紅松樹皮多酚的提取工藝及其抗氧化活性的研究

黃雨洋，王振宇

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江糧食職業學院，黑龍江哈爾濱150080；3.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

紅松樹皮多酚的提取工藝及其抗氧化活性的研究

黃雨洋1，2，王振宇1，3，*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江糧食職業學院，黑龍江哈爾濱150080；3.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

采用酶解預處理結合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物，并對其抗氧化活性進行了研究。以多酚得率和羥自由基清除率為指標，在單因素實驗基礎上，采用響應曲面法對紅松樹皮多酚的提取工藝進行優化，確定最優提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。在該最優提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的分別高達11.84%和76.91%。應用電子自旋共振（ESR）法測定抗氧化活性，多酚提取物對羥自由基的清除能力隨加入濃度的增加而增加，表明高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性。

紅松樹皮，多酚，提取，抗氧化活性

紅松（Pinus koraiensis），亦稱果松、海松。常綠喬木，高達40m。葉五針一束，長6～12cm。分布于我國東北長白山到小興安嶺地區，常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林，是重要的農林資源，其果實紅松種子以其顆粒飽滿，營養豐富而聞名，自古就是食療佳品，具有較高的藥用價值及保健功能。研究表明，松屬植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[1]，具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤及抗菌等生物活性[4-5]。其中多酚類成分是重要的抗氧化劑，具有很大的開發潛力。自由基大量積累會導致多種疾病，如動脈硬化、癌癥[6-7]、心臟病、糖尿病等。近年來，天然抗氧化劑的研究備受關注，其中多酚類是主要的抗氧化活性成分之一。多酚類抗氧化成分可以清除自由基，防治過氧化引起的多種疾病[8]。

自由基是含有一個或多個不對稱電子的原子，分子或離子。生物體內的自由基種類繁多，以活性氧為主，其中包括超氧陰離子，過氧化氫，羥自由基及單線態氧[9-10]。自由基及其誘導的氧化反應引起的膜脂質氧化性損傷是導致人體衰老和某些疾病的重要因素[11]，如癌癥、白內障、心血管疾病等。另外，許多研究表明一些天然抗氧化劑可以作自由基清除劑[12]。因此，這些天然高效的食品抗氧化劑與人類健康的關系是研究的熱點[13]。近年有研究表明，紅松多酚具有抗氧化和清除自由基的作用[14]，但用電子自旋共振（ESR）技術直接檢測其清除效能尚未見報道。

本實驗采用酶解預處理結合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物，應用電子自旋共振（ESR）分析法測定多酚化合物的抗氧化活性，探究不同提取工藝條件對多酚得率和抗氧化性的影響，并對紅松樹皮多酚化合物的提取工藝條件進行優化，以期為進一步開發此天然抗氧化劑資源用于研制防治癌癥及心血管疾病的新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松樹皮 收集于黑龍江省伊春；纖維素酶（30u/mg） 廈門星隆達化學試劑有限公司；電子捕獲劑DMPO Sigma公司；福林試劑 天津華特化研科技有限公司；沒食子酸、碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、無水乙醇 均為國產分析純。

高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器公司；恒溫水浴鍋 北京醫療電子儀器廠；酸度計 上海大中分析儀器廠；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用公司；R-205B旋轉蒸發儀 上海申勝儀器公司；電子天平 西安興成智儀器；E R 200D SRC ESR光譜測定儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 紅松樹皮→40℃條件下烘干→粉碎后過40目篩→準確稱取5.0g松殼粗粉于四頸中加入酶液→在不同酶解條件下（加酶量、酶解時間、酶解溫度）進行酶解處理→加入濃度為95%的乙醇溶液→水浴振蕩浸提→4000r/min離心取上清液→測定多酚含量。

1.2.2 紅松樹皮多酚提取工藝的單因素實驗 固定加酶量為120U/g、酶解時間為2h、酶解溫度為50℃、乙醇添加量為50%，在其他條件不變的條件下，以多酚得率（%）和羥自由基清除率（%）為指標，選取加酶量為60、90、120、150、180U/g，酶解時間為1、1.5、2、2.5、3h，酶解溫度為30、40、50、60、70℃，乙醇添加量為30%、40%、50%、60%、70%，進行單因素實驗，每組實驗進行3次平行。

1.2.3 紅松樹皮多酚提取工藝的優化實驗 采用響應曲面分析法對實驗進行設計。在單因素實驗的基礎上，根據中心組合設計原理，設計響應面分析實驗，利用Design-Expert軟件對實驗進行過程優化，以多酚得率R1（%）和羥自由基清除率R2（%）為響應值，選擇加酶量A（U/g）、酶解時間B（h）、酶解溫度C（℃）和乙醇添加量D（%）為影響因素，每個因素設定5個水平進行實驗。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table.1 Encode Table.of factors and levels

