反應條件對殼聚糖/果糖美拉德產物抗氧化性和抑菌性的影響

董志儉，李冬梅，徐黎涵，李學鵬，鐘克利，勵建榮

（渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013）

反應條件對殼聚糖/果糖美拉德產物抗氧化性和抑菌性的影響

董志儉，李冬梅，徐黎涵，李學鵬，鐘克利，勵建榮*

（渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013）

殼聚糖具有較強的抑菌性，但其抗氧化性能較差。通過美拉德反應，對殼聚糖進行改性，以增強其抗氧化性和抑菌性。研究了殼聚糖/果糖配比、反應溫度、pH和反應物濃度對美拉德產物（MRPs）的抗氧化性和抑菌性的影響。結果表明，殼聚糖/果糖配比1∶1，反應溫度121℃，反應體系初始pH5.0，反應物濃度2%時，所得到的MRPs的抗氧化性和抑菌性較強；通過美拉德反應的改性處理，殼聚糖MRPs的抗氧化性和抑菌性明顯優于殼聚糖本身。

殼聚糖，美拉德反應，抗氧化性，抑菌性

美拉德反應是一種廣泛存在于食品加工過程中的非酶褐變反應，主要是指羰基化合物和氨基化合物間的復雜反應，它不僅影響食品的風味、色澤和營養價值，其產生的類黑精、還原酮及一系列含氮、硫的揮發性雜環化合物還會賦予產物以良好的抗氧化活性[1-4]和抑菌性[5]。

殼聚糖是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4鍵連接而成的一種多用途天然聚合物糖類，具有良好的抑菌性、成膜性、生物相容性、生物可降解性[6-8]，但其抗氧化性能較差[9]。殼聚糖是氨基供體，因此可以利用其與還原糖之間的美拉德反應提高其抗氧化性。王惠英等用殼聚糖與葡萄糖、麥芽糖、糊精進行美拉德反應，發現三種美拉德產物對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較好的清除效果[10]；孫濤等以葡萄糖、麥芽糖和木糖通過美拉德反應對低聚殼聚糖進行改性處理，結果發現改性后低聚殼聚糖衍生物的抑菌效果和抗氧化能力都明顯增強[11-12]。目前對殼聚糖進行美拉德改性處理以同時增強其抗氧化性和抑菌性方面的報道卻很少。

本文以果糖通過美拉德反應對殼聚糖進行改性處理，研究殼聚糖/果糖配比、反應溫度、pH和反應物濃度對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響，并比較美拉德反應前后殼聚糖抑菌性和抗氧化性的變化。該研究對于具有優良抗氧化性和抑菌性的殼聚糖衍生物的開發具有一定的價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 食品級，脫乙酰度為90.3%，浙江金殼生物化學有限公司；果糖、DPPH 上海華藍化學科技有限公司；營養瓊脂 北京奧博星生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵冰乙酸、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉 均為分析純。

PB-10 pH計 賽多利斯公司；280B滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；BCD-213FTMZ冰箱 合肥美的榮事達電冰箱有限公司；JB-90-2磁力攪拌器 上海衡平儀器儀表廠；722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機 Sigma公司；JB 081007超凈工作臺 蘇州華科凈化設備有限公司；DHP060恒溫培養箱 上海實驗儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRPs的制備 準確稱取一定量的殼聚糖和果糖于100mL錐形瓶中，再加入10mL 1%的醋酸溶液，將磁力攪拌器的攪拌速度調至最大，充分攪拌使殼聚糖與果糖完全溶解，調節至一定的pH。最后置于高壓蒸汽滅菌器中，在一定的溫度下反應15min。每個樣品測定3次，取平均值。

1.2.1.1 殼聚糖/果糖配比對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響 使體系中殼聚糖與果糖總濃度為2%，溫度為121℃，調節反應體系初始pH為5.0，殼聚糖與果糖配比分別為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1時進行美拉德反應15min，所得MRPs于0℃下保存，測定其抗氧化性和抑菌性。

