低嘌呤、高酶活納豆芽孢桿菌液態發酵條件的優化

魯 洋，錢 和，張偉國

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

低嘌呤、高酶活納豆芽孢桿菌液態發酵條件的優化

魯 洋，錢 和*，張偉國

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

采用比濁法連續測定OD660nm值，繪制菌種生長曲線，研究納豆芽孢桿菌種子生長條件，確定最佳接種時間為12h。并用單因素和正交設計實驗的方法對納豆激酶發酵條件進行優化，確定發酵條件的最優組合（g/L）：全豆豆粉20，乳糖20，酵母浸膏10，KH2PO40.1，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 10，CaCl20.3，發酵液初期pH7.0，接種量2%，裝液量30mL/50mL，搖速100r/min，發酵溫度37℃，發酵時間36h。同時，優化后酶活由1005.77IU/mL提升到2835.50IU/mL，嘌呤總量由65.56mg/L降低到29.36mg/L，優化結果較為顯著。

低嘌呤，高酶活，納豆芽孢桿菌，液態發酵，正交設計

納豆激酶（nattokinase簡稱NK）是一種具有纖溶活性的蛋白酶[1]，是在納豆發酵過程中由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisl natto）產生的一種絲氨酸蛋白酶[2]。納豆激酶作為納豆菌發酵的主要產物，具有很好的溶解血栓的功能[3]，自1980年由日本研究學者須見洋行博士發現其有效功能后便開始備受關注。日本的Sum i等[4]于1987年首次從日本傳統食品納豆中提取并命名為納豆激酶。納豆激酶作為新一代治療血栓的有效藥物，具有較廣闊的應用前景。然而有關報道稱，多種關于納豆激酶凍干粉等相關產品均具有較高含量的嘌呤類物質，不利于痛風患者的食用，然而目前為止并沒有相應的文獻支持。痛風（gout）又稱為富貴病[5]，是由于長期嘌呤代謝障礙，血尿酸升高引起組織損傷的一組疾病。嘌呤堿基主要由一個嘧啶環和一個咪唑環結合而成[6]，可分為腺嘌呤堿基、鳥嘌呤堿基、次黃嘌呤堿基和黃嘌呤堿基四種。嘌呤代謝（purinemetabolism）是指嘌呤堿基及嘌呤衍生物的分解。在動物組織或人體中，首先是嘌呤堿基在各種脫氨酶的作用下水解脫去氨基，腺嘌呤和鳥嘌呤水解脫氨分別生成次黃嘌呤和黃嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下進一步氧化生成尿酸[6]。而尿酸在人體內的累積是導致痛風疾病發生的主要原因[7]。因此，為了能夠開發出一種具有高酶活、低嘌呤含量的納豆激酶產品，不僅具有較大的市場前景同時也具有學術研究意義。該產品不僅能夠有效改善血栓患者的血栓疾病，同時也適用于痛風患者食用。基于此，本文研究納豆桿菌發酵液中嘌呤含量以及通過優化來提高納豆激酶酶活以及降低嘌呤具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 從16株市售納豆樣品中，通過比較酶活高低，篩選[8-9]得出，經16s RNA鑒定為納豆芽孢桿菌，命名為Y[8]；種子液培養基（g/L） 大豆蛋白胨10，乳糖20，酵母浸膏10，KH2PO40.1，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 10，CaCl20.3；優化前發酵培養基（g/L） 全豆豆粉20，葡萄糖10，酵母浸膏10，KH2PO40.1，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 10，CaCl20.3。

UV-2100紫外-可見分光光度計 龍尼柯（上海）儀器有限公司；U ltiMate 3000高效液相色譜 美國Dionex公司；CHS-100CL恒溫恒濕培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；GI54DWS自動高壓蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；SKY-100C恒溫培養振蕩器 上海蘇坤實業有限公司；Centrifuge 5417R離心機 德國Eppendorf公司；FE20精密pH計 METTLER TOLEDO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的繪制 以未接種的種子培養基為空白對照，在波長為660nm時測其OD值，繪制曲線。

