大孔吸附樹脂脫除枸杞多糖色素技術研究

魯曉麗，劉繼婷，張自萍

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）

大孔吸附樹脂脫除枸杞多糖色素技術研究

魯曉麗，劉繼婷，張自萍*

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）

以寧夏枸杞為原料提取枸杞多糖，采用9種大孔吸附樹脂對多糖提取液中色素脫除技術進行研究。在靜態實驗的基礎上，采用正交實驗篩選出色素脫除效果最佳的樹脂。以脫色率、多糖保留率和蛋白清除率為指標，衡量樹脂脫色效果。結果表明：D318樹脂脫除色素的效果最佳，樣液質量濃度3mg/mL、樹脂用量3g/25mL、pH7、處理3h時D318樹脂的脫色率、多糖保留率和蛋白清除率分別為67.32%、85.49%和58.76%。

枸杞多糖，大孔樹脂，脫色

在天然產物研究領域中，枸杞子的功效甚多，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降脂降糖等諸多功能[1]。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides）作為枸杞子的重要活性成分，成為近年研究熱點。目前，國內外對枸杞多糖的研究主要集中于活性研究，對枸杞多糖脫除色素的研究尚不多見。通常采用水提醇沉的方法[2]提取分離枸杞多糖，得到的多糖產品具有顏色深、粘度大、純度低等特性，給活性研究帶來了巨大的挑戰。也有研究者采用活性炭吸附法[3]，雙氧水氧化法[4]等對多糖提取液脫色。雖然這些方法可以脫除部分色素，但是這些方法存在多糖損失率大、生物活性被破壞、還原糖分解、脫色劑殘留等缺陷。大孔樹脂作為一類新型高分子分離材料，具有吸附量大、易洗脫、選擇性好、脫色范圍廣、重復利用等特點。在醫藥研究領域的應用越來越多，尤其在天然產物的提取、分離純化方面的應用尤為突出，并逐漸顯現出其優越性[5]。陳振興等[6]利用D-900樹脂對巴戟天多糖進行了脫色工藝優化，獲得了較好的脫色率以及較高的多糖保留率。鄒義芳等[7]證實了大孔樹脂HPD-100對紅花多糖可以獲得較高的脫色率和保留率，為大孔樹脂的應用提供了理論依據。為了提高枸杞多糖的純度，改善產品色澤，本實驗探討大孔吸附樹脂對枸杞多糖提取液中色素的脫除效果，并對脫色條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞 寧夏銀川園林場枸杞研究所；重蒸苯酚、濃硫酸、無水乙醇、抗壞血酸、丙酮、無水乙醚、葡萄糖 均為分析純。

AL204電子天平、精密pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；微型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DHZ-2001A大容量全溫度振蕩培養箱 江蘇省太倉市華美生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；U-5100比例光束分光光度計 Hitachi日立高新技術公司；真空冷凍干燥機 德國Christ；玻璃層析柱（Ф30mm× 400mm）；樹脂型號及生產廠家見表1。

表1 大孔樹脂型號及生產廠家Table 1 The type ofmacroporous resin and manufacturers

1.2 樹脂預處理

將樹脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹后用蒸餾水洗至無醇味，然后用5%HCl溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性；最后用5%NaOH溶液浸泡12h，再用蒸餾水洗至中性，60℃烘干備用[8]。

1.3 枸杞多糖的提取

[9]報道，采用微型粉碎機將枸杞粉碎，稱取枸杞粉末50g，置普通回流裝置中，加入石油醚500m L，60℃回流脫脂3次，每次1h。濾出溶劑，殘渣風干后加入80%乙醇500m L，60℃回流3次，每次1h，回收乙醇。70℃水提3次，共6h，料液比為1∶10，合并濾液濃縮，得到深紅色多糖液，真空冷凍干燥機干燥后為紅褐色粉末，易溶于水。至于4℃冰箱保存備用。

1.4 測定方法

1.4.1 多糖測定 采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖為對照品。

式中，M1、M2分別為脫色前、后的多糖總量。

1.4.2 脫色率測定 將枸杞多糖提取液在波長240～ 760nm進行掃描，得到420nm處有最大吸收，即為色素的特征吸收波長[10]。

式中，A前、A后分別為脫色前、后溶液在波長420nm處的吸光度。

1.4.3 蛋白清除率測定 采用考馬斯亮藍顯色法。

式中，M3、M4分別為脫色前、后的蛋白總量。

1.4.4 綜合指標（OverallDesirability，OD） OD是正交設計綜合評分法的衡量指標[11]。將脫色率、多糖保留率和蛋白清除率三個指標統一綜合考察，以綜合指標OD進行直觀分析和方差分析。在計算綜合指標之前，需先將各指標進行規格化。