1.2.1.2 反應溫度對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響

使體系中殼聚糖與果糖總濃度為2%，殼聚糖與果糖配比為1∶1，反應溫度為100、105、110、115、121℃，調節反應體系初始pH為5.0時，進行美拉德反應15min，所得MRPs于0℃下保存，測定其抗氧化性和抑菌性。

1.2.1.3 反應體系初始pH對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響 使體系中殼聚糖與果糖總濃度為2%，殼聚糖與果糖配比為1∶1，調節反應體系初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，于121℃下進行美拉德反應15min，所得MRPs于0℃下保存，測定其抗氧化性和抑菌性。

1.2.1.4 反應物濃度對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響 使體系中殼聚糖與果糖總濃度分別為0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%，殼聚糖與果糖配比為1∶1，調節反應體系初始pH為5.0，于121℃下分別進行美拉德反應15min，所得MRPs于0℃下保存，測定其抗氧化性和抑菌性。

1.2.1.5 MRPs與殼聚糖的抗氧化性和抑菌性對比使體系中殼聚糖與果糖總濃度為2%，殼聚糖/果糖配比為1∶1，調節體系初始pH為5.0，于121℃反應15min，得到MRPs。相同條件下，以濃度為1%的殼聚糖乙酸溶液做對照實驗。

1.2.2 MRPs抗氧化性的測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 MRPs的DPPH自由基清除率的測定參考趙玉清[13]的方法。將樣品溶液稀釋17倍，準確吸取樣品稀釋液3.0mL于10mL的具塞試管中，再加入3.0mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液，充分振蕩，使之混勻，在室溫下避光靜置33min，在517nm波長處測得吸光度Ai。以去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。

DPPH自由基清除率（%）=[1－（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.2.2 還原能力的測定 MRPs的還原能力的測定參考孫濤[12]的方法。將樣品溶液稀釋17倍。準確吸取樣品稀釋液2.5mL于試管中，分別向其中加入2.5mL pH為6.6的磷酸鹽緩沖液，以及2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃下恒溫水浴20min，然后加2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，充分振蕩、混勻，再用高速冷凍離心機于10000r/min時離心10min，準確吸取上清液2.5mL于試管中，再加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，于700nm波長處測定吸光度。

1.2.3 MRPs抑菌性的測定 MRPs抑菌性的測定采用圓濾紙片（6mm）法[13]，測定MRPs對金黃色葡萄球菌所形成的抑菌圈直徑的大小。向培養皿中倒入20mL營養瓊脂培養基，凝固后在平板中加入0.2mL供試菌，涂布均勻后放上已于反應液中浸泡30min的濾紙片，等距離分散，每個樣品做3次實驗，同時用無菌水做對照實驗，恒溫（37℃）培養24h后，測定圓濾紙片的抑菌圈直徑，取其平均值。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖/果糖配比對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖比例的增加，MRPs的還原能力和對DPPH自由基的清除率呈現先升后降的趨勢。當殼聚糖/果糖的配比為1∶1時，MRPs的還原能力最強，對DPPH自由基的清除率最高，達到91.45%。這是因為殼聚糖是氨基供體，隨著殼聚糖添加比例的增大，反應體系中氨基數目增多，與果糖提供的羰基的反應更充分，生成大量具有抗氧化活性的物質，但當殼聚糖比例過大時，反應體系中氨基與羰基數目不均衡，使MRPs的抗氧化能力減弱。郭麗萍等[14]在研究木糖-甘氨酸的MRPs抗氧化性能時也發現，隨著氨基化合物甘氨酸摩爾比例的增加，其MRPs的抗氧化性能呈現出先升后降的現象。

圖1 殼聚糖/果糖配比對抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of proportion of chitosan and fructose on antioxidant activities

圖2 殼聚糖/果糖配比對抑菌性的影響Fig.2 Effect of proportion of chitosan and fructose on antibacterial activity

殼聚糖與果糖的配比對MRPs抑菌性的影響如圖2所示。隨著殼聚糖比例的增加，抑菌圈的直徑呈現先增后減的趨勢。殼聚糖與果糖的配比為1∶4的反應體系的抑菌圈直徑為6mm，與濾紙片的直徑相同，說明該體系無抑菌性。而殼聚糖/果糖配比為2∶1的反應體系的抑菌圈直徑為9mm，抑菌性最強。