1.2.2 酶活測定方法 檢測平板的制作[9]：稱取血纖維蛋白原粉，溶于0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，配制成0.5%的纖維蛋白原溶液，再取9m L該溶液與1m L 20U/m L的凝血酶溶液混勻，倒平板置于37℃下孵化，待凝結成塊后，置于冰箱備用。

1.2.3 嘌呤檢測方法 采用反相離子對色譜法[10]對發酵液中的嘌呤進行檢測。

1.2.4 單因素實驗 根據初篩結果以及文獻報道，分別對以下幾個因素進行研究，考察Y菌在不同條件下發酵其酶活以及嘌呤含量的變化。

1.2.4.1 氮源 根據初篩氮源材料以及成本方面的考慮，分別選擇了價格低廉的全豆粉、過濾豆粉、豆粕粉以及烘烤豆粕粉未作為氮源，分別考察其對發酵酶活以及嘌呤含量的影響。

1.2.4.2 碳源 參考相關文獻，分別選擇了常用的幾種碳源作為本次研究對象，分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油。

1.2.4.3 不同N/C 為了合理的搭配碳源、氮源的比例，以期達到碳源源的最佳利用率，分別考察了1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2、6∶2六個不同N/C比下酶活以及嘌呤含量的變化。

1.2.4.4 接種量（%） 由于芽孢桿菌為需氧性微生物，因此接種量對其生長影響較大，從而根據相關文獻報道結果，分別選擇了接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%對其結果的影響。

1.2.4.5 pH 發酵液的不同pH對其發酵結果影響較大，由Wang SL等[1]研究表明，納豆激酶在中性條件下較為穩定，而在pH為5時很快失去活性，因此分別選擇了7.0、7.2、7.4、7.6、7.8這5個條件下對其進行研究。

1.2.4.6 發酵溫度 經文獻報道顯示，納豆芽孢桿菌一般在37℃下發酵結果較為滿意，因此分別選擇了31、33、35、37、39℃這5個條件下進行研究。

1.2.4.7 發酵時間 通常納豆芽孢桿菌的發酵周期較長，因此分別選擇了24、36、48、60、72h五個因素進行研究。

1.2.5 正交實驗設計 根據單因素實驗結果，其中四個因素影響較為顯著，因此選定4因素3水平正交實驗表進行實驗，實驗設計見表1。

表1 正交實驗設計的因素水平表Table 1 Test factors and levels of the orthogonal experimental design

1.2.6 數據分析 采用Excel、分析軟件SPSS 18.0以及Origin等軟件對數據進行分析與處理。

2 結果與討論

2.1 納豆芽孢桿菌生長曲線的繪制

納豆芽孢桿菌Y在種子培養基中的生長情況如圖1所示，培養12h以后，Y生長進入平穩期，因而采用對數生長后期即培養時間12h的種子接入發酵培養基為好。

圖1 Y種子生長過程曲線Fig.1 Growth curve of Y in seed media

2.2 氮源對酶活以及嘌呤含量的影響

以20g/L葡萄糖為碳源，分別以20g/L全豆粉、過濾豆粉、豆粕粉以及烘烤豆粕粉為氮源進行發酵培養24h，其他優化前發酵培養基條件不變，發酵結束后，離心取上清液分別測其中的酶活以及嘌呤含量，結果見圖2。由圖2可知，其中酶活高低依次為：全豆粉＞過濾豆粉＞豆粕粉＞烘烤豆粉，最高為全豆粉達到1686.48IU/m L，而最低為1383.260IU/m L，相差顯著，其主要原因在于前期篩菌時采用的氮源為全豆粉，因此對菌株具有一定的馴化作用，從而以全豆粉為氮源的酶活表現較為顯著。而其嘌呤含量雖然以豆粕粉為氮源其最終發酵液中的嘌呤含量最低，但是其相差均不是很大，在67.43～78.50mg/L之間，同時考慮到兩者的價格差異，因此最終最合適的氮源選擇為全豆粉。

圖2 不同氮源對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.2 Effectof different nitrogenous nutrients on fermentation