1.2.4 紅松樹皮多酚得率的測定 采用福林酚法測定提取液中多酚含量。以沒食子酸為標準對照品，精確量取100μg/mL的沒食子酸溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL置于10mL比色管中，加蒸餾水至2mL，搖勻后加1.0mL福林酚試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光值，得到標準曲線方程，y= 0.0534x+0.1529，式中，x表示多酚含量（mg/g干重）；y表示吸光度。

準確吸取適量體積的紅松樹皮提取液1mL于10mL比色管中，加蒸餾水定容至2mL。加入1.0mL福林試劑后搖勻，4min后加入1.0mL10%碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h后測定溶液在765nm處的吸光度值。將吸光度值代入標準曲線方程計算樣品中多酚類成分含量。

1.2.5 紅松樹皮多酚提取物清除羥自由基能力的測定 參照Rosen等的方法[15]。羥基自由基由Fenton反應產生。加入25μmol/L的硫酸亞鐵50μL，樣品50μL（空白用水），蒸餾水170μL，濃度為300mmol/L的DMPO 33μL，雙氧水200μmol/L，100μL。將反應體系吸入密封的毛細管中。2.5min后用E R 200D SRC ESR光譜儀記錄ESR圖譜。測定條件如下：中心場強為3000G，掃描寬度為100G，微波頻率為9.858GHz，功率為2.25mW。

松多酚對羥基自由基的清除作用以清除率（%）表示，計算公式為：

式中：HX和H0分別為不同濃度松多酚和不添加多酚物質的ESR圖譜第二峰信號強度（高度）。

1.3 數據處理

原始數據的整理采用Microsoft Excel（Office 2003）和Origin8.5完成；采用統計學軟件SPSS17.0對實驗數據進行統計分析；采用Design-Expert中心組合及混合中心設計進行數據分析及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1 加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響

圖1為加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖1可知，隨著加酶量的增加，多酚得率和羥自由基清除率先逐漸增加，隨后保持平緩。當加酶量為120U/g時，多酚得率和羥自由基清除率達到最佳，再繼續增加加酶量，多酚得率和羥自由基清除率沒有明顯變化。這可能是由于纖維素酶會破壞紅松樹皮的細胞壁，使更多的多酚物質釋放，從而使多酚得率提高，而羥自由基清除率隨著多酚含量的增加而增加。綜合考慮，選取最佳加酶量為120U/g。

圖1 加酶量對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme additive amount on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.1.2 酶解時間對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖2為酶解時間對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖2可知，隨著酶解時間的延長，多酚得率和羥自由基清除率先緩慢增加，再迅速增加，而后保持平緩。當酶解時間為2.5h時，多酚得率和羥自由基清除率達到最高，再繼續延長酶解時間，多酚得率和羥自由基清除率沒有明顯變化。這可能是由于酶解達到一定時間后，細胞內的多酚物質幾乎全部釋放出來，再繼續延長酶解時間，對反應沒有影響。綜合考慮，選取最佳酶解時間為2.5h。

圖2 酶解時間對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.1.3 酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖3為酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，多酚得率和羥自由基清除率呈先增加后降低的趨勢。當酶解溫度為50℃時，多酚得率和羥自由基清除率達到最高，再繼續增加酶解溫度，多酚得率和羥自由基清除率反而下降。這可能是由于纖維素酶在其最適酶解溫度范圍內有較高的酶解活性，超出最適范圍酶解能力下降，多酚得率和羥自由基清除率相應降低。綜合考慮，選取最佳酶解溫度為50℃。

2.1.4 乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響 圖4為乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響。由圖4可知，隨著乙醇添加量的增加，多酚得率和羥自由基清除率呈先增加后降低的趨勢。當乙醇添加量為50%時，多酚得率和羥自由基清除率達到最高，再繼續增加乙醇添加量，多酚得率和羥自由基清除率反而下降。這可能是由于乙醇添加量在適合的范圍內，傳質阻力小，多酚溶解性好，會使多酚得率和羥自由基清除率增加；而乙醇添加量過多會影響多酚得率和羥自由基清除率。綜合考慮，選取最佳乙醇添加量為50%。

圖3 酶解溫度對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

圖4 乙醇添加量對多酚得率和羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ethanol additive amount on the yield of polyphenols and free radical scavenging rate