綜合以上實驗可以看出，殼聚糖/果糖配比為1∶1時，通過美拉德改性處理，能夠使殼聚糖的還原能力最強，對DPPH自由基的清除率最高，抑菌性也較強。

2.2 反應溫度對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響

圖3是反應溫度對MRPs的抗氧化能力的影響。隨著反應溫度的升高，體系的還原能力和DPPH自由基清除率也逐漸增大，尤其以121℃時的體系抗氧化能力最高；這是因為高溫有利于美拉德反應的進行，使體系在較短時間內生成類黑精、還原酮及一系列含N、含S的雜環化合物，這些物質對MRPs的還原能力和DPPH自由基清除能力具有重要作用。Sun等[15]以雞肉蛋白水解液、還原糖、半胱氨酸鹽酸鹽等為反應原料制備MRPs時，也發現隨著反應溫度的升高，MRPs的還原能力逐漸上升，其DPPH自由基清除能力逐漸增強。

圖3 反應溫度對抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on antioxidant activities

圖4為反應溫度對MRPs的抑菌性的影響。隨著美拉德反應溫度的升高，抑菌圈的直徑逐漸增大；當反應溫度為121℃時，體系的抑菌圈直徑最大，抑菌性最強。

圖4 反應溫度對抑菌性的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on antibacterial activity

因此，當反應溫度為121℃時，通過美拉德反應對殼聚糖進行改性處理，可使體系具有較強的抗氧化性和抑菌性。

2.3 pH對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響

由于殼聚糖只溶解于稀酸溶液中，因此反應體系初始pH必須為酸性，當體系初始pH≥5.5時，MRPs呈凝膠狀，無法測定其抗氧化性和抑菌性，為了避免凝膠現象，控制初始pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。

圖5是pH對MRPs抗氧化能力的影響。隨著pH增大，MRPs對DPPH自由基的清除率呈顯著上升趨勢，由pH3.0時的8.13%升高到pH5.0時的91.45%，其還原能力也呈現增強的趨勢。這是因為隨著初始pH的升高，MRPs的供氫能力和自由基抑制能力增大，使得還原能力和DPPH清除能力增強[16-18]。Lertittikul等[19]在研究豬血蛋白和葡萄糖的MRPs的還原能力和DPPH自由基清除率時也發現，隨著體系初始pH逐漸升高，其MRPs的還原能力逐漸增強，其DPPH自由基清除率也逐漸升高。

圖5 pH對抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of pH on antioxidant activities

由圖6可知，隨著pH的逐漸增大，反應體系的抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢。這可能是因為當控制pH≤4.0時，隨著pH的升高，美拉德反應速度加快，使體系的抑菌能力有所提高；但pH超過4.0后，殼聚糖的溶解性和質子化程度降低，故抗菌能力逐漸減弱[20]。有此可見，當反應體系的初始pH為4.0時，體系的抑菌圈直徑最大，抑菌性最強。

圖6 pH對抑菌性的影響Fig.6 Effect of pH on antibacterial activity

pH為5.0時，通過美拉德反應，殼聚糖衍生物的抗氧化性最強，其抑菌性雖然不是最強的，但其抑菌圈直徑超過8mm，也表現出良好的抑菌性，綜合考慮，選擇pH5.0做下一步反應條件。

2.4 反應物濃度對MRPs抗氧化性和抑菌性的影響

當反應物濃度為4%時，MRPs形成凝膠，無法測定其的抗氧化性和抑菌性，因此控制反應物濃度為0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%。

由圖7可知，隨著反應物濃度的增大，MRPs對DPPH自由基清除率迅速升高，其還原能力也逐漸增大，說明體系抗氧化能力正逐漸增強，當反應物濃度為2%時，MRPs對DPPH自由基清除率和還原能力最強。Matmaroh等[21]在研究反應物濃度對果糖-甘氨酸美拉德體系抗氧化性能影響時也發現，隨著反應物濃度的增大，MRPs的還原能力和DPPH自由基清除率逐漸增強；而于汐洋等[22]在研究咸味香精中美拉德反應產物的抗氧化性時發現，隨著反應物濃度的增大，美拉德反應程度加深，生成的類黑精、還原酮等抗氧化物質的量增大，因此抗氧化能力增強。

