一株抗真菌食竇魏斯氏菌AT6的特性分析及培養(yǎng)條件優(yōu)化

常 偉，饒 瑜，胡懷容，張友華，李明元

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

一株抗真菌食竇魏斯氏菌AT6的特性分析及培養(yǎng)條件優(yōu)化

常 偉，饒 瑜，胡懷容，張友華，李明元*

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

對(duì)食竇魏斯氏菌AT6的抑菌特性進(jìn)行了研究，并采用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明AT6發(fā)酵液在酸性pH條件下對(duì)白色念珠菌等具有較好的抑制效果，在pH4時(shí)，抑制率78%～86%。通過響應(yīng)曲面優(yōu)化食竇魏斯氏菌最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH5.5，34℃條件下培養(yǎng)40h，其抑菌率較優(yōu)化前可提高16.36%。

食竇魏斯氏菌，抑真菌，培養(yǎng)條件，響應(yīng)面

真菌是造成食品工業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要腐敗微生物[1]，對(duì)其控制的傳統(tǒng)方法往往是向食品中添加化學(xué)防腐劑[2]。但由于近年來不斷發(fā)生的化學(xué)防腐劑安全事件，更加健康的生物保鮮劑越來越受到人們的重視[3-4]。乳酸菌作為較早應(yīng)用于食品中的微生物，可以起到一定的生物防腐作用[5]，而近年來對(duì)乳酸菌的深入研究表明，乳酸菌生長過程中除能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)外[1]，還會(huì)產(chǎn)生一些抑制真菌的物質(zhì)，例如苯乳酸[4，6-7]、環(huán)二肽[4]、3-羥基脂肪酸[8]和其他的肽類物質(zhì)[7]，這都為新型生物保鮮劑研究指明了方向。

Weissella cibaria最早是2002年由Bjorkroth，KJ等所報(bào)道[9]，之后在很多發(fā)酵食品中都發(fā)現(xiàn)其存在[10]。現(xiàn)已報(bào)道的抗真菌乳酸菌大多是屬于乳桿菌屬，對(duì)于魏斯氏菌屬的報(bào)道仍較少[11]，因此對(duì)食竇魏斯氏菌的研究還有較大的發(fā)展空間。本文對(duì)一株Weissella cibaria AT6的抑菌特性進(jìn)行了探究，并通過響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)抑菌成分的分析及機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）AT6 分離自泡菜；白色念珠菌（ATCC 90028）、光滑假絲酵母（ATCC 90030）、近平滑念珠菌（ATCC 22019）、葡萄牙念珠菌（ATCC 42720）、熱帶念珠菌（ATCC 750）、克魯維畢赤酵母、白地霉 均由西華大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；乳酸、醋酸 成都市科龍化工試劑廠；蛋白酶K、胰蛋白酶 Sigma公司；胃蛋白酶 Merck公司；MRS培養(yǎng)基 牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸出粉5g/L，K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，吐溫-80 1g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸銨2g/L，pH6.2～6.6；YM培養(yǎng)基 酵母浸出粉3g/L，麥芽浸粉3g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，pH6.0～6.4。

SGSP-02電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40AI立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療核子儀器廠；680型酶標(biāo)儀 美國伯樂公司；5804R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；PHS-3C酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌種子液 保藏菌株于MRS培養(yǎng)基中活化2～3次，恢復(fù)活力后劃線于MRS平板，4℃保存。挑選單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12h，得乳酸菌種子液。

1.2.2 乳酸菌無菌體發(fā)酵液的制備 乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)后在4℃、8000r/min離心10min后經(jīng)0.22μm濾膜過濾制得乳酸菌無菌體發(fā)酵液（Cell free supernatant，CFS），4℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法 抑菌實(shí)驗(yàn)采用微量孔板法[1]。96孔板每孔加入190μL的乳酸菌無菌體發(fā)酵液以及10μL濃度為104孢子/mL的指示菌懸液。在30℃條件下培養(yǎng)48h后于酶標(biāo)儀630nm下測定其吸光值。乳酸菌的抑菌活性以其對(duì)指示真菌的抑菌率表示。