2.2 響應面優化實驗

實驗采用響應曲面法進行過程優化，實驗設計與數據處理采用統計軟件Design-Expert來完成。以加酶量A（U/g）、酶解時間B（h）、酶解溫度C（℃）和乙醇添加量D（%）分別代表的因素為自變量，以多酚得率R1（%）和羥自由基清除率R2（%）為響應值，響應面實驗方案及結果見表2。實驗號1～24為析因實驗，25～36為12個中心實驗，用以估計實驗誤差。

多酚得率R1通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下：

R1=11.98-0.15A+0.046B+0.060C+0.061D+0.083AB-0.0056AC+0.21AD+0.29BC-0.27BD+0.034CD-0.19A2-0.33B2-0.15C2-0.33D2

采用Design-Expert軟件對方程進行方差分析，多酚得率R1的方差分析結果見表3。

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=95.91%，R2Adj=93.19%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：A＞D＞C＞B，即加酶量＞乙醇添加量＞酶解溫度＞酶解時間。交互項AD、BC、BD交互作用顯著，其對多酚得率影響的響應面分析見圖5。

羥自由基清除率R2通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下：

R2=77.19-1.09A+0.23B+0.53C+0.38D+0.66AB-0.091AC+1.67AD+2.30BC-1.98BD+0.22CD-2.02A2-3.11B2-1.72C2-2.93D2

采用Design-Expert軟件對方程進行方差分析，羥自由基清除率R2的方差分析結果見表4。

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=97.21%，R2Adj=95.35%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：A＞C＞D＞B，即加酶量＞酶解溫度＞乙醇添加量＞酶解時間。交互項AD、BC、BD交互作用顯著，其作用（顯著項）對羥自由基清除率影響的響應面分析見圖6。

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，通過分析軟件Design-Expert尋找最優響應結果。當加酶量、酶解時間、酶解溫度和乙醇添加量對應的編碼值分別為-0.33、0.16、0.30和-0.07時，多酚得率和羥自由基清除率有最大值分別為12.03%和77.40%。紅松樹皮多酚最優提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。

表3 多酚得率的方差分析結果Table.3 Results of variance analysis for the yield of polyphenols

為了驗證模型預測的準確性，在響應面優化的工藝條件下，即加酶量116.70U/g，酶解時間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%，進行紅松樹皮多酚提取實驗，重復3次驗證實驗取平均值，在該最優提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的平均值分別為11.84%和76.91%，與預測值12.03%和77.40%較接近，可見該模型能較好地預測紅松樹皮多酚的提取情況，證明該實驗參數準確可靠。最終確定紅松樹皮多酚最優提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%。

2.3 多酚提取物對羥自由基清除作用

多酚提取物具有一定的抗氧化活性，對很多自由基有一定的清除作用，包括羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+自由基等[16]。其中羥自由基是最活潑的化學物質之一，是己知最強的氧化劑，它幾乎可以和所有細胞成分發生反應，對機體危害極大[17]。H2O2與Fe2+反應產生的羥自由基能與DMPO形成加合物，該加合物的ESR圖的信號峰強度與羥自由基的濃度成正比。圖7為不同濃度多酚提取物對羥自由基清除作用的影響，由圖7可知，隨著多酚提取物濃度的增加，羥自由基清除率逐漸升高，但升高的速率逐漸減慢。這也就是說高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性，在保證高羥自由基清除作用的前提上，控制多酚提取物的濃度，對降低成本、節省資源具有重要的現實意義。

圖6 兩因素交互作用（顯著項）對羥自由基清除率影響的響應面圖Fig.6 Response surface for effect of two factor interactions（significant items）on free radical scavenging rate

圖7 不同濃度多酚提取物對羥自由基清除作用的影響Fig.7 Effect of different concentrations of polyphenols extractive on hydroxyl free radical scavenging

3 結論

本文對紅松樹皮多酚的提取工藝及其抗氧化活性進行了研究，主要采用酶解預處理結合乙醇浸提法提取紅松樹皮多酚化合物。以多酚得率和羥自由基清除率為指標，在單因素實驗基礎上，采用響應曲面法對紅松樹皮多酚的提取工藝進行優化，確定最優提取工藝為：加酶量116.70U/g，酶解時間2.60h，酶解溫度53.00℃，乙醇添加量49.30%，在該最優提取條件下多酚得率和羥自由基清除率的分別高達11.84%和76.91%。應用電子自旋共振（ESR）法測定抗氧化活性，多酚提取物對羥自由基的清除能力隨加入濃度的增加而增加，表明高濃度多酚提取物會提高其抗氧化活性。

[1]Arrabal C，Cortijo M，Simon B F，et al.Differentiation among five spanish pinus pinaster provenance based on its oleoresin terpenic composition[J].Biochemical Systematics and Ecology，2005，33：1007-1016.

