通過多次復合誘變，每次誘變通過初篩和復篩兩部。初篩根據在篩選平面皿（培養基）上形成的透明圈的大小，復篩根據三角瓶搖瓶（液態）培養的酶活，每次誘變后等酶活穩定再進行下步誘變。最終得到菌株T.viride8140UEUE4-80，如圖3所示。其透明圈直徑/菌落直徑=2.1。

圖3 誘變菌株在剛果紅培養基上透明圈展示Fig.3 Hydrolyzed zone on the selective plate

2.3 搖瓶復篩的結果

將原始菌株與誘變菌株在相同條件下同時液態培養，每天測定CMCase和FDA酶活。其搖瓶復篩結果如圖4～圖6所示。

圖4 原始菌株與誘變菌株CMCase對比Fig.4 Comparison of enzyme production curve betweenmutant strain and original strain

圖5 原始菌株與誘變菌株FDAase對比Fig.5 Comparison of enzyme production curve betweenmutant strain and original strain

圖6 原始菌株與誘變菌株菌體干重（DCW）的對比Fig.6 Comparison of DCW curve betweenmutant strain and original strain

從圖4～圖6可看出，在液態搖瓶培養條件下，原始菌株與菌株T.viride8140UEUE4-80 CMCase和FDAase的酶活力對比，菌株的生長無明顯變化，只是纖維素酶活力得到了較大幅度的提高。這一研究結果說明：誘變并沒有改變其生長量，而是改變了該株微生物分泌酶的產量。可能是誘變處理改變了產酶相關基因，從而改變了其酶產量或者其酶活力。誘變株的CMCase比原始菌株提高了2倍，其FDAase力比原始菌株提高了1.5倍。誘變株的最高CMCase和FDAase酶活出現在液態培養的第7d，分別為22.79IU/m L和2.56IU/m L。廈門大學Xinde Jiang等[16]利用EMS和UV同時對綠色木霉出發菌株進行誘變，得到了一株突變株EU2-77，其CMCase達到了16.46IU/m L，FDAase達到了2.19IU/m L，分別比原始菌株提高了1.16倍和1.49倍。與之比較，本文所用EMS和UV的交替誘變方法較為有效，誘變效果比較明顯。

2.4 誘變菌株穩定性研究

誘變菌株連續在PDA培養基上傳代培養，每傳一代都接種于液態搖瓶產酶培養基中培養7d，測定酶活。其實驗結果如圖7、圖8所示。

圖7 突變菌株傳代中CMCase（IU/mL）Fig.7 Effectof passage numbers on enzyme activity

圖8 突變菌株傳代中FDA（IU/mL）Fig.8 Effectof passage numbers on enzyme activity

由圖7、圖8可看出，誘變菌株傳到第六代時，其菌株酶活力無明顯下降，CMCase僅下降了0.92IU/m L，FDAase僅下降了0.09IU/m L，說明誘變基因穩定性良好，并沒有產生回復突變，傳代中其突變的基因在復制、轉錄和翻譯過程中保持較高的穩定性，突變基因可穩定的傳給每個菌株后代，并作為一種穩定的性狀進行表達。其菌株產酶穩定性良好，可以用來進行后續研究。

2.5 菌株培養基的優化

2.5.1 培養基中碳源的影響 由圖9可看出，當微晶纖維素與麩皮同時加入時，其CMCase和FDA酶活達到最高，為最佳碳源配比。微晶纖維素加入量減少，酶活力下降趨勢明顯，說明微晶纖維素在培養基中主要誘導兩種酶的產生，隨麩皮增加其酶活力只出現了稍微的增加，而只加微晶纖維素時比加入5g麩皮時的酶活要高，說明麩皮對酶的誘導作用小于微晶纖維素，可能是由于麩皮中營養成分比較高，含有部分淀粉及其他糖類、良好的氮源等，纖維類物質較少，而促進產酶的主要是纖維類物質的誘導，所以麩皮對產酶的誘導作用很小。

圖9 碳源配比對產酶的影響Fig.9 The effectof the ratio of Avicel and bran on enzyme production