2.3 碳源對酶活以及嘌呤含量的影響

以20g/L全豆粉為氮源，分別以20g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油為碳源進行發酵培養。發酵結束后分別測其酶活以及嘌呤含量，結果見圖3，由圖3可知，不同碳源對其酶活以及嘌呤含量的影響均較大。其中碳源為甘油時酶活最高，為1742.24IU/m L，嘌呤含量為44.74mg/L；而碳源為乳糖時嘌呤含量僅為27.25mg/L，酶活為1577.60IU/m L，綜合比較選擇乳糖作為碳源較為合適。

圖3 不同碳源對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.3 The impactof different carbon sources on the enzyme activity and purine content

2.4 N/C比對酶活以及嘌呤含量的影響

以20g/L全豆粉為氮源、20g/L乳糖為碳源，分別以1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2、6∶2的N/C比進行發酵培養。發酵結束后對其發酵液中的酶活以及嘌呤含量進行檢測，結果見圖4。由圖4可知，不同N/C比對酶活以及嘌呤總量的變化影響較大。隨著N/C比的不斷增加，酶活呈現不斷下降趨勢，而嘌呤含量則呈現上升趨勢，因此選擇1∶2為最適N/C比。

圖4 不同N/C比對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.4 The impactof different N/C ratio on enzyme activity and purine content

2.5 不同接種量對酶活以及嘌呤含量的影響

以10g/L全豆粉為氮源，20g/L乳糖為碳源，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量進行接種搖瓶實驗。發酵結束后其酶活以及嘌呤含量檢測結果見圖5。由

圖5 不同接種量對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.5 The impactof different inoculum on enzyme activity and purine content

2.6 不同pH對酶活以及嘌呤含量的影響

以10g/L全豆粉為氮源，20g/L乳糖為碳源，N/C為1∶2，接種量為2%，分別選定發酵液pH為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8為研究因素，發酵結束后對其中酶活以及嘌呤含量進行檢測，結果見圖6，隨著pH的不斷增加，其酶活呈現先上升后下降的趨勢，為1214.07～1686.48IU/m L；而嘌呤總量則是先下降再上升后又下降，其大小在40.37～81.77mg/L之間。不同pH對發酵產物的酶活以及嘌呤總量的影響均較大。而在發酵液pH 7.2時酶活最高，為1686.37IU/m L，嘌呤含量最低為40.37mg/L。因為納豆激酶在中性條件下酶活較為穩定，最適宜芽孢桿菌的生長。因此選擇的pH為7.2。

圖6 不同發酵液pH對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.6 The impactof differentbroth pH on enzyme activity and purine content

2.7 不同溫度對酶活以及嘌呤含量的影響

以10g/L全豆粉為氮源，20g/L乳糖為碳源，N/C為1∶2，2%的接種量，以及pH為7.2的發酵條件下，分別在31、33、35、37、39℃溫度下進行發酵，發酵結束后對其酶活以及嘌呤含量進行檢測，結果見圖7。由圖7可知，隨著發酵溫度的增加，其酶活逐漸上升，在37℃時達到最高，隨后呈現下降趨勢；而嘌呤含量先呈現下降趨勢再逐漸增加，在37℃時含量最低。在37℃時酶活達到最高，為1478.79IU/m L，嘌呤含量最低為43.80mg/L，與文獻報道中納豆芽孢桿菌最適生長溫度相符合。

圖7 不同溫度對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.7 The impactof different temperatures on enzyme activity and purine content

2.8 不同發酵時間對酶活以及嘌呤含量的影響

以10g/L全豆粉為氮源，20g/L乳糖為碳源，N/C為1∶2，2%的接種量，發酵液pH為7.2，發酵溫度為37℃的條件下，進行搖瓶發酵。分別選定24、36、48、60、72h作為不同發酵周期進行研究。發酵結束后分別檢測其酶活以及嘌呤含量，結果見圖8。由圖8可知在24～48h之間，酶活隨著發酵周期的延長而逐漸呈現上升趨勢，而在48h之后酶活出現下降的趨勢，有可能是發酵時間過長，微生物開始停止生長，甚至是自溶，導致酶活降低。而嘌呤含量在48h之前變化不大，含量均較低，在19.23～23.74mg/L之間，而在48h之后，嘌呤含量呈現上升趨勢，最高達到54.56mg/L。且通過圖8可知，不同發酵時間對其嘌呤總量的影響較大，且綜合酶活以及嘌呤含量最終選擇發酵48h為最適周期。

