漢中油菜花黃色素微波輔助提取及抗氧化活性研究

史 娟，李紅英

（1.陜西理工學院化學與環境科學學院，陜西漢中723000；2.陜西省延安市子長縣寺灣鄉中心衛生院，陜西延安717307）

漢中油菜花黃色素微波輔助提取及抗氧化活性研究

史 娟1，李紅英2

（1.陜西理工學院化學與環境科學學院，陜西漢中723000；2.陜西省延安市子長縣寺灣鄉中心衛生院，陜西延安717307）

以漢中油菜花為原料，采用微波助提對所含黃色素進行提取，利用正交設計實驗優化提取工藝，考察色素對食用油的抗氧化活性、對羥自由基及過氧化氫的清除能力。結果表明，油菜花黃色素的最佳提取工藝條件是：95%乙醇為提取溶劑，微波時間為30s，水浴溫度為80℃，料液比為1∶40（g/mL），回流時間為15min。抗氧化實驗表明，油菜花中所含黃色素具有較強的抗氧化能力，可抑制植物油氧化。在一定的濃度范圍內，色素對羥自由基及過氧化氫的抗氧化活性隨濃度升高而增強。

油菜花，黃色素，微波助提，工藝條件，抗氧化活性

油菜為一年生或越年生草本植物，在我國農村大面積種植，每年3～4月開花，花期長，花量大，所含黃色素顏色鮮艷，是一種理想的食用天然色素資源。近年來研究表明，油菜花所含黃色素是大自然中稀少的二酮類有色物質[1]。杜敏華等發現，油菜花黃色素溶液濃度在0.05%以上時對蘋果原汁具有顯著的防腐性[2-3]。魏亞冉等發現[4]，油菜花黃色素還對金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌有一定的抑制作用。漢中地處北暖溫帶和亞熱帶氣候的過渡帶，是傳統的油菜種植生產基地，大約有112萬m2油菜花，蘊藏著巨大的資源優勢。目前，國內對油菜花黃色素的研究較少，僅涉及到色素溶劑提取、防腐、抑菌及穩定性研究[2-4]。采用微波助提油菜花黃色素，并對其抗氧化能力的研究尚未見報道。微波輔助提取技術具有加熱速度快、高效省時、回收率高、產品質量高、原料利用率高、節能無污染、設備簡單等優點[5]。采用微波輔助提取植物色素，具有色素溶出率高，節約溶劑，生產周期較短等優點，并可避免長時間高溫引起的熱不穩定物質的分解破壞，故具有較好的應用前景[6-9]。本實驗采用微波輔助提取油菜花中黃色素，探索最佳提取工藝及其抗氧化性，旨在為油菜花黃色素的進一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜花花瓣 采自陜西漢中市芥菜型油菜四月份的鮮花；食用油 金龍魚第二代食用調和油；30% H2O2、95%乙醇、無水乙醇、石油醚、氯仿、KI、Na2S2O3、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、FeSO4、丙酮、VC、濃硫酸、可溶性淀粉 均為國產分析純。

AL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cary50型紫外可見分光光度計 美國瓦里安中國有限公司；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；HH系列恒溫水浴鍋 黃驊市渤海電器廠；WP700型微波爐 佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；722G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；JYL-350A九陽料理機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 新鮮油菜花瓣→清洗去雜→低溫烘干粉碎→微波助提→水浴回流→真空濃縮→產品。

1.2.2 提取劑的選擇及最大吸收波長的確定 稱取0.5g預處理后的油菜花粉末6份，分別加入水、70%乙醇、95%乙醇、丙酮、氯仿和石油醚各20m L，放入700W微波爐內預處理20s，60℃恒溫水浴回流15min，抽濾，吸取濾液1m L定容至10m L。以各溶劑為空白對照，用紫外分光儀在400～500nm掃描其最大吸收波長（λmax）及吸光度（A）。比較吸光度大小，同時目視提取液顏色及清亮程度，選擇最佳提取劑。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對色素提取結果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶6，微波預處理20s后，分別在50、60、70、80、90℃下回流60min，測吸光度值A，選擇最佳提取溫度。

