番木瓜葉中生物堿的分離與結構鑒定

汪修意，胡長鷹，，*，虞 兵，歐仕益，王志偉

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）（2.廣東省普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東珠海519070）

番木瓜葉中生物堿的分離與結構鑒定

汪修意1，胡長鷹1，2，*，虞 兵1，歐仕益1，王志偉2

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）（2.廣東省普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東珠海519070）

干燥的番木瓜葉用含1%HCl的90%乙醇溶液于常溫下提取5次，濃縮、過濾、石油醚脫脂，NH3·H2O調pH至8.0～9.0，三氯甲烷萃取，得生物堿粗提物。采用硅膠柱柱層析對粗體物進一步進行分離純化，得到番木瓜堿，并通過IR、MS和NRM對其進行了結構鑒定。

番木瓜葉，生物堿，番木瓜堿，結構鑒定

番木瓜（CaricapapayaL.）屬于番木瓜科（Caricaceae），是一種多年生植物，主要種植在斯里蘭卡、印度、菲律賓、東赤道非洲、南美洲等熱帶、亞熱帶國家和地區，這些地區一直將番木瓜作為傳統藥物用來治療多種疾病，甚至包括治療癌癥和傳染性疾病等[1-3]。番木瓜植物的幾乎所有部位都是良好的食用和藥用資源[4-6]。已有研究證實番木瓜植物中含有多種化學活性成分，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制物、生育酚、抗壞血酸、黃酮類、乙基β-D-果糖苷、生氰糖苷和硫代葡萄糖苷等[7-9]。生物堿類物質也是番木瓜植物中的重要活性成分之一。據報道，番木瓜葉中含有4種生物堿，分別為番木瓜堿（carpaine）、偽番木瓜堿（pseudocarpaine）、去氫番木瓜堿I（dehydrocarpaine I）、去氫番木瓜堿II（dehydrocarpaine II），其中番木瓜堿的含量較高[10-11]。Tuffley等[12]研究認為，番木瓜堿可以降低血壓和腸道條狀的心率運動，也可明顯使子宮松弛以及小支氣管擴張。Ogan等[13]研究認為，番木瓜堿具有抗癌活性以及驅蟲活性。Hornick等[14]研究認為，番木瓜堿劑量從0.5～2.0mg/kg可逐步降低小鼠心臟的收縮和舒張壓，以及主動脈的血壓，并證實劑量為2mg/kg時可減少心輸出量、心搏量、搏出能量以及心臟動力。目前，對于番木瓜葉中生物堿的研究主要集中于其粗提物，單一物質的研究鮮見報道，國內還未見相關文獻報道。本研究主要對番木瓜葉中的生物堿成分進行了提取和分離，并鑒定出番木瓜堿單體，為尋找番木瓜植物中藥理活性成分以及其保健功能因子提供依據，同時對進一步開發利用番木瓜植物有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番木瓜葉 采自廣州市增城民聯番木瓜專業合作社；95%的乙醇、石油醚、三氯甲烷、氨水、次硝酸鉍鉀、碘化鉀、碘、濃鹽酸等 均為分析純；GF 254薄層色譜硅膠板 煙臺江友硅膠開發有限公司；硅膠柱填料200～300目柱層層析硅膠 青島海洋化工廠分廠；TLC展開劑 三氯甲烷∶甲醇體積比85∶15，充分混合后使用，現配現用；顯色劑 碘化鉍鉀溶液。

中型提取罐 常州市特威電氣自動化系統有限公司；RE-52 AAB旋轉蒸發器 上海嘉鵬科技有限公司；BS2-100自動部分收集器、HL-1恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-1800紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；SYBO6-10泵 天津市科器高新技術公司；Avance500核磁共振儀 德國Bruker公司；4000Q TrapTM質譜儀 美國Applied Biosystems公司；EQUINOX55傅立葉紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司；ABI4000 Q TRAP液質聯用儀 美國應用生物系統公司

