抗菌蛋白膜的包裝性能及抑菌性能的研究

黃志英，雷 橋，包建強，尋倩男，張玉亭

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

抗菌蛋白膜的包裝性能及抑菌性能的研究

黃志英，雷 橋*，包建強，尋倩男，張玉亭

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

以前期均勻實驗設計得出的最優配方（5%乳清分離蛋白（WPI）、2%酪蛋白酸鈉（NaCas）和50%甘油）為成膜材料，在此基礎上，向成膜溶液中添加不同濃度（0、0.025、0.05、0.075、0.1g/200mL）的乳酸鏈球菌素（Nisin）制備抗菌蛋白膜，研究Nisin對復合蛋白膜的包裝性能及抑菌性能的影響。結果表明，Nisin與WPI-NaCas復合膜有較好的相容性，Nisin的添加提高了復合蛋白膜的抗張強度和斷裂伸長率，降低了其水蒸氣透過系數，但不影響膜的熱封溫度（145℃）。隨著Nisin濃度的提高，膜的耐熱性能隨之增大。載Nisin的WPI-NaCas復合膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用。

抗菌蛋白膜，乳酸鏈球菌素，包裝性能，抑菌性能

抗菌蛋白膜是一種新型、可以取代塑料、無污染的、可用于食品的包裝材料，它有能力延緩水分、氧氣、香味和溶質傳遞，并且在醫藥、食品等領域得到廣泛開發與利用[1-4]。乳清分離蛋白因其良好的營養特性及成膜的能力，能形成柔軟、有彈性的薄膜，而且對氧氣、芳香物質和油脂具有良好的阻隔性[5]。酪蛋白、酪蛋白酸鹽具有其獨特的疏水性，采用其作為可食性膜的原料，能降低膜的吸濕能力[6]。當在成膜溶液中添加食品添加劑（如抗氧化劑、抗菌劑等），能更好地延長食品的保質期[7]。Nisin是一種安全公認的食品添加劑，因為其能夠很好地抑制大部分革蘭式陽性菌，而且當在特定條件下Nisin也能抑制革蘭氏陰性菌，因此已被50多個國家和地區批準使用[8-11]。Ramos等[12]以乳清分離蛋白作為基體材料，甘油作為增塑劑，并在成膜溶液中添加殼寡糖，乳酸和苯甲酸鈉，結果發現，乳酸和殼寡糖的組合能產生最大的抑菌效應。Sivarooban等[13]將葡萄籽提取物（1%）、乳酸鏈球菌素（10，000IU/g）和EDTA（0.16%）添加到大豆分離蛋白的成膜溶液中，結果發現李斯特桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的生長分別減少了2.9、1.8、0.6lg CFU/mL。

前期均勻實驗設計研究得出由5%乳清分離蛋白、2%酪蛋白酸鈉和50%甘油復合制備而成的蛋白膜，成膜性好，有良好的機械性能（抗張強度為3.56MPa，伸長率為48.9%）、光學性能（透明度為92.0%，霧度為22.72%）和阻濕性能（水蒸氣透過系數為2.626×10-13g·m-1·s-1·Pa-1），能夠替代部分塑料。本實驗在均勻實驗設計方法制備乳清分離蛋白-酪蛋白酸鈉復合膜的基礎上，在成膜溶液中添加Nisin研制抗菌蛋白膜，旨在為抗菌蛋白膜的研制及使用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白 美國Hilmar公司，蛋白＞92.0%，脂肪＜1.8%，乳糖＜1.0%，灰分＜3.5%；酪蛋白酸鈉 新西蘭MG公司，92.9%蛋白；甘油 國藥試劑集團，分析純；Nisin 浙江銀象生物工程有限公司，生物效價＞1000IU/mg，食品級；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococ cus aureus） 由農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海）提供。

YP202N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市科瑞儀器有限公司；SHB－ⅢA型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；GXZGF101型恒溫鼓風干燥箱 上海賀德實驗設備有限公司；GDS－100L型恒溫恒濕箱 索亞特實驗設備有限公司；DCP－KZ300型電腦測控抗張實驗機 四川成都名馳儀器有限責任公司；PERMATRAN－W1/5水蒸氣透過率測試儀 美國膜康有限公司；0～25mm電子數顯螺旋測微儀 桂林廣陸數字測控有限責任公司；HPX-9052 MBE型數顯電熱培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；熱封測試儀 廣州標際包裝設備有限公司；TG NETZSCH 209 F3型熱重分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；S3400N型掃描電鏡 Hitachi（日立）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 成膜工藝流程 a.將5g乳清分離蛋白加入到100mL去離子水中，在常溫下攪拌2h使其充分溶解，再將此溶液置于85℃水浴30min，使蛋白變性，制得乳清分離蛋白溶液，冷卻備用。b.將2g酪蛋白酸鈉加入到100mL去離子水中，在常溫下攪拌2h使其充分溶解，再將此溶液置于85℃水浴30min，使蛋白變性，制得酪蛋白酸鈉溶液，冷卻備用。c.將乳清分離蛋白溶液與酪蛋白酸鈉溶液以1∶1的體積比混合，添加50%（占總物質百分比）甘油，再分別加入不同濃度的Nisin（0、0.025、0.05、0.075、0.1g/200mL）[14]，常溫下攪拌1h，使其充分混合，制得抗菌蛋白膜溶液。d.用真空泵排氣。e.采用流延法成膜，55℃干燥5h后，置于25℃、50%RH的恒溫恒濕箱中平衡48h后，再進行性能測試[15]。

