毛霉高產中性蛋白酶發酵培養基的優化

劉瑩瑩，劉 穎，張 光，孫冰玉，王金鳳，石彥國

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

毛霉高產中性蛋白酶發酵培養基的優化

劉瑩瑩，劉 穎，張 光，孫冰玉，王金鳳，石彥國*

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實驗材料，采用單因素和正交優化實驗對兩種毛霉高產中性蛋白酶發酵培養基進行優化。結果表明：雅致放射毛霉產中性蛋白酶發酵培養基最佳成分為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為2.5%、KH2PO4添加量為0.4%、CaCl2添加量為0.11%，此條件下中性蛋白酶酶活力達1310.56U/mL；五通橋毛霉產中性蛋白酶發酵培養基最佳成分為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為3.0%、KH2PO4添加量為0.37%、CaCl2添加量為0.07%，此條件下中性蛋白酶酶活力達1306.38U/mL。兩種毛霉酶活力提高的百分比分別為60.1%和46.7%，此研究成果為縮短腐乳后酵周期及直裝腐乳發酵工藝的后續研究奠定了基礎。

發酵培養基，毛霉，中性蛋白酶酶活力

腐乳是我國具有民族特色的傳統大豆發酵制品，在世界飲食文化之林中有著特殊的地位。其口味鮮美、風味獨特、營養豐富，是深受大眾喜愛的佐餐食品，被稱為“東方奶酪”[1]。釀造腐乳包括一系列的物理化學和生物化學過程，大豆浸泡、磨漿、點漿、壓榨成型制成豆腐的工序屬于物理化學過程，豆腐前發酵培菌和加輔料后發酵等主要屬于生物化學過程，每一道工序都會影響其品質[2]。在腐乳生產過程中有多種微生物和酶參與，其共同作用造就了腐乳的獨特風味、營養和一些特殊的保健功能[3-4]。腐乳發酵階段是微生物發揮作用的主要階段，發酵階段可分為前期培菌和后期發酵。前期培菌是在半開放條件下培養微生物的酶系；后期發酵主要是酶系與微生物協同參與生化反應的過程[5-7]。因此，腐乳的生產離不開微生物。常用于生產腐乳的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、紅曲霉及細菌等，其中，毛霉產蛋白酶種類較多、產酶能力較強。本研究以腐乳生產常用的雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實驗菌株，通過對發酵培養基進行優化，提高毛霉產中性蛋白酶的酶活力，從而縮短腐乳發酵周期、解決腐乳生產受季節限制的問題，提高腐乳的生產效率、滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）菌種編號3118、五通橋毛酶（Wutungkiao Mucor）菌種編號40477 購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖 分析純，西隴化工股份有限公司；三氯乙酸 分析純，天津市巴斯夫化工有限公司；黃豆粉、豆坯 哈爾濱珍味糧油冷凍產品商貿集團公司；可溶性淀粉、葡萄糖 分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；硫酸鎂 分析純，天津博迪化工股份有限公司；乳糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白、福林酚 分析純，北京奧博星生物技術有限公司。

80-2B型臺式低速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器 浙江新豐醫療器械有限公司；無菌操作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SY-2-4型電熱式恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司；電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶液制備 取出于28℃、pH6.0條件下，發酵60h的毛霉發酵液于80目的網篩過濾去菌絲，之后將濾液在4000r/min下離心20min；取1.0mL濾液于100.0mL容量瓶中，用磷酸緩沖溶液定容至100.0mL，即制得稀釋酶液[8-9]。

1.2.2 中性蛋白酶酶活測定方法 按照國家標準（GB/T23527-2009），采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力[10]。

1.2.3 毛霉產中性蛋白酶發酵培養基的優化

1.2.3.1 碳源種類及濃度對毛霉發酵產中性蛋白酶酶活力的影響 在發酵培養基中，分別添加10%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉五種碳源，以10%大米粉作參照，并加入2%的豆坯、0.5%的NaCl配制培養基。每500mL三角瓶裝液量150mL，調節pH6.0，0.1MPa、121℃滅菌30min[11]。冷卻后接入孢子數為×106、2%的毛霉孢子懸液，于28℃下培養60h，充分發酵后制成粗酶液，測定中性蛋白酶酶活力，確定最佳碳源種類。

根據上述實驗結果，分別添加8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的蔗糖作為碳源，在相同條件下，測定毛霉產中性蛋白酶酶活力，確定碳源最適添加比例。

1.2.3.2 氮源種類及濃度對毛霉發酵產中性蛋白酶酶活力的影響 在發酵培養基中，分別添加濃度為2%酵母膏、黃豆粉、豆坯、硫酸銨四種氮源，以2%蛋白胨為參照，并加入10%的蔗糖（五通橋毛霉為8%）、0.5%的NaCl配制培養基，其他條件與1.2.3.1相同，測定毛霉產中性蛋白酶酶活力，確定毛霉產中性蛋白酶最佳氮源種類。