1.2 實驗方法

1.2.1 番木瓜葉生物堿的提取[10-11]將95kg番木瓜鮮葉，在50℃條件下恒溫干燥48h，用粉碎機粉碎，過40目篩，得18kg的番木瓜葉干粉。取15kg干粉，用含1%HCl的90%乙醇溶液，按照料液比為1∶2（kg∶L），pH為4.0～5.0，在常溫條件下提取24h，重復提取操作5次。然后，在50℃條件下對提取液進行減壓濃縮，殘余物過濾，用石油醚按照體積比為1∶2（L∶L）萃取脫脂，脫脂后用NH3·H2O調節水相pH至8.0～9.0，再用三氯甲烷按照體積比為1∶1（L∶L）萃取生物堿，在50℃條件下減壓回收三氯甲烷，得番木瓜葉生物堿粗提物53.35g。取上述部分生物堿粗提物溶于2%的HCl溶液中，制成生物堿鹽溶液，取四份（每份約1mL），分別滴加碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑進行生物堿沉淀實驗。

1.2.2 番木瓜葉生物堿的薄層層析以及液質檢測 取上述部分生物堿粗提物溶于5mL的三氯甲烷溶液，薄層點樣，展開劑為三氯甲烷∶甲醇（85∶15），顯色劑為稀碘化鉍鉀試液。首先在254、365nm紫外燈下觀察斑點，然后用顯色劑顯色后，再觀察斑點，比較斑點的數量及位置。再將樣品進行液質聯用檢測，流動相為乙腈和乙酸銨，按照0～5min 12%的乙腈，5～25min 12%～23%的乙腈，25～35min 23%～30%的乙腈，35～55min 30%的乙腈，55～70min 30%～100%的乙腈[15]進行線性梯度檢測。

1.2.3 番木瓜葉生物堿的分離 稱取350g硅膠于90～100℃條件下干燥2h，干燥器中冷卻，三氯甲烷潤濕，裝于5cm×60cm的層析柱內，用最初洗脫劑三氯甲烷∶甲醇（95∶5）進行洗柱，壓實硅膠。取20g上述生物堿粗提物，溶于10～15mL的三氯甲烷，濕法上樣于硅膠柱中，以三氯甲烷∶甲醇（95∶5）為洗脫劑進行洗脫，洗脫液以50mL每管進行收集，同時應用TLC跟蹤檢測。將Rf值為0.78，有且只有一條清晰可見的橘紅色條帶的洗脫液，合并濃縮回收溶劑，將濃縮物再溶于2%的HCl溶液中，濾紙抽濾，0.45μm濾紙過濾，重復過濾操作多次，直至溶液澄清透明為止，用NH3·H2O調節pH，隨著NH3·H2O的不斷加入，有淡黃色沉淀逐漸生成，加至再無沉淀生成為止，再用0.45μm濾紙過濾得沉淀物。

1.2.4 沉淀物的鑒定 將上述沉淀物溶于甲醇，以甲醇為空白對照，進行全波長掃描測定；將沉淀物與KBr混合均勻壓片，進行紅外吸收光譜鑒定；將沉淀物溶于甲醇，在離子源為ESI源條件下進行MS鑒定；將沉淀物溶于三氯甲烷氘代試劑，在500MHz條件下進行1H-NRM、13C-NRM、135DEPT和90DEPT鑒定。

2 結果與分析

2.1 生物堿初步結果分析

在稀酸環境下，該粗提物能與碘-碘化鉀試劑生成棕褐色沉淀，能與碘化汞鉀試劑生成類白色沉淀，能與碘化鉍鉀試劑生成橘紅色沉淀，能與硅鎢酸試劑生成淺黃色沉淀，均有生物堿的沉淀反應，可初步判斷粗提物中含有生物堿類物質。

該粗提物經優化后的展開劑三氯甲烷∶甲醇（85∶15）展開，稀碘化鉍鉀溶液噴霧顯色，斑點為橘紅色，背景為淺黃色，清晰持久，經觀察可能存在4種生物堿，Rf值分別為0.78、0.59、0.32、0.18。經液質聯用檢測，文獻[10-11]報道的4種生物堿的分子量在25.04、30.39、32.86、33.71min均被檢測到，分別為474去氫番木瓜堿II、478偽番木瓜堿、476去氫番木瓜堿I、478番木瓜堿。