1.2.3.2 回流時間對色素提取結果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶6，微波預處理20s后，在70℃下分別回流0、5、15、30、45min，測吸光度值A，選擇最佳回流時間。

1.2.3.3 料液比對色素提取結果的影響 稱取等量油菜花粉末，改變料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，微波爐內預處理20s，70℃下回流15min，測吸光度值A，選擇最佳料液比。

1.2.3.4 微波預處理時間對色素提取結果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶50，微波爐內預處理10、20、30、40、50、60s，70℃下回流15min，測吸光度值A，選擇最佳微波處理時間。

1.2.4 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上，選用95%乙醇作為提取劑，以提取溫度、回流時間、料液比和微波時間四個因素，以油菜花黃色素吸光度為考察指標，選擇L9（34）正交表進行正交實驗，正交實驗設計見表1。

1.3 油菜花黃色素的抗氧化活性實驗

1.3.1 油菜花黃色素對食用油抗氧化活性的測定 采用過氧化值（POV）評定油菜花黃色素對食用油抗氧化活性的影響。根據文獻[10]方法，稱取0.081g油菜花黃色素加入到50.415g食用油中混勻，避光保存24h。稱取3g試樣，放入250m L碘量瓶中，加入30m L氯仿-冰醋酸（1∶1）混合液使試樣完全溶解。然后加入飽和碘化鉀溶液1m L，塞好瓶蓋并輕搖半m in，置于暗處3m in。取出后加30m L水并搖勻，立即用硫代硫酸鈉標準溶液（0.0020mol/L）滴定，出現淡黃色時，加淀粉指示液1m L，繼續滴至藍色消失為終點，取相同量的氯仿-冰醋酸溶液、碘化鉀溶液和水，按相同方法，做試劑空白實驗。

1.3.2 油菜花黃色素對羥基自由基清除作用的測定 采用水楊酸法研究油菜花黃色素清除·OH作用[11-12]。向25m L容量瓶中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液、6mmol/L的水楊酸各3m L及6.2×10-3g/m L一定體積的色素溶液，最后加入3m L 6mmol/L的H2O2溶液啟動反應，用95%的乙醇定容至25m L，搖勻，靜置。

1.3.2.1 油菜花黃色素清除·OH的最佳反應時間的確定 吸取6份上述色素溶液，分別在20、40、60、80、100、120min下測定溶液吸光度，研究一定色素濃度下，反應時間對·OH清除率的影響。

1.3.2.2 油菜花黃色素濃度對清除·OH的能力的影響 測定濃度為1.2×10-3、1.8×10-3、2.4×10-3、3.0×10-3、3.6×10-3、4.2×10-3、4.8×10-3g/m L的色素溶液的吸光度，研究色素濃度對·OH清除率的影響。

1.3.3 油菜花黃色素對H2O2的清除能力的測定 實驗原理基于過氧化氫在230nm處有吸收峰，加入抗氧化劑后因過氧化氫氧化抗氧化劑，使其濃度下降，導致在230nm處吸光度減少[13]。稱取新鮮油菜花黃色素0.119g，用95%的乙醇配制成1.19×10-3g/m L的溶液，分別移取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L的色素溶液于25m L容量瓶中，各加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液1m L和43mmol/L H2O2溶液1.50m L，定容至25m L，反應10min后，在230nm處測吸光度Aj（參比溶液為：色素+緩沖溶液）。取pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液1m L和43mmol/L的H2O2溶液1.5m L，定容至25m L，反應10m in后，測吸光度A0（參比溶液為：蒸餾水），計算清除率，并以相同濃度的VC作對比實驗。清除率計算公式：P（%）=（A0-Aj）/A0×100，其中A0為空白吸光度，Aj為樣品吸光度。

1.4 數據處理

實驗數據均為3次重復，取平均值，數據分析采用Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 提取劑及最大波長的確定