圖7 反應物濃度對抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of reactant concentration on antioxidant activities

由圖8可知，隨著反應物濃度的增大，體系的抑菌圈直徑呈逐漸增大的趨勢，說明體系的抑菌性逐漸增強。廖愛琳等[23]在研究殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響時也發現，體系中殼聚糖濃度的增大，會使其抑菌性增強。這可能是因為殼聚糖濃度越大，反應體系中-NH3+的濃度也越高，吸附在細胞膜表面，與磷壁酸結合，改變了細胞膜的通透性，擾亂了細胞的正常生理功能，使其生長繁殖受阻，進而達到抑菌的效果[24]。

圖8 反應物濃度對抑菌性的影響Fig.8 Effect of reactant concentration on antibacterial activity

綜上，當反應物濃度為2%時，體系的抗氧化性和抑菌性都可以達到較好的效果。

2.5 MRPs與殼聚糖的抗氧化性和抑菌性對比

由表1可知，殼聚糖在未經美拉德改性處理時，其DPPH·清除率幾乎為0，還原能力也較低，抑菌圈直徑為8.5mm（濾紙片直徑6mm），說明殼聚糖具有一定的抑菌性，但抗氧化性較差；經過美拉德反應改性處理后，殼聚糖MRPs的DPPH·清除率顯著提高，還原能力也有一定的增強，抑菌圈直徑達到10mm。因此，殼聚糖經過美拉德反應改性后，不但其抗氧化性顯著增強，抑菌性也略有提升。

表1 MRPs與殼聚糖的抗氧化性和抑菌性Table.1 The antioxidant and antibacterial activity of MRPs and chitosan

3 結論

3.1 通過美拉德反應對殼聚糖進行改性處理，結果表明，隨著殼聚糖比例的增加，MRPs的抗氧化性和抑菌性呈現先增后減的趨勢；隨著反應溫度的升高和反應物濃度的增大，MRPs的抗氧化性和抑菌性增強；而當pH增加時，MRPs的抗氧化性雖然增強，但抑菌性減弱。

3.2 當殼聚糖/果糖配比為1∶1，反應溫度為121℃，反應體系初始pH為5.0，反應物濃度為2%時，所得到的MRPs的抗氧化性和抑菌性較強；與殼聚糖相比，MRPs的DPPH自由基清除率顯著提高，還原能力也有一定的增強，抑菌性能也優于殼聚糖本身。

[1]孔保華，李菁，劉騫.美拉德反應產物抗氧化機理及影響因素的研究進展[J].東北農業大學學報，2011，42（11）：9-13.

[2]趙晶，馬丹，雅張筠，等.酪蛋白與還原糖美拉德反應產物抗氧化性的研究[J].食品工業科技，2011，32（12）：187-189，293.

[3]沈軍衛，樊金玲，朱文學，等.模式美拉德反應產物的抗氧化性與反應進程的關系研究[J].食品科技，2010，35（3）：253-257.

[4]Benjakul S，Lertittikul W，Bauer F.Antioxidant activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-sugar model system[J].Food Chemistry，2005，93（2）：189-196.

[5]Trang V T，Takeuchi H，Kudo H，et al.Antimicrobial Activity of Aminoreductone against Helicobocter pylori[J].Food Chemistry，2009，57（23）：11343-11348.

[6]Roler S，Covill N.The antifungal propertyes of chitosan in laboratory media and apple juice[J].Food Microbiology，1999，47：67-77.

[7]Qin C Q，Zhou B，Zeng L T，et al.The physicochemical properties and antitumor activity of cellulose treated chitosam[J]. Food Chemistry，2004，84（1）：107-115.

[8]耿健強，李鵬，闞興傳，等.殼聚糖保鮮包裝材料的研究及應用進展[J].化工新型材料，2010，38（6）：42-46.