根據上述實驗結果，分別添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%比例的黃豆粉作為氮源，在相同條件下，充分發酵后制成粗酶液，測定毛霉產中性蛋白酶酶活力，確定氮源最適添加比例。

1.2.3.3 無機鹽種類及濃度對毛霉發酵產中性蛋白酶酶活力的影響 由于無機鹽種類及添加量對毛霉菌發酵產酶影響很大，故本實驗以相關的研究資料及參考文獻[12-14]為依據，分別在毛霉發酵培養基中添加四種無機鹽成分，MgSO40.04%、NaCl 0.5%、KH2PO40.4%、CaCl20.1%，以空白作參照，并加入10%的蔗糖（五通橋毛霉為8%）、3%的黃豆粉，其他條件與1.2.3.1相同，充分發酵后制成粗酶液，測定毛霉產中性蛋白酶酶活力，確定最佳無機鹽種類及濃度。

根據上述實驗結果，KH2PO4的添加量分別為0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%；CaCl2的添加量分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%。同時添加其他輔料配制培養基，同樣根據蛋白酶活力確定兩種無機鹽的最適添加濃度。

1.2.3.4 毛霉產中性蛋白酶發酵培養基的正交優化根據上述單因素實驗，以蔗糖添加量、黃豆粉添加量、KH2PO4、CaCl2為四個影響因素，采用正交實驗設計L9（34）安排實驗，以毛霉產中性蛋白酶酶活為指標，進行正交優化實驗，因素水平表見下表1和表2。

表1 雅致放射毛霉發酵培養基正交優化因素水平表Table.1 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Actinomucor elegans

表2 五通橋毛霉發酵培養基正交優化因素水平表Table.2 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Wutungkiao Mucor

1.3 數據處理

本實驗采用單因素及無空列正交實驗，每組實驗做三次平行實驗，研究了幾個影響因素對毛霉產中性蛋白酶的影響，并使用SPSS17.0統計軟件對實驗所得數據進行統計分析，最后通過極差分析得出各個影響因素的顯著性。

2 結果與分析

2.1 碳源種類及濃度對毛霉發酵產中性蛋白酶酶活力的影響

由圖1可知，本實驗所使用的幾種碳源，均可被兩種毛霉利用產生蛋白酶。蔗糖和葡萄糖對于蛋白酶的合成有較好的促進作用，其中蔗糖對于蛋白酶合成的誘導作用要顯著優于其他碳源（p＜0.05），兩種毛霉菌產蛋白酶酶活分別達1227.68、1196.19U/mL。葡萄糖有利于毛霉菌絲體的生長，但對于蛋白酶合成的誘導作用無蔗糖明顯（p＜0.05）。故將蔗糖選為毛霉發酵培養基的最佳碳源。

由圖2可知，隨著蔗糖的加入，兩種毛霉菌的產蛋白酶酶活均有所升高；在蔗糖濃度在8%～9%之間時，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；當蔗糖濃度達到10%時，蛋白酶酶活也達到最大值1242.05U/mL和1208.74U/mL；但此后，隨著蔗糖濃度繼續升高時，蛋白酶酶活開始下降，可能是由于過多的蔗糖利于菌絲體的大量生長繁殖而抑制了蛋白酶的生成。故毛霉發酵培養基的碳源濃度選為10%。

圖1 碳源種類對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.1 The influence of carbon source species on neutral protease activity of mucor

圖2 碳源濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.2 The influence of carbon source concentration on neutral protease activity of mucor

2.2 氮源種類及濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響

由圖3可知，本實驗所提供的幾種氮源，均可被兩種毛霉利用產生蛋白酶。其中黃豆粉的促進作用較明顯（p＜0.05），雅致放射毛霉和五通橋毛霉蛋白酶酶活分別達1245.42、1230.28U/mL，而其他幾種氮源雖可被毛霉利用，但對于蛋白酶合成的誘導作用沒有有利的影響（除酵母膏外），蛋白酶酶活沒有基礎培養基的酶活高。故將黃豆粉選為毛霉發酵培養基的最佳氮源。

圖3 氮源種類對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.3 The influence of nitrogen source species on neutral protease activity of mucor

圖4 氮源濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.4 The influence of nitrogen source concentration on neutral protease activity of mucor

由圖4可知，隨著黃豆粉的加入，兩種毛霉菌的產蛋白酶酶活均有所升高；在黃豆粉添加量在1%～2%之間時，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；隨后，蛋白酶酶活上升較緩慢，但仍呈上升趨勢；當黃豆粉添加量在3%時，蛋白酶酶活達到最大值1260.38、1245.37U/mL，故毛霉發酵培養基的氮源添加量選為3%。