1.2.2 微觀結構 采用S3400N掃描電鏡觀察膜橫截面的微觀結構，并得到薄膜表面的圖形，儀器的加速電壓為5.0千伏[16]。

1.2.3 性能測定方法

1.2.3.1 膜厚度的測定 任選五個點，并用電子數顯螺旋測微儀測試，并取其均值。厚度值是用于抗張強度、水蒸氣透過率等性能測試的計算。

1.2.3.2 機械性能的測試 根據ASTM-09[17]，將膜裁切成長90.00mm，寬15.00mm的長條，用電腦測控抗張實驗機測試抗張強度（TS）和斷裂伸長率（E）。設定夾距50mm，速度500mm/min，抗張強度由TS=F/S計算得到，其中TS為抗張強度（MPa），F為膜斷裂時承受的最大張力（N），S為膜的橫截面積（m2）。每個樣品測3次，取其平均值。

1.2.3.3 水蒸氣透過率測定 根據ASTM E398[18]，采用PERMATRAN-W1/5透濕儀測試在膜的兩側相對濕度為10%/100%下膜的水蒸氣透過率，水蒸氣透過系數由WVP=WVTR×n/Δp計算得到，其中，WVP為水蒸氣透過系數（g·m-1·s-1·Pa-1），WVTR是通過透濕儀測試得到的水蒸氣透過量，n為膜的厚度，Δp為氣體的輸出壓力，為0.20MPa。每個樣品測3次，取其平均值。

1.2.3.4 熱封性能測試 采用熱封測試儀測定薄膜的熱封溫度[19]，將試樣置于上下熱封頭之間，在預先設定的溫度、壓力、時間下，完成試樣的封口，測定其熱封溫度。

1.2.3.5 熱重分析 采用NETZSCH TG209F3熱重分析儀測試，將3.0～5.0mg樣品置于Al2O3坩堝，測量溫度范圍為35℃到850℃，升溫速率為10℃/min，為避免熱氧化反應將氮氣作為載體[20]。

1.2.4 膜的抗菌效果的測定 用切刀將膜裁成直徑為16.00mm大小的圓片，貼在均勻涂布了兩種受試菌種菌懸液的瓊脂培養基的表面（該過程在無菌條件下操作），將培養皿倒置培養于37℃恒溫培養24h，觀察膜表面菌體生長現象[21]，并記錄抑菌圈的直徑。

2 結果與討論

2.1 掃描電鏡分析結果

圖1 添加Nisin的WPI-NaCas復合膜的微觀結構圖Fig.1 Scanning electron microscopy（SEM）of WPI-NaCas films with different Nisin

圖1是不同濃度Nisin對復合膜的掃描電鏡的微觀結構圖。由圖1可知，所有的薄膜表面光滑均勻，無氣孔或者裂縫。與未添加Nisin的膜相比，添加Nisin的薄膜表面的結構更緊湊。這可能是因為Nisin與蛋白膜分子內和分子間發生了交聯作用，這說明Nisin與WPI-NaCas的相容性較好。

2.2 Nisin對復合蛋白膜機械性能及水蒸氣透過率的影響

表1為Nisin對復合蛋白膜機械性能及水蒸氣透過率的影響。由表1可知，與對照組相比，Nisin的加入，TS增大，E也增大。成膜溶液中不添加Nisin，膜的抗張強度為3.56MPa，伸長率為48.9%。當Nisin的添加量為0.05g時，抗菌蛋白膜的抗張強度最大，為4.92MPa，比未添加Nisin的膜的抗張強度增加了38.2%；當Nisin的添加量為0.075g時，抗菌蛋白膜的伸長率最大，為65.7%，比未添加Nisin的膜的伸長率增加了34.3%。

表1 Nisin對復合蛋白膜機械性能及水蒸氣透過率的影響Table.1 Effect of Nisin on the mechanical properties and water vapor permeability of the composite protein films

由此表明，添加Nisin對復合蛋白膜能起到增強和增韌的作用。這是可能是因為Nisin添加適量時，在復合蛋白膜中分散均勻，并與蛋白質的無定形區域肽鏈側鏈產生相互作用。從而增強復合蛋白膜的抗張強度和斷裂伸長率。

由表1可知，與對照組相比，Nisin的加入，膜的水蒸氣透過系數降低。成膜溶液中不添加Nisin，膜的水蒸氣透過系數為2.626×10-13g·m-1·s-1·Pa-1。當Nisin的添加量為0.05g時，抗菌蛋白膜的水蒸氣透過系數最低，為0.887×10-13g·m-1·s-1·Pa-1，比未添加Nisin的膜的水蒸氣透過系數降低了66.2%。但是當繼續增加Nisin的添加量至0.075、0.1g時，抗菌蛋白膜的水蒸氣透過系數又緩慢回升，分別為0.924×10-13、0.973× 10-13g·m-1·s-1·Pa-1。