抑菌率（%）=（1-ODLAB/ODControl）×100

1.2.4 有機(jī)酸排除實(shí)驗(yàn) 分別用乳酸和醋酸將MRS肉湯培養(yǎng)基調(diào)至同AT6無菌體發(fā)酵液相同的pH，使用微量孔板法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 AT6發(fā)酵液對(duì)pH的敏感性 將AT6無菌體發(fā)酵液pH調(diào)至3.5、4、4.5、5、6，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 蛋白酶對(duì)其抑菌率的影響 將AT6無菌體發(fā)酵液pH分別調(diào)至各蛋白酶最適pH，分別加入終濃度為10mg/mL的蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶溶液于37℃處理1h，沸水浴3min滅活，冷卻后調(diào)至發(fā)酵液原始pH，以未處理發(fā)酵液為對(duì)照進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 食竇魏斯氏菌AT6的培養(yǎng)條件優(yōu)化 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)食竇魏斯氏菌AT6抑菌效果影響顯著的培養(yǎng)溫度（℃）、培養(yǎng)時(shí)間（h）和培養(yǎng)基初始pH三個(gè)因素為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以抑菌率（%）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1[13]。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table.1

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸酸排除實(shí)驗(yàn)

食竇魏斯氏菌AT6的無菌體發(fā)酵液pH為4.06，分別使用乳酸和醋酸將MRS肉湯培養(yǎng)基調(diào)至相同pH，使用微量孔板法測其抑菌效果如圖1所示。

圖1 有機(jī)酸排除實(shí)驗(yàn)Fig.1 Exclusion test of organic acid

由圖1可以看出，在相同pH條件下AT6無菌體發(fā)酵液對(duì)各指示菌的抑菌率均要高于乳酸及醋酸，這說明AT6發(fā)酵液的抑菌作用可能是由有機(jī)酸的協(xié)同作用或是還存在其他的抑菌物質(zhì)。就大多數(shù)指示菌而言，乳酸的抑菌率均要低于醋酸的抑菌率，這是由于醋酸（pKa=4.75）具有比乳酸（pKa=3.86）更高的pKa值，因而在同樣pH時(shí)會(huì)有更多未解離的有機(jī)酸分子形態(tài)通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并釋放H+，酸化細(xì)胞質(zhì)從而對(duì)其生長造成抑制，這也同Johan Schnürer等[14]的描述相一致。

2.2 AT6發(fā)酵液抑菌物質(zhì)對(duì)pH的敏感性

將AT6發(fā)酵液調(diào)至不同pH進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著發(fā)酵液pH的升高，AT6發(fā)酵液對(duì)各指示菌的抑菌率顯著下降，這表明發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)對(duì)pH的敏感性較高，在較低pH條件時(shí)有較好的抑菌效果，在pH為4.5以上時(shí)抑菌活性急劇下降，在pH為5時(shí)的抑菌率已經(jīng)降至50%以下。Lavermicocca等[15]指出這種抗真菌活性對(duì)酸的依賴同細(xì)胞膜的親脂性有關(guān)，同時(shí)也與未解離有機(jī)酸比例有關(guān)。酸性條件下有機(jī)酸由解離形式向未解離形式轉(zhuǎn)變，而未解離形式的有機(jī)酸有更高的抑菌能力，因而在較低pH時(shí)會(huì)有更好的抑菌效果。

圖2 pH對(duì)AT6發(fā)酵液抑菌率的影響Fig.2 Influence of pH on the inhibition rate of cell-free supernatant of AT6

2.3 抑菌成分對(duì)酶的敏感性

AT6發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶處理后數(shù)據(jù)圖如圖3所示。由圖3可以看出，經(jīng)各蛋白酶處理后的發(fā)酵液抑菌率同對(duì)照組結(jié)果雖有一定程度波動(dòng)，但仍具有較強(qiáng)的抑菌作用，說明AT6的抑菌作用并非由蛋白類物質(zhì)產(chǎn)生。目前，對(duì)食竇魏斯氏菌菌中蛋白類抑菌物質(zhì)的報(bào)道較少，僅有Sirinat Srionnual等[10]發(fā)現(xiàn)一株W.cibaria 110可產(chǎn)蛋白類抑菌物質(zhì)命名為Weissellicin 110，但也僅對(duì)少數(shù)細(xì)菌有抑制作用。