圖8 不同發酵時間對酶活以及嘌呤含量的影響Fig.8 The impactof different fermentation time on enzyme activity and purine content

2.9 正交實驗結果

通過正交實驗，分別對其發酵產物中酶活以及嘌呤含量進行檢測，正交實驗結果見表2。

由極差分析（表2）可知，四個因素中對酶活影響順序分別為：D＞A＞C＞B，其中酶活最高的組合為A2B2C1D1；而對嘌呤含量影響順序為：D＞B＞C＞A，其中嘌呤含量最低的最優組合為A2B3C1D3。為了得到高酶活、低嘌呤的最優條件組合，根據其影響順序可知，D因素對酶活及嘌呤含量的影響最大，而D1與D3相差不大，因此應確定為D1；其次，就A因素而言，對酶活影響較大，而對嘌呤代謝影響較少，但兩者最優結果均為A2，因此，確定為A2；而對于C因素而言，其對酶活與嘌呤代謝的影響均不是很大，且酶活與嘌呤的最佳條件均為C1，因此最終確定為C1；而B因素對酶活的影響最小，但是對嘌呤代謝的影響卻較大，因此雖兩者的最優條件不一致，最終應以對嘌呤代謝影響最大的為宜，故最終確定為B3。所以，最優高酶活、低嘌呤發酵條件組合為A2B3C1D1，即發酵溫度為37℃、碳氮比為2∶2、pH 7.0、發酵周期為36h。

表2 正交實驗及結果Table 2 Orthogonal tests and results

2.10 驗證實驗

基于上述正交實驗結果，得到一組最佳的發酵條件，現對優化前后的工藝條件進行相關指標的比較，以期進一步驗證該優化條件的有效性與適宜性。驗證結果表明，酶活由1005.77IU/m L提高到2835.50IU/m L；嘌呤含量由65.56mg/L降低到29.36mg/L，從而說明此次優化條件的有效性。

3 結論

經正交實驗優化實驗確定了最優納豆芽孢桿菌液態發酵條件最優組合（g/L）：全豆豆粉20，乳糖20，酵母浸膏10，KH2PO40.1，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 10，CaCl20.3，發酵液初期pH 7.0，接種量2%，裝液量30m L/50m L，搖速100r/m in，發酵溫度37℃，發酵時間36h。同時，優化后酶活由1005.77IU/m L提升到2835.50IU/m L，嘌呤總量由65.56mg/L降低到29.36mg/L，優化結果較為顯著。

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Optim ization of bacillus natto liquid fermentation for low purine and high enzyme activity

LU Yang，QIAN He*，ZHANG W ei-guo
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The bacteria g row th curve was d rew by detecting OD660nm.The op timal g row th time was defined as 12h after researching.The fermentation factors were op tim ized by sing le factor and orthogonalexperiment.The final op tim ization fermentation factors were as follows（g/L）：full peas powder 20，lactose 20，yeast extrac t 10，KH2PO40.1，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 10，CaCl20.3.And the initial fermentation pH was 7.0，inoculum was 2%，liquid volume was 30m L/50m L，shaking speed was 100r/m in，fermentation temperature was 37℃and fermentation time was 36h.Through the verification experiments，results ind icated that enzyme activity increased from 1005.77IU/m L to 2835.50IU/m Lwhile purine content decreased from 65.56mg/L to 29.36mg/L.

low purine content；high enzyme activity；bacillus natto；liquid fermentation；orthogonaldesign

TS205.5

A

1002-0306（2014）18-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.039

2013－12－09 *通訊聯系人

魯洋（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制。

“十二五”國家科技支撐計劃（2014BAD04B03）。