式中，Ymax和Ymin分別為各指標可接受的最大值和最小值，最大值的選擇依據是：當指標值超過最大值時，產品的質量并不能得到顯著的改善，本實驗中Ymax=100和Ymin=0。因此，當某各實驗的指標值等于或超過Ymax時，將di=1；相反，實測指標等于或低于Ymin時，di=0。

綜合指標OD=（d1d2d3…dk）1/k，k為指標數

1.5 樹脂的初篩選

取9種型號的大孔吸附樹脂各10g加入三角瓶中，分別加入50m L質量濃度2mg/m L枸杞多糖溶液，恒溫振蕩3h，通過分光光度計測定其吸光度，計算出多糖保留率、蛋白清除率、脫色率。

1.6 靜態吸附實驗

1.6.1 靜態動力學曲線繪制 稱取經預處理干燥后的D318和OU-1樹脂于三角瓶中，加入一定量的枸杞多糖提取液，恒溫振蕩一定時間，計算枸杞多糖提取液的多糖保留率和脫色率，繪制靜態吸附動力學曲線。以多糖保留率、脫色率和蛋白清除率為指標進行后續實驗。1.6.2 樹脂及其用量的確定 分別量取D318和OU-1樹脂1.5、3、6、12g置于干凈的三角瓶中，加入25m L枸杞多糖提取液，pH 7，37℃振搖2h，采用1.4方法測定其脫色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.3 樣液質量濃度的確定 稱取3g D318樹脂于干凈的三角瓶中，加入25m L質量濃度分別為1、2、3、4、5mg/m L的多糖溶液，pH 7，37℃振搖2h，采用1.4方法測定其脫色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.4 pH的確定 稱取3g D318樹脂于干凈的三角瓶中，加入25m L質量濃度為3mg/m L的多糖溶液，分別調節pH為4、5、6、7、8、9，37℃振搖2h，采用1.4方法測定其脫色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.5 時間的確定 稱取3g D318樹脂于干凈的三角瓶中，加入25m L質量濃度為3mg/m L的多糖溶液，pH=7，37℃振搖1、2、3、4、5、6h，采用1.4方法測定其脫色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.6 正交實驗設計 根據不同樹脂對多糖溶液的脫色率、多糖保留率和蛋白清除率，選取D318樹脂進行正交實驗。以脫色率、多糖保留率和蛋白清除率為指標，選擇樹脂用量、樣液質量濃度和時間3個因素，各取3個水平，進行3因素3水平L9（33）正交實驗設計，正交實驗因素水平見表2。

表2 D318樹脂正交實驗設計Table 2 The orthogonal experimental design ofD318macroporous resin

1.7 驗證實驗

以選定D318樹脂條件進行3次重復實驗，測定多糖得率、脫色率和蛋白清除率。

2 結果與分析

2.1 多糖測定、蛋白質測定的標準曲線方程

多糖測定的線性回歸方程為：Y＝10.57X+0.0003，相關系數r＝0.9995。其中，Y為吸光度，X為葡萄糖質量濃度（mg/m L）。

蛋白質測定的線性回歸方程為：A=7.171C+ 0.0145。其中，A為吸光度，C為蛋白質濃度（mg/m L）。

2.2 樹脂篩選

影響大孔樹脂吸附性能的因素很多，包括樹脂的結構、極性、比表面積、粒徑、孔徑及被吸附分子的極性、分子大小等。一般來說，樹脂的極性與被吸附分子的極性相同或相近時吸附效果更好；樹脂有較大比表面積時吸附量更大；樹脂孔徑是被吸附分子大小的5～6倍時吸附性能最好[12]。9種樹脂篩選結果如表3所示。