2.5.2 培養基中無機氮源的確定 由圖10可看出，硫酸銨為其最佳無機氮源，其CMCase和FDAase達到最高，為13.12U/m L和2.09U/m L。在只加無機氮源時其酶活明顯比之前降低，所以說明培養基中有機氮源也有重要作用[1，10]，加有機氮源尿素和蛋白胨，不僅可以提供營養物質，而且它們的添加對培養過程中培養基的pH起到一定的調節作用，相關文獻報道[11]其最佳添加量為尿素0.3g/L、蛋白胨0.75g/L。

圖10 無機氮源對產酶的影響Fig.10 The effectof inorganic nitrogen on enzyme production

2.5.3 金屬離子對產酶的影響 在Mandel’s營養鹽中鎂離子和鈣離子作為主要的金屬離子影響菌株產酶活性[7]，鎂離子和鈣離子主要是通過影響酶的構象從而影響酶活性。由圖11和圖12可看出，當鎂離子和鈣離子添加量為0.3g/L時，其酶活力最高，含量增加或者減少都影響產酶。通過調節培養基最終得到CMCase為22.5U/m L FDAase酶活為2.52U/m L。

2.5.4 培養基的pH對產酶的影響 由圖13可看出，當液態培養培養基的pH為6時，其產酶活力最高，為最適pH。這時CMCase達到了23.16U/m L，濾紙酶活達到2.38U/m L。由上圖可以看出上述兩種酶的最佳產酶pH相同，pH降低或升高都會影響菌株的產酶活力，并且pH升高對產酶的影響明顯比pH下降對產酶的影響大，隨pH升高其兩種酶活都出現了明顯下降，這可能和綠色木霉其最適產酶環境為偏酸性培養介質有關。

圖11 Mg2+對產酶的影響Fig.11 The effectofMg2+on enzyme production

圖12 Ca2+對產酶的影響Fig.12 The effectof Ca2+on enzyme production

圖13 pH對產酶的影響Fig.13 The effectof pH on enzyme production

3 結論

3.1 采用纖維素酶分泌能力較強的野生型菌株、經初步篩選得到生產性菌株（經發酵生產反復訓化的菌株）作為出發菌株。

3.2 菌種誘變選用對木霉誘變效果較好的硫酸二乙酯，紫外線作為誘變劑，以新鮮的孢子菌懸液為誘變介質，采用低劑量、反復多次復合誘變處理方法，獲得了較高的正突變率。

3.3 經反復多次復合誘變處理和高效的初篩和復篩——“富集培養”，篩選得到了高產纖維素酶變異菌株。在此基礎上，又經反復多次純種分離和搖瓶比較，逐步篩選出了一株產酶穩定性較好的菌種。

3.4 通過對該變異菌株的培養基進行優化培養，獲得的最佳培養基配方。利用原始綠色木霉經過誘變，穩定性研究，以及培養基優化，最終得到誘變菌株最佳產酶培養基，其在最佳培養基中CMCase達到22.5U/m L FDAase酶活達到2.52U/m L。

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The development of high cellulase production mutant from Trichoderma Viride and study on the condition of enzyme production

CHEN Ying-lian，FU Zheng，ZHANG Liang-yu，GUAN Bin*，KONG Qing
（1.Food Science And Engineering College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Shandong Medical College，Jinan 250002，China）

The cellulase p roduc tion strain T.viride 8140 was treated with UV and EMS.The mutant strain T.viride8140UEUE4-80 was showed to have a higher cellulase activity than others and the Hc of the mutant reached 2.1.After several passages its CMCase and FDAase were stabilized at 21.05U/m L and 2.4U/m L.The conditions of fermentation were studied and the op timal culture med ium was decided.Under the op timal culture med ium，the CMCase and FPAase of the mutant separately reached 22.5，2.52U/m L.

T.viride；mutagenesis；cellulose；liquid fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.032

2013－12－20 *通訊聯系人

陳英連（1989-），女，碩士研究生，主要從事發酵工程方面的研究。

“十二五”農村領域國家科技計劃（2013BAD10B02-06）；青島市公共領域科技支撐計劃項目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發酵工程國家重點實驗室開放課題（K2012002）。