2.3 無機鹽種類及濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響

由圖5可知，MgSO4、KH2PO4和CaCl2相對于NaCl而言，在提高蛋白酶酶活的影響較顯著（p＜0.05）。添加MgSO4、KH2PO4和CaCl2的培養基中，雅致放射毛霉的蛋白酶酶活力分別達到了1270.46、1287.36、1280.32U/mL；五通橋毛霉蛋白酶酶活力分別達到了1260.16、1270.15、1272.76U/mL；磷酸鹽在發酵液中起到了緩沖體系pH的作用，對保持產酶環境的穩定，同時也同MgSO4和CaCl2一起起到了誘導毛霉產蛋白酶的作用[15]。綜上所述，在優化毛霉蛋白酶發酵培養基優化方案中的無機鹽選擇為MgSO4、KH2PO4和CaCl2。因為MgSO4的添加量0.04%很小，故對另兩種無機鹽設置濃度梯度實驗。

圖5 無機鹽種類對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.5 The influence of inorganic salt species on neutral protease activity of mucor

由圖6可知，隨著KH2PO4的加入，兩種毛霉菌的產蛋白酶酶活均有所升高。雅致放射毛霉在KH2PO4添加量在0.3%～0.35%之間時，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；當KH2PO4添加量超過0.40%時，蛋白酶酶活出現下降趨勢，即當KH2PO4濃度為0.40%時，蛋白酶酶活達到最大值1283.53U/mL；對于五通橋毛霉，當KH2PO4濃度為0.35%時，五通橋蛋白酶酶活達到最大值1282.58U/mL，故KH2PO4的最佳濃度分別選為0.40%和0.35%。

圖6 KH2PO4濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.6 The influence of KH2PO4concentration on neutral protease activity of mucor

由圖7可知，隨著CaCl2的加入，兩種毛霉菌的產蛋白酶酶活均有所升高。對于雅致放射毛霉，CaCl2添加量在0.06%～0.1%之間時，蛋白酶酶活上升；當CaCl2添加量超過0.1%時，蛋白酶酶活下降；當CaCl2濃度為0.1%時，雅致放射毛霉蛋白酶酶活達到最大值1288.05U/mL。而CaCl2濃度為0.08%時，五通橋毛霉蛋白酶酶活達到最大值1286.02U/mL。綜上，兩種毛霉發酵培養基的最佳CaCl2濃度分別選為0.1%和0.08%。

圖7 CaCl2濃度對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響Fig.7 The influence of CaCl2concentration on neutral protease activity of mucor

2.4 培養基正交優化

2.4.1 雅致放射毛霉發酵培養基正交優化的結果與分析 在單因素實驗的基礎上，以A：蔗糖、B：黃豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的添加量為四個因素進行正交實驗設計，以毛霉產中性蛋白酶酶活力作為評價指標。選用L9（34）正交表對雅致放射毛霉發酵培養基的最佳參數進行優選，采用SPSS17.0進行分析，結果見表3。

由表3中實驗結果及極差RB＞RC＞RD＞RA可知，四個因素對雅致放射毛霉產中性蛋白酶的影響趨勢為B＞C＞D＞A，即黃豆粉添加量對雅致放射毛霉產中性蛋白酶的影響最顯著，其次為KH2PO4、CaCl2、蔗糖添加量。最佳參數組合為A2B1C2D3，即當蔗糖添加量為10%，黃豆粉添加量為2.5%，KH2PO4添加量為0.4%，CaCl2添加量為0.11%時，雅致放射毛霉產蛋白酶酶活最高達1310.56U/mL。

表3 雅致放射毛霉發酵培養基優化正交實驗結果Table.3 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Actinomucor elegans

2.4.2 五通橋毛霉發酵培養基正交優化結果 在單因素實驗的基礎上，以A：蔗糖、B：黃豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的用量為三個因素進行正交實驗設計，以蛋白酶酶活作為評價指標。選用L9（34）正交表對五通橋毛霉發酵培養基的最佳參數進行優選，采用SPSS17.0進行分析，結果見表4。

表4 五通橋毛霉發酵培養基優化正交實驗結果Table.4 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Wutungkiao Mucor

由表4中實驗結果及極差RB＞RD＞RC＞RA可知，四個因素對五通橋毛霉產中性蛋白酶的影響趨勢為B＞D＞C＞A，即黃豆粉添加量對五通橋毛霉產蛋白酶的影響最顯著，其次為CaCl2、KH2PO4、蔗糖添加量。最佳參數組合為A2B2C3D1，即當蔗糖添加量為10%，黃豆粉添加量為3.0%，KH2PO4添加量為0.37%，CaCl2添加量為0.07%時，五通橋毛霉產中性蛋白酶酶活力達1306.38U/mL。