由表3可以看出，9種樹脂對色素的脫除能力也各不相同，其中脫色率最高的為D318樹脂，脫色率為65.92%，其次為OU-1，61.86%；多糖的吸附量都不大，多糖保留率均在50%以上（聚酰胺除外），其中D318樹脂多糖保留率高達84.80%，位居第一，其次是MG-2，78.21%；對蛋白質的去除能力比較低，蛋白清除率最高的為聚酰胺，達到69.55%，位居第二的是D318樹脂，達到58.71%。綜合3個指標考慮，D318和OU-1樹脂綜合能力較佳；其中D318和OU-1兩種樹脂的脫色率高于其他幾種；并且D318和OU-1樹脂對多糖的吸附不大，避免了多糖大量損失；另外，D318和OU-1樹脂對蛋白的去除能力達到要求，在9種樹脂中位居二、三位。在所選的9種大孔吸附樹脂中，D318屬于弱堿性陰離子交換樹脂。弱堿性陰離子交換樹脂含有-NH2、-NHR或-NR2等弱堿性基團[13]。OU-1屬于強極性大孔吸附樹脂。從兩者的脫色率均較高可以推斷，枸杞多糖提取液中的色素可能是弱堿性陰離子和強極性分子。

綜合考慮多糖保留率、蛋白清除率、脫色率三個指標得出，D318和OU-1大孔吸附樹脂的處理效果較好。因此，選擇這兩種樹脂進行進一步的吸附實驗。

2.3 靜態吸附實驗

2.3.1 靜態動力學曲線 D318和OU-1兩種樹脂吸附達到飽和吸附狀態，其靜態吸附動力學過程曲線如圖1所示。圖1中的色素吸附率可以反映兩種大孔吸附樹脂對枸杞多糖提取液的脫色情況。由圖1可知，在吸附的開始階段，色素吸附率隨著吸附時間的延長而迅速增大，之后增加緩慢。在吸附時間達到60m in后，兩種樹脂的吸附率均增加緩慢，不再有明顯的提高，吸附時間達到270min后，吸附率基本不再增加，可以認為，此時樹脂對色素的吸附已經達到了一個動態平衡。色素在D318和OU-1這種樹脂上的動力學過程基本相似，但在吸附量上存在差別，D318樹脂的色素吸附量略高于OU-1。

圖1 靜態吸附動力學曲線Fig.1 Static adsorption kinetics curve of D318 and OU-1 towards Lyciumbar barum polysaccharide

2.3.2 樹脂及其用量的確定 由圖2（a）可知，對于25m L枸杞多糖提取液來說，當樹脂用量超過3g后，脫色率明顯降低。由圖2（b）可知，多糖保留率隨著樹脂用量的增加先增加后減小，D318樹脂的多糖保留率高于OU-1樹脂。圖2（c）可知，蛋白清除率隨著樹脂量的增加而持續增加，OU-1樹脂的蛋白清除率略高于D318樹脂。在日常研究中，以脫色率和多糖保留率為主要指標，在盡可能降低多糖的損耗的基礎上，選擇脫色率和蛋白清除率相對較高的樹脂。當樹脂用量為3g/25m L多糖提取液時，D318樹脂的脫色率為66.85%，多糖保留率為77.70%，蛋白清除率為54.89%；相同條件下，OU-1樹脂的脫色率為59.51%，多糖保留率為66.32%，蛋白清除率為57.33%。綜合考慮多糖溶液的脫色率、多糖保留率和蛋白清除率，選擇D318樹脂為最佳的樹脂脫色劑，樹脂用量為3g/25m L多糖提取液。

2.3.3 樣液質量濃度對D318樹脂吸附效果的影響 由圖3可知，隨著多糖溶液濃度的升高，多糖保留率變化不明顯；大孔吸附樹脂D318對枸杞多糖提取液的脫色率和蛋白清除率先增加后降低，當溶液質量濃度大于3mg/m L時，脫色率和蛋白清除率迅速下降。且在質量濃度3mg/m L時多糖保留率也相對較高，因此，選擇質量濃度3mg/m L的多糖溶液進行后續實驗。

2.3.4 pH對D318樹脂吸附效果的影響 由圖4可知，隨著多糖提取液pH的增大，大孔吸附樹脂D318對枸杞多糖提取液的脫色率在pH7以后急劇下降，在pH 6～7范圍內脫色率達到最高。因為D318樹脂是大孔弱酸性丙烯酸系陰離子交換樹脂，能在近中性條件下吸附分子尺寸較大的雜質。枸杞多糖提取液中的色素在pH6～7時，更容易被吸附。偏酸性和堿性條件下脫色率較低，可能是由于在堿性條件下部分還原糖發生了美拉德反應[14]，故顏色較深，影響了脫色效果。隨著多糖溶液pH的增大，枸杞多糖提取液的多糖保留率先增大后減小，pH 7時的多糖保留率最高。因此綜合考慮枸杞多糖提取液的脫色率、蛋白清除率和多糖保留率，pH 7最合適。