2.2 沉淀物的鑒定分析

將過濾得到的沉淀物于室溫下干燥稱重，得淡黃色粉狀物質1.51g，然后對其進行全波長掃描、紅外光譜、質譜、核磁共振鑒定。

2.2.1 沉淀物的全波長掃描 由圖1可知，番木瓜葉分離得到的生物堿在304nm處有最大吸收，但整體對紫外的吸收強度都比較弱。

圖1 化合物的全波長吸收光譜圖Fig.1 Full wavelength absorption spectra of compound

2.2.2 沉淀物的紅外（IR）吸收光譜 由圖2可知，沉淀物的紅外特征吸收波數為3322cm-1（＞N-H），2927cm-1（-CH3），2856cm-1（-CH2-），1716cm-1（＞C= O），1232cm-1（-O-），與楊秀偉等[16]以及國家醫藥管理局[17]公布的番木瓜堿的紅外吸收相近。

圖2 化合物的紅外吸收光譜圖Fig.2 The infrared absorption spectra of compound

2.2.3 沉淀物的質譜（MS） 由圖3可知，ESI-MS中有m/z：479[M+H]+、495[M+NH3]+、501[M+Na]+等離子峰，表明該沉淀物的相對分子質量為478。

2.2.4 沉淀物的核磁共振（NRM） 核磁數據經MestReNova軟件解析得，1HNMR（500MHz，CDCl3）：δ 4.82（d，J=26.1Hz，2H），2.89（dt，J=12.1，6.1Hz，2H），2.61（d，J=7.2Hz，2H），2.48-2.39（m，2H），2.38-2.27（m，2H），2.10-1.96（m，2H），1.73-1.15（m，30H），1.09（t，J=18.3Hz，6H）。13C NMR（126MHz，CDCl3）：δ 173.51（s），70.36（s），56.04（s），53.62（s），37.43（s），34.61（s），29.78（s），29.14（s），28.76（s），28.72（s），26.42（s），25.51（s），25.39（s），18.71（s），與Sato等[18]、Govindachari等[19]以及Scifinder數據庫中報道的一致。綜上所述，此沉淀物為番木瓜堿，其結構如圖4所示。

圖3 化合物的質譜圖Fig.3 Mass spectra of compound

圖4 番木瓜堿的結構Fig.4 The structure of carpaine

由于番木瓜葉中的任一生物堿至今仍無標準品出售，也未見其檢測方法的研究報道，番木瓜堿純品的獲得與鑒定，有助于番木瓜堿檢測方法的建立，以及其生理功效的進一步研究，同時，也為番木瓜堿分離工藝和方法的探究創造條件。本實驗首次應用硅膠柱柱層析以及化學沉淀法分離得到番木瓜堿純品，方法簡單快速，產品純度高，為番木瓜葉中番木瓜堿的開發利用提供了更加快捷和簡單的方法。

3 結論

本文通過生物堿沉淀法驗證了番木瓜葉中含有生物堿類物質，并通過展開劑為三氯甲烷∶甲醇（85∶15），顯色劑為碘化鉍鉀的薄層層析實驗，以及液質聯用檢測實驗，證實了番木瓜葉中存在4種生物堿，利用硅膠柱柱層析以及化學沉淀法分離得到了番木瓜堿，并鑒定驗證了其結構，為其工藝探究創造條件，番木瓜葉中其余的生物堿還在進一步研究中。

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Isolation and structural identification of alkaloids of papaya leaves

WANG Xiu-yi1，HU Chang-ying1，2，*，YU Bing1，OU Shi-yi1，WANG Zhi-wei2
（1.Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Key Laboratory of Product Packaging and Logistics of Guangdong Higher Education Institutes，Zhuhai 519070，China）

Alkaloids were extracted five times from the dry papaya leaves by the solution of 90%ethanol contains 1%HCl.And then，the extract was concentrated，filtered，and degreased by petroleum ether.The acidity was adjusted to pH8.0～9.0 using concentrate NH3·H2O solution，and then extracted with excess chloroform.After purification of Silica gel column chromatography，alkaloids structural identification was performed with spectral methods（IR、MS、NMR）.The carpaine was isolated and identified.

papaya leaves；alkaloids；carpaine；structure identification

TS209

A

1002-0306（2014）06-0129-03

2013－07－22 *通訊聯系人

汪修意（1987-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品、天然產物提取。

廣東省自然科學基金項目（10151063201000021）；珠海市科技攻關項目（PC20061044）。