[9]Kanatt S R，Chander R，Sharma A.Effect of irradiatedchitosan on the rancidity of radiation-processed lambmeat[J]. Food Science and Technology，2004，39（9）：997-1003.

[10]王慧英，孫濤，周冬香，等.殼聚糖與糖美拉德反應產物的抗氧化性能研究[J].食品科技，2007（6）：65-68.

[11]孫濤，胡冬梅，謝晶.低聚殼聚糖美拉德衍生物抑菌性能研究[J].天然產物研究與開發，2012，24（2）：164-167，190.

[12]孫濤，陳春紅，謝晶.基于與木糖進行美拉德反應的低聚殼聚糖衍生物的抗氧化性能研究[J].天然產物研究與開發，2011，23（2）：219-223.

[13]趙玉清，部金鳳，海華，等.殼聚糖復合物的抑菌性研究[J].中國生物工程雜志，2005，25（5）：67-70.

[14]郭麗萍，王鳳舞，劉翠翠.木糖與甘氨酸美拉德反應產物抗氧化性能的研究[J].食品工業科技，2012，33（7）：79-81.

[15]Sun W Z，Zhao M M，Cui C，et al.Effect of Maillard reaction products derived from the hydrolysate of mechanically deboned chicken residue on the antioxidant，textural and sensory properties of Cantonese sausages[J].Meat Science，2010，86（2）：276-282.

[16]Eichner K.Antioxidanteffect of Maillard reaction intermediates[J].Food and Nutrition Science，1981（5）：445-451.

[17]Benjakul S，Lertittikul W，Bauer F.Antioxidant activity of Maillard reaction products froma porcine plasma protein-sugar model system[J].Food Chemistry，2005，93：189-196.

[18]Murakami M，Shigeeda A，Danjo K，et al.Radical scavenging activity and brightly colored pigments in the early stage of Maillard reaction[J].Food Science，2002，67（1）：93-96.

[19]Lertittikul W，Benjakul S，Tanaka M.Characteristics and antioxidative acticity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-glucose model system as influenced by pH[J]. Food Chemistry，2007，100（2）：669-677.

[20]吳小勇，曾慶孝，阮征，等.殼聚糖的抑菌機理及抑菌特性研究進展[J].中國食品添加劑，2004（6）：46-49，68.

[21]Matmaroh K，Benjakul S，Tanaka M.Effect of reactant concentrations on the Maillard reaction in a fructose-glycine modelsystem and the inhibition ofblack tiger shrimp polyphenoloxidase[J].Food Chemistry，2006，98（1）：1-8.

[22]于汐洋，汪何雅，錢和.咸味香精中美拉德反應產物的抗氧化性研究[J].食品工業科技，2010，31（3）：181-184.

[23]廖愛琳，吳曉萍，易蜀婷，等.殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌活性的研究[J].中國食物與營養，2011，17（4）：40-43.

[24]紹榮，許琦，余小紅，等.殼聚糖抗菌性能的研究[J].食品科學，2007，28（9）：121-124.

Effect of reaction conditions on antioxidant and antibacterial properties of MRPs by chitosan/fructose

DONG Zhi-jian，LI Dong-mei，XU Li-han，LI Xue-peng，ZHONG Ke-li，LI Jian-rong*
（Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Chitosan possesses strong antibacterial properties but poor antioxidant activities.Chitosan was modified by Maillard reaction to improve its antioxidant and antibacterial properties.Effects of the ratio of chitosan/fructose，reaction temperature，pH and reactantconcentration on antioxidantand antimicrobial properties of Maillard reaction products（MRPs）were investigated.The results showed that MRPs possessed strong antioxidant and antimicrobial properties when the ratio of chitosan/fructose 1∶1，reaction temperature 121℃，pH5.0，and reactant concentration of 2%.Through Maillard reaction，antioxidant and antimicrobial properties of MRPs of chitosan were significantly superior to chitosan itself.

chitosan；Maillard reaction；antioxidant activities；antimicrobial properties

TS201.2

B

1002-0306（2014）06-0212-05

2013－07－17 *通訊聯系人

董志儉（1977-），男，博士，講師，研究方向：水產品貯藏加工與質量安全控制。

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B06）。