表3 9種樹脂對枸杞多糖提取液的脫色實驗結果Table 3 Effect of nine types of resins on the decolorization of Lycium barbarum polysaccharide

圖2 樹脂用量與脫色效果的關系曲線Fig.2 Effectof resin amounton decolorization

圖3 多糖質量濃度對D318樹脂吸附效果的影響Fig.3 Effectof polysaccharide concentration on the adsorption efficiency of resin D318

圖4 pH對D318樹脂吸附效果的影響Fig.4 Effectof pH on the adsorption efficiency of resin D318

圖5 時間對D318樹脂吸附效果的影響Fig.5 Effectof time on the adsorption efficiency of resin D318

2.3.5 時間對D318樹脂吸附效果的影響 由圖5可知，隨著脫色時間延長，大孔吸附樹脂D318對枸杞多糖提取液的脫色率先緩慢升高后下降，在3h時脫色率達到最高。因為D318樹脂是大孔弱酸性丙烯酸系陰離子交換樹脂，存在吸附飽和度，一定時間內已經達到了D318樹脂的最高吸附容量。隨著脫色時間的延長，枸杞多糖提取液的多糖保留率和蛋白清除率也是先增大后減小，3h時的多糖保留率最高。因此綜合考慮枸杞多糖提取液的脫色率、蛋白清除率和多糖保留率，3h為宜。

2.3.6 正交實驗結果 根據單因素實驗結果，以樹脂用量、樣液質量濃度和時間為考察因素，以脫色率、多糖保留率和蛋白清除率為考察指標，選取L9（33）正交表進行大孔樹脂影響因素正交實驗，并進行極差分析和方差分析，以確定最佳提取條件。實驗結果見表4。

由表4中的實驗結果可以得出，各因素對大孔樹脂脫色效果的影響程度依次為A＞C＞B，即樹脂的用量對枸杞多糖脫色效果影響最大，其次時間，樣液質量濃度影響最小。綜合各因素比較，其最佳提取條件為：A2B2C2，樹脂用量3g/25m L、樣液質量濃度3mg/m L、時間3h。

2.4 驗證實驗

在正交實驗確定的最佳提取條件下，平均多糖保留率為85.49%，平均脫色率為67.32%，平均蛋白清除率為58.76%，有較佳的脫色純化效果，由此證明該工藝在生產上具有可行性。

3 結論

通過比較X-5、AB-8、OU-1、D318、D315、MG-2、D301G、D-900、聚酰胺九種大孔吸附樹脂對枸杞多糖提取液的脫色率、多糖保留率和蛋白清除率，得出D318和OU-1樹脂為較好的脫色劑，D318和OU-1樹脂脫色率分別為65.92%和61.86%，多糖保留率分別為84.80%和73.05%。進一步比較D318和OU-1樹脂的靜態吸附動力學過程和樹脂用量、樣液濃度、pH和時間對脫色率、多糖保留率和蛋白清除率的影響，D318樹脂的靜態吸附量高于OU-1。通過靜態實驗得到，樣液質量濃度3mg/m L、樹脂用量3g/25m L、pH=7、處理3h，得出D318樹脂的脫色率、多糖保留率和蛋白清除率分別為67.32%、85.49%、58.76%。因此，最終選出D318樹脂為枸杞多糖提取液的最佳脫色劑。

表4 正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal experiment

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Study on the pigment removal from Lycium barbarum polysaccharides by macroporous resin

LU Xiao-li，LIU Ji-ting，ZHANG Zi-ping*
（Key Laboratory of Chinese Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in theWestern，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

The removal of p igments from crude polysaccharides from Lycium barbarum was investigated.With the orthogonalexperiment，D318 was found to be the bestadsorbent for p igments in lycium barbarum among 9 types ofmacroporous adsorp tion resin tested.On the basis of static adsorp tion experiments，the removal rate of p igments was 67.32%，the retention rate of polysaccharides 85.49%and the p rotein c learance rate 58.76% when 25m L of 3mg/m L crude polysaccharide solution at pH7.0 and 3h was made to flow through 3g of D318 column at a velocity of 3mg/m L.In conc lusion，the resin was suitab le for the decolorization of polysaccharides from Lycium barbarum.

Lycium barbarum polysaccharides；macroporous adsorp tion resin；decolorization

TS255.1

B

1002-0306（2014）18-0293-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.057

2013－11－19 *通訊聯系人

魯曉麗（1988-），女，在讀碩士研究生，主要從事寧夏枸杞的化學成分及活性方面的研究。