3 結論

本研究以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實驗對象，研究了不同發酵培養基成分及添加量對毛霉產中性蛋白酶酶活力的影響，得出雅致放射毛霉產中性蛋白酶的最佳發酵培養基為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為2.5%、KH2PO4添加量為0.4%、CaCl2添加量為0.11%，在此條件下，中性蛋白酶酶活力達1310.56U/mL；五通橋毛霉產中性蛋白酶的最佳發酵培養基為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為3.0%、KH2PO4添加量為0.37%、CaCl2添加量為0.07%，在此條件下，中性蛋白酶酶活力達1306.38U/mL。

研究結果表明，利用優化的培養基進行毛霉發酵產中性蛋白酶，雅致放射毛霉和五通橋毛霉酶活力提高的百分比分別為60.1%和46.7%，此研究成果為縮短腐乳后酵周期及直裝腐乳發酵工藝的后續研究奠定了基礎。

[1]王家槐.腐乳的營養與保健功能[J].中國釀造，2002，120（4）：82-85.

[2]李金紅.腐乳的生產工藝[J].江蘇調味副食品，2006，23（1）：39-41.

[3]梁恒宇，程建軍，馬鶯.中國傳統大豆發酵食品中微生物的分布[J].食品科學，2004，25（4）：401-404.

[4]王瑞芝.中國腐乳釀造[M].北京：中國輕工業出版社，2008：299-306.

[5]Han B-Z，F M Rombouts，M J R Nout.A Chinese fermented soybean food[J].International Journal of Food Microbiology，2001，65（1-2）：1-9.

[6]Prajapati J B，Nair B M.The histo of fermented foods[J]. Handbook of Fermented Functional Foods，2003：l-25.

[7]Steinkraus K H.Classification of fermented foods：Worldwide review of household fermentation techniques[J].Food Control，1997（8）：311-317.

[8]Prescot M L，Harley P J，Klein A D.Micro-biology[M].New York：McGraw-Hill Companies，Inc，2002：96-121.

[9]李理，羅澤民，盧向陽.毛霉產蛋白酶的特性及其應用研究[J].湖南農業大學學報，1999，25（3）：216-219.

[10]中華人民共和國國家技術監管局.GB/T23527-2009ICS67.22022X69-2009，蛋白酶制劑[S].北京：標準出版社，2009.

[11]魯緋，孫君社，王麗英.雅致放射毛霉胞外蛋白酶特性的研究[J].中國釀造，2004（12）：8-10.

[12]王麗英，王謙，王家槐.雅致放射毛霉深層培養條件及發酵培養基的優化研究[J].中國釀造，2001，116（6）：17-22.

[13]龍菊，吳擁軍，程昌澤.高大毛霉液體發酵培養的優化及產酶特性研究[J].食品工業科技，2008（4）：88.

[14]黃海東.中性蛋白酶高產菌株的選育和發酵條件優化的研究[D].西安：西北大學，1999.

[15]潘進權，羅曉春，王菊芳，等.基于序貫設計的毛霉AS3.2778發酵產蛋白酶工藝優化[J].食品科學，2008，29（12）：481-485.

Optimum fermentation medium of high-yielding neutral protease of mucor

LIU Ying-ying，LIU Ying，ZHANG Guang，SUN Bing-yu，WANG Jin-feng，SHI Yan-guo*
（College of Food Engineering，Key Laboratory of Food Science and Engineering of Common Colleges and Universities in Heilongjiang Province，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Actinomucor elegans and Wutungkiao Mucor were used as experimental materials，through single factor and orthogonal experiments，the optimization of fermentation medium composition for high-yielding protease of two kinds of hair mould was researched.The results showed that the optimal fermentation medium composition for neutral protease of Actinomucor elegans was：sucrose content 10%，soybean flour 2.5%，KH2PO40.4%，CaCl20.11%，the neutral protease activity was 1310.56U/mL.The optimal fermentation medium composition for neutral protease of Wutungkiao Mucor was：sucrose content 10%，soybean flour 3.0%，KH2PO40.37%，CaCl20.07%，the last neutral protease activity was 1306.38U/mL.The improve percentage of neutral protease activities were 60.1%and 46.7%respectively.This research laid the foundation for follow-up study of shortenning the fermentation cycle of fermented bean curd and production process of direct-loading fermented bean curd.

fermentation medium；mucor；neutral protease activity

TS214.2

A

1002-0306（2014）06-0166-05

2013－08－05 *通訊聯系人

劉瑩瑩（1988-），女，碩士研究生，研究方向：大豆化學與深加工技術。

十二五國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03-4）。