由此表明，添加Nisin能降低復合蛋白膜的水蒸氣透過系數。這可能是因為Nisin是疏水性多肽，適當的添加量（0.05g/200mL）有助于擴大分子間的相互作用，使復合蛋白膜致密均勻，能防止水分通過膜，從而降低了薄膜的水蒸氣透過系數。但是隨著Nisin的添加量的繼續增加，復合蛋白膜的結構緊湊性可能有所松動，水分通過膜有所增強，使得薄膜的水蒸氣透過系數略微回升。

2.3 薄膜熱封性能

Nisin的加入不會影響膜的熱封溫度，為145℃，抗菌蛋白膜的熱封溫度高于普通PE膜，低于蒸煮袋（PE膜的熱封溫度為120℃，蒸煮袋的熱封溫度為150～160℃）。

2.4 熱重分析結果

圖2是不同濃度Nisin對復合膜的熱重分析圖，由圖2可知，膜的質量損失主要出現在三個階段。第一階段的質量損失在35～180℃之間，膜的質量損失了14.03%，可能是因為膜的游離水的損失。第二階段的質量損失出現在溫度約為180～420℃之間，其降解速率最大，膜的質量損失了74.08%，可能是因為甘油化合物（沸點約為289℃）和游離水的損失。第三階段的質量損失出現在420～560℃，占膜總量的5.75%。而當溫度大于600℃時，膜的熱分解更穩定，可能因為加熱過程中產生的交聯反應。由熱重分析圖可以看出，抗菌蛋白膜在低于150℃的條件下質量損失較小，比較穩定，適合使用。而且隨著Nisin濃度的增加，膜的耐熱性能也逐漸增大。

圖2 添加Nisin的WPI-NaCas復合膜的熱重分析圖Fig.2 TGA curves of WPI-NaCas films with different Nisin

2.5 Nisin對受試菌種的抑菌效果

表2 Nisin對受試菌種的抑菌作用Table.2 Effect of antimicrobial activity of Nisin against bacteria tested

表2為不同濃度的Nisin對受試菌種的抑菌作用的影響，由表2可知，在成膜溶液中不添加Nisin，膜是沒有抑菌作用；載入Nisin的抗菌膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑制作用，這與前人的研究結果（Nisin能夠很好地抑制大部分革蘭式陽性菌，但是不能抑制革蘭氏陰性細菌）[22]相矛盾，但將Nisin單獨加入蛋白膜中是否對大腸桿菌有抑制作用的研究很少，這可能是因為Nisin加入，使蛋白質的空間結構發生變化，從而使大腸桿菌菌體蛋白質減少。隨著Nisin濃度的增加，膜對兩種菌的抑制作用都增強。當在成膜溶液中添加0.025g Nisin時，膜對大腸桿菌的抑菌圈直徑為20.00mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為22.20mm；當Nisin的添加量增加到0.1g時，膜對大腸桿菌的抑菌圈直徑為30.00mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為30.20mm。由表2可知，隨著Nisin濃度的增大，抑菌效果也更好。因此通過抑菌實驗，可以判定Nisin-復合蛋白膜具有抑菌作用。

3 結論

Nisin與WPI-NaCas復合蛋白膜相容性較好，與對照組相比，組織更加致密。抗菌蛋白膜的TS增大，E增大，WVP降低。抗菌蛋白膜的熱封溫度為145℃，適用溫度小于150℃。

抗菌蛋白膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，并且隨Nisin濃度的增加而增強。

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Study on packaging performance and antimicrobial properties of antibacterial composite protein films

HUANG Zhi-ying，LEI Qiao*，BAO Jian-qiang，XUN Qian-nan，ZHANG Yu-ting
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The composite protein film-forming materials contained 5%whey protein isolate（WPI），2%sodium caseinate（NaCas）and 50%glycerol，which was the optimal formula obtained by uniform design method of previous work.The packaging performance and antimicrobial properties of WPI-NaCas composite protein films were discussed by addition of Nisin at different concentrations（0，0.025，0.05，0.075，0.1g/200mL）in film-forming solution.Results showed that Nisin and composite protein films showed good compatibility.Addition of Nisin could improve tensile strength and elongation at break of the composite protein films and decrease WVP values of the films，with no effect on the sealing temperature of antibacterial protein films.The increase of Nisin caused the improvement of heat resistance of the films.And incorporation of Nisin had antimicrobial activity against both E.coli and S.aureus.

antibacterial protein films；Nisin；packaging performance；antimicrobial properties

TS206.4

A

1002-0306（2014）06-0288-04

2013－09－13 *通訊聯系人

黃志英（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品工程與包裝技術。

上海高校知識服務平臺上海海洋大學水產動物遺傳育種中心（ZF1206）。