2.4 食竇魏斯氏菌AT6培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由于食竇魏斯氏菌AT6對(duì)白色念珠菌的抑制效果較好，因而在培養(yǎng)條件優(yōu)化中選擇白色念珠菌為指示菌。根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)AT6抑菌率影響顯著的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。對(duì)其進(jìn)行多元回歸擬合，得到抑菌率（Y）對(duì)培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、培養(yǎng)基初始pH（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：

Y=81.52-9.56A+4.37B-7.29C+3.67AB+0.55AC-1.15BC-13.32A2-6.79B2+0.57C2

圖3 蛋白酶對(duì)AT6發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.3 Infulence of proteolytic enzymes at the inhibition rate of cell-free supernatant of AT6

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.2 Design and results of response surface tests

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9676，表明回歸方程擬合良好，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有96.76%的符合度，修整系數(shù)說明本模型具有較高的可信度。各項(xiàng)方差分析結(jié)果見表3，模型的p＜0.01，表明模型極為顯著；失擬系數(shù)大于0.05，失擬相對(duì)誤差不顯著，從另一方面說明模型較好的擬合度，響應(yīng)曲面圖如圖4所示。

表3 回歸模型方差分析表Table.3 The variance analysis for regression model

圖4 各因素對(duì)食竇魏斯氏菌AT6無菌體發(fā)酵液抑菌率的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plot for inhibition rate of cell free supernatants from Weissella cibaria AT6 effected by three factors

由響應(yīng)曲面圖可以較直觀的看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。從圖4（A）可以看出，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用較其它兩個(gè)交互較為顯著，在一定的培養(yǎng)時(shí)間下，無菌體發(fā)酵液的抑菌率隨著溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在35℃時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著溫度的繼續(xù)升高則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而在固定的培養(yǎng)溫度時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑菌率表現(xiàn)出先增大后趨于平緩的趨勢(shì)。

由圖4（B）、4（C）可知，培養(yǎng)基初始pH同培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)溫度的交互作用較弱，在固定的培養(yǎng)基初始pH條件下，隨著培養(yǎng)溫度的升高抑菌率呈現(xiàn)先增高后逐漸下降的趨勢(shì)。而在一定pH條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑菌率先上升后趨于平緩。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由回歸模型方程可得乳酸菌無菌體發(fā)酵液達(dá)到最佳抑菌效果是在培養(yǎng)基初始pH為5.5時(shí)于33.32℃條件下培養(yǎng)39.80h，在此條件下得抑菌率為91.94%。為便于實(shí)際操作，將培養(yǎng)條件修正為34℃、培養(yǎng)基初始pH5.5、培養(yǎng)時(shí)間為40h，結(jié)果得抑菌率為90.51%± 0.87%，同預(yù)測值間相對(duì)誤差為1.5%。優(yōu)化前原始條件：初始pH6.2、37℃培養(yǎng)48h所得抑菌率為77.78%± 1.79%，經(jīng)響應(yīng)曲面優(yōu)化后所得較優(yōu)化前提高了16.36%。

3 結(jié)論

經(jīng)有機(jī)酸排除實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵液對(duì)pH及蛋白酶的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食竇魏斯氏菌AT6發(fā)酵液中起到抑菌作用的成分除了有機(jī)酸外，可能還有其他非蛋白類抑菌物質(zhì)的存在，也可能是由于各成分間的復(fù)合作用所產(chǎn)生。同時(shí)AT6發(fā)酵液在較低pH時(shí)有較好的抑菌效果，隨著pH的升高抑菌效果急劇下降。

通過采用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面分析，建立乳酸菌抑菌率的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)優(yōu)化可知在培養(yǎng)基初始pH為5.5時(shí)于34℃條件下培養(yǎng)40h后該乳酸菌的無菌體發(fā)酵液有最佳的抑菌效果：抑菌率可達(dá)90.51%± 0.87%，較優(yōu)化前提升了16.36%，本文為分析乳酸菌發(fā)酵液中的抑菌成分及抑菌機(jī)理等后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。

[1]Gerez CL，Torres MJ，F(xiàn)ont de Valdez G，et al.Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria[J].Biological Control，2013，64（3）：231-237.