[2]Aquilano K，Baldelli S，Rotilio G，et al.Role of nitric oxide synthases in parkinson’s disease：A review on the antioxidant and anti-inflammatory activity of polyphenols[J].Neurochemical Research，2008，33（12）：2416-2426.

[3]Padilla F C，Rincon A M，Bou-Rached L.Polyphenol content and antioxidant activity of several seeds and nuts[J].Arch Latinoam Nutr，2008，58（3）：303-308.

[4]D S Pureswaran，R Gries，H John.Quantitative variation in monoterpenes in four species of conifers[J].Biochemical Systematics and Ecology，2004，32：1109-1136.

[5]C Arrabal，M Cortijo，B F Simon，et al.Differentiation among five spanish pinus pinaster provenance based on its oleoresin terpenic composition[J].Biochemical Systeatics and Ecology，2005，33：1007-1016.

[6]Cabello-Hurtado F，Gicquel M，Esnault M-A.Evaluation of the antioxidant potential of cauliflower（Brassica oleracea）from a glucosinolate content perspective[J].Food Chemistry，2012，132（2）：1003-1009.

[7]Ramirez M R，Guterres L，Dickel O E，et al.Preliminary studies on the antinociceptive activity of vaccinium ashei berry in experimental animal models[J].Journal of Medicinal Food，2010，13（2）：336-342.

[8]Oueslati S，Trabelsi N，Boulaaba M，et al.Evaluation of antioxidant activities of the edible and medicinal Suaeda species and related phenolic compounds[J].Industrial Crops and Products，2012，36（1）：513-518.

[9]魏朝良，于德紅，安利佳.黃酮類化合物及清除自由基機制的探討[J].中成藥，2005，27（2）：239-241.

[10]崔劍，李兆隴，洪嘯吟.自由基生物抗氧化與疾病[J].清華大學學報：自然科學版，2000，4（6）：9-12.

[11]M Leone，D Zhai，S Sareth，et al.Cancer prevention by tea polyphenols is linked to their direct inhibition of antiapoptotic bcl-2-family proteins[J].Cancer Research，2003，63：8118-8121.

[12]Bursal E，Gül?in I·.Polyphenol contents and in vitro antioxidant activities of lyophilised aqueous extract of kiwifruit（Actinidia deliciosa）[J].Food Research International，2011，44（5）：1482-1489.

[13]Butterfield D A，Casten G A A，Pocernich C B，et al. Nutritional approaches to com bat oxidative stress in Alzheimer’s disease[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2002，13：444-461.

[14]蘇曉雨，王振宇.紅松子種皮提取物活性成分及抗氧化作用研究[J].林產化學與工業，2010，30（8）：99-102.

[15]Rosen G M，Rauckman E J，Packer I L.Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals[J].Methods in Enzymology，1984，105：198-209.

[16]蘇曉雨.紅松種殼組成及多酚提取分離與抗氧化抗腫瘤功能研究[D].黑龍江：哈爾濱工業大學，2011.

[17]趙曉丹，胡小松.ESR法評價醋蒜提取物的抗氧化活性[J].中國調味品，2011，36（3）：46-49.

Study on extraction of polyphenols of red pine bark and their antioxidant activity

HUANG Yu-yang1，2，WANG Zhen-yu1，3，*
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Grain Vocational College，Harbin 150080，China；3.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

The extraction of polyphenols compounds of red pine bark using enzymatic hydrolysis pretreatment combined with ethanol immersion extraction was researched.And antioxidant activity of polyphenols was also studied.Yield of polyphenols and hydroxyl free radical scavenging rate as indicators，on the basis of single factor experiment，technological parameters of extracting polyphenols were determined by response surface method to optimize extraction process conditions as following：enzyme additive amount 116.70U/g，enzymatic hydrolysis time 2.60h，enzymatic hydrolysis temperature 53.00℃，ethanol additive amount 49.30%.Under the condition of the extraction process，yield of polyphenols and hydroxyl free radical scavenging rate were 11.84% and 76.91%respectively.Electron spin resonance（ESR）assay was employed to evaluate the antioxidant activity of polyphenols.Hydroxyl free radical scavenging rate of polyphenols improved with the increase of adding polyphenols concentration，which indicated high concentrations of polyphenols could enhance their antioxidant activity.

red pine bark；polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS201

A

1002-0306（2014）06-0171-07

2013－09－02 *通訊聯系人

黃雨洋（1979-），女，博士研究生，講師，研究方向：天然產物分離純化及功能性。

國家自然科學基金資助項目（31170510）。