2.1.1 提取劑的選擇 6種溶劑對色素的提取效果見表2。表2中，水的提取效果最差，色素提取液接近無色；在95%乙醇、丙酮、石油醚中的提取效果較好，氯仿提取液出現渾濁。說明油菜花黃色素為脂溶性色素。95%乙醇和丙酮提取效果最佳，吸光度值分別為1.954、2.039，提取顏色為金黃色。鑒于95%乙醇價格低廉、安全性好，易于回收再利用。本實驗選取95%乙醇為最佳提取溶劑。

表2 不同提取劑的提取效果Table 2 Results of different solvents

2.1.2 最大波長的確定 將油菜花黃色素的95%乙醇提取液在400～500nm波長范圍內掃描，以溶劑為空白對照，掃描結果見圖1。由圖1可知，油菜花色素液，在400～500nm可見光區間的440、470nm處都有吸收峰，與文獻一致[14-15]。因440nm處吸收峰最大，故確定λmax為440nm。

圖1 色素在95%乙醇溶液中的紫外-可見光光圖譜Fig.1 UV spectra of pigment in 95%ethanol

2.2 單因素實驗

2.2.1 最佳提取溫度的確定 由圖2可知，在50～70℃提取溫度范圍內，吸光度值A隨溫度的升高而加大，至80℃反而下降。這是由于溫度過高，易引起溶劑揮發損失，導致色素提取不完全。此外，溫度過高，還可引起色素被氧化變質或者分解，導致在440nm吸光度減小。綜合各因素考慮，確定70℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對色素吸光度的影響Fig.2 Effectof extraction temperature on pigment yield

2.2.2 最佳回流時間的確定 從圖3可以看出，在0～15m in內，提取率隨著時間的延長而增加，說明延長回流時間可以提高色素的提取率；但從不同時間間隔中吸光度的變化量來看，15min后，隨著時間的延長，提取率下變化不明顯。綜合提取率、耗能及成本等各項因素，確定回流時間以15m in為宜。

圖3 提取時間對色素吸光度的影響Fig.3 Effectof extraction time on absorbance of pigment

2.2.3 最佳料液比的確定 由圖4可知，料液比對色素提取效果影響比較大，提取率隨料液比增大兒升高。但當料液比高于1∶50時，繼續增大料液比，吸光度反而降低。這可能是由于在料液比1∶50時，溶劑對于色素的溶解趨于飽和。過多溶劑的加入除造成資源浪費，還可能導致其他脂溶性雜質被溶入，干擾測定結果。故選擇最佳料液比為1∶50。

圖4 料液比對色素吸光度的影響Fig.4 Effectofmaterial/liquid ratio on absorbance of pigment

2.2.4 最佳微波時間的確定 在圖5中，隨著微波時間的延長，提取率逐漸上升。但在20s后，提取率開始減小，可能因為是在微波輻射過程中，電磁波把能量直接傳播到原料內部，使之瞬時加熱，因色素對熱的穩定性不好，而快速地加熱使其被破壞，導致提取率下降。綜合各方面因素考慮，確定微波時間20s為宜。

圖5 微波時間對色素吸光度的影響Fig.5 Effectofmicrowave time on absorbance of pigment

2.3 正交實驗結果及分析

由表3可知，最佳的提取條件是A3B2C1D3，即提取溫度為80℃，回流時間為15m in，液料比為1∶40，微波時間為30s。同時，由極差分析可知，在實驗所選水平內四個因素對油菜花黃色素提取率影響程度大小順序為：液料比＞微波時間＞回流時間＞提取溫度。

表3 正交實驗及極差分析Table 3 Orthogonal test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4方差分析可知，在油菜花黃色素提取工藝正交實驗所選擇的因素和水平范圍內，A、B、C、D因素的影響均未達到顯著性水平，即提取溫度、時間、料液及微波預處理時間比對色素的產率的影響均不顯著。究其原因可能是受到色素穩定性的影響，使得本例實驗誤差較大，使檢驗的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。而F值結果表明方差分析結果與直觀分析結果一致。

2.4 抗氧化性實驗

2.4.1 油菜花黃色素對食用油抗氧化活性的研究結果 由表5可知，未加色素的食用油POV值為2.0995，加色素后的食用油POV值為1.2756。由此說明，油菜花黃色素具有一定的抗氧化性。