[2]Sathe SJ，Nawani NN，Dhakephalkar PK，et al.Antifungal lactic acid bacteria with potential to prolong shelf-life of fresh vegetables[J].J Appl Microbiol，2007，103（6）：2622-2628.

[3]Lind H，Sjogren J，Gohil S，et al.Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains[J].FEMS Microbiol Lett，2007，271（2）：310-315.

[4]Strom K，Sjogren J，Broberg A，et al.Lactobacillus plantarum MiLAB 393 Produces the Antifungal Cyclic Dipeptides Cyclo（LPhe-L-Pro）and Cyclo（L-Phe-trans-4-OH-L-Pro）and 3-Phenyllactic Acid[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（9）：4322-4327.

[5]Reis JA，Paula AT，Casarotti SN，et al.Lactic Acid Bacteria Antimicrobial Compounds：Characteristics and Applications[J]. Food Engineering Reviews，2012，4（2）：124-140.

[6]Lavermicocca P，Valerio F，Evidente A，et al.Purification and characterization ofnovelantifungalcompounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（9）：4084-4090.

[7]Magnusson J，Schnurer J.Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（1）：1-5.

[8]Sjogren J，Magnusson J，Broberg A，et al.Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14[J].Appl Environ Microbiol，2003，69（12）：7554-7557.

[9]Bjorkroth KJ，Schillinger U，Geisen R，et al.Taxonomic study of Weissella confusa and description of Weissella cibaria sp. nov.，detected in food and clinical samples[J].Int J Syst Evol Microbiol，2002，52（Pt 1）：141-148.

[10]Srionnual S，Yanagida F，Lin LH，et al.Weissellicin 110，a newly discovered bacteriocin from Weissella cibaria 110，isolated from plaa-som，a fermented fish product from Thailand[J].Appl Environ Microbiol，2007，73（7）：2247-2250.

[11]Ndagano D，Lamoureux T，Dortu C，et al.Antifungal activity of 2 lactic acid bacteria of the Weissella genus isolated from food[J].Journal of food science，2011，76（6）：M305-311.

[12]Yang EJ，Chang HC.Purification of a new antifungal compound produced by Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi[J].Int J Food Microbiol，2010，139（1-2）：56-63.

[13]饒瑜，常偉，唐潔，等.產(chǎn)細(xì)菌素屎腸球菌E6的特性分析及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：119-201.

[14]Schnürer J，Magnusson J.Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives[J].Trends in Food Science&Technology，2005，16（1-3）：70-78.

[15]Valerio F，Lavermicocca P，Pascale M，et al.Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria：an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation [J].FEMS Microbiol Lett，2004，233（2）：289-295.

Characteristic analysis and optimization of incubate condition for an antifungal Weissella cibaria AT6

CHANG Wei，RAO Yu，HU Huai-rong，ZHANG You-hua，LI Ming-yuan*
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China）

The characteristics of antifungal activity of Weissella cibaria AT6 was discussed and the incubate condition was optimized by response surface method.Results showed that the cell-free supernatant of AT6 displayed an obvious inhibitory activity against Canidia Albicans，especially at acidic condition.The inhibition rate was 78%to 86%at pH4.0.When the AT6 stain was incubated in MRS at 34℃for 40h with initial pH5.5，the best inhibition rate was obtained with 16.36%increasing than the before experiment.

Weissella cibaria；anti-fungus；cultivating condition；response surface method

Q939.11+7

A

1002-0306（2014）06-0193-04

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

常偉（1987-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

“十二·五”四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012NZ0002）；西華大學(xué)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（Z1120536）；四川省教育廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0026）。