表5 過氧化值（POV）的測定結果Table 5 Resultof POV

2.4.2 油菜花黃色素對羥基自由基清除作用的研究結果

2.4.2.1 油菜花黃色素清除·OH的最佳反應時間的確定 分別移取濃度為6.2×10-3g/m L的油菜花黃色素溶液300μL，測定反應不同時間時黃色素的清除率。由圖6可以看出，油菜花黃色素的清除·OH的能力在15～60m in逐漸增大，在60m in達到最大。故選擇60m in為最佳反應時間，進行后續實驗。

圖6 時間對黃色素清除·OH的能力的影響Fig.6 Effectof time on hydroxyl radical（·OH）scavenging capacity of pigment

2.4.2.2 油菜花黃色素濃度對清除·OH的能力的影響 圖7可以看出，油菜花黃色素對羥基自由基有較強的清除能力，且對自由基的清除率隨著色素濃度的增大而增大。即色素濃度越大，清除羥基自由基能力越強。清除能力與色素濃度有一定的量效關系，但當增加到一定濃度（3.0×10-3g/m L）時，清除率基本不變。

圖7 濃度對黃色素清除·OH的能力的影響Fig.7 Effectof pigmentconcentration on hydroxyl radical（·OH）scavenging capacity of pigment

2.4.3 過氧化氫清除率 如圖8所示。隨著油菜花黃色素濃度的增加，過氧化氫清除率增大，且呈現一定的量效關系；當黃色素濃度增加5.95×10-3g/m L以上，清除率在50%以上，表明黃色素對過氧化氫有較強的清除能力；油菜花黃色素的清除率曲線位于VC之下，可以看出油菜花黃色素抗氧化能力略低于同濃度的VC。

3 結論

3.1 油菜花難溶于水，易溶于95%乙醇和丙酮等有機溶劑。95%乙醇提取油菜花色素的最大吸收波長為440nm。在單因素的基礎上，通過正交實驗選擇出油菜花黃色素微波輔助提取最佳的提取工藝條件是：提取溫度80℃，回流時間為15m in，液料比為1∶40（g/m L），微波時間為30s。各因素對黃色素提取率影響程度大小順序為：液料比＞微波時間＞回流時間＞提取溫度。

圖8 黃色素清除過氧化氫能力測定結果Fig.8 H2O2scavenging capacity of the pigment

3.2 通過POV值（過氧化值）、·OH清除率及過氧化氫清除率的測定，表明油菜花黃色素具有較強的抗氧化能力。

3.3 本文采用微波助提法提取油菜花黃色素，相對于浸提法有較高的提取率，且高效節能省時。油菜花資源豐富，色素含量高，顏色鮮艷，易于提取，具有一定的抗氧化能力。除可作為著色劑使用，還可用作功能性添加劑添加到保健食品中，是一種很有前途的功能性添加劑。

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Study on the extraction and anti-oxidative activities of yellow pigment w ith m icrowave-assisted extraction from Hanzhong rapeseed flowers

SHIJuan1，LIHong-ying2
（1.School of Chemistry and Environment Science，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Zichang Siwan Central Hospital，Yan’an 717307，China）

The p igmentwas extrac ted from rapeseed flowers by m icrowave-assisted extraction technology.On the basis of sing le-factor experiments，the op timal operating conditions were ob tained w ith orthogonal design. The op timum extrac tion cond itions was estab lished as follows：the concentration of ethanol 95%，extracted 30s w ith m icrowave rad iation，the reflux time was 15m in，the reaction tem perature was 80℃and the ratio ofmaterial to liquid 1∶40.The yellow pigment could inhibit the oxidant deg ree of the edib le oil.The capacity to scavenge hyd roxyl free rad icaland H2O2increased as wellas the concentration w ithin a certain degree.

rapeseed flowers；yellow pigment；m icrowave-assisted；technologicalcond ition；anti-oxidative ac tivities

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0236-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.043

2013－12－31

史娟（1978-），女，副教授，研究方向：天然產物化學和有機合成。

國家自然科學基金（21373132）；教育廳2012年科學研究項目（12JK0633）。