一氧化氮對綠熟和粉紅期番茄采后抗氧化相關酶的影響

李 潔，溫昕曄，張 輝，高 晶，郭 芹，張玉麗，吳忠紅，吳 斌，*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊830091；3.新疆大學化學與化工學院，新疆烏魯木齊830046）

一氧化氮對綠熟和粉紅期番茄采后抗氧化相關酶的影響

李 潔1，溫昕曄1，張 輝1，高 晶3，郭 芹3，張玉麗2，吳忠紅2，吳 斌2，*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊830091；3.新疆大學化學與化工學院，新疆烏魯木齊830046）

以“申冠油”番茄果實為試材，采用不同濃度一氧化氮（20、40、60μL·L-1NO）在空氣條件下處理綠熟期和粉紅期的番茄果實3h，在16℃和相對濕度為85%的條件下貯藏20d。分析NO處理對番茄果實中過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化相關酶活性及丙二醛（MDA）和可溶性糖含量變化的影響。實驗結果表明：NO處理能促進綠熟期和粉紅期番茄中CAT、POD、SOD活性的增加和綠熟期番茄中APX酶活性的增加，降低了綠熟期番茄中MDA含量，延緩果實中可溶性糖的流失，且60μL·L-1NO處理效果較好。但NO處理對粉紅期番茄中APX活性和MDA含量無顯著影響，這可能與NO對綠熟期和粉紅期這兩種不同成熟度番茄中作用方式不一樣有關。

一氧化氮，番茄，采后，抗氧化相關酶

一氧化氮（NO）是一種具有水溶性和脂溶性的氣體小分子。自1987年生物體內源合成機制被發現及其生理特性被證實以來，NO就引起科學界的關注[1]。迄今為止，人們已經發現NO可控制許多植物的生理過程，如生長[2]、成熟[3]和抗病性[4]。NO可在果實內生成，隨著果實成熟度的增加而減少，未成熟果中NO含量比成熟果中高，NO和它的衍生物（N2O）可抑制乙烯合成來延緩組織衰老進程，提高果蔬貯藏過程中抵御逆境的能力，從而改善果蔬采后的貯藏品質。NO還可誘導草莓超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的增加，減少丙二醛（MDA）的含量[5]。

番茄（Lycopersicon esculenturn）是新疆地區優勢明顯的紅色產業[6]，由于日照時間長，晝夜溫差大等獨特的自然條件，番茄中可溶性固形物和番茄紅素含量較高。此外，番茄果實風味獨特、營養豐富，受到越來越多消費者的青睞。研究表明，NO處理對植物的成熟衰老有抑制作用[3]，這可能是NO的化學特性改變了乙烯合成及信號轉導途徑相關酶的活性或基因的表達。針對不同成熟度番茄果實中最各組分含量及作用機理不同，而且目前NO處理不同成熟度番茄的相關報道較少。因此，本實驗以新疆鮮食番茄為研究試材，分析NO對綠熟期和粉紅期番茄果實抗氧化酶活性的影響，篩選NO處理綠熟期和粉紅期番茄的適宜濃度，為闡明NO對不同成熟度番茄的作用方式不同的可能機理提供依據，并為后期工作的開展及應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料 番茄品種為“申冠油”，采自新疆烏魯木齊安寧渠番茄種植基地，采后立即運往冷庫預冷12h后進行處理；NO氣體（純度99.9%） 廣州世源氣體有限公司、甲硫氨酸、核黃素、硫代巴比妥酸、愈創木酚、氮藍四唑（Nitrotetrazolium Blue chloride，NBT）、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）等 均為分析純。

UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司；Himac CR-20B2大型臺式冷凍離心機 日本日立公司；IKA MS3 basic旋渦混合器 浙江納德科技有限公司；FW-80高速萬能粉碎機 北京永光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 處理與取樣方法

1.2.1.1 實驗處理 將預冷過的綠熟期（Mature green Stage，MG）和粉紅期（Pink Stage，PS）番茄，選取大小均一、無病蟲害、無機械損傷的果實去果蒂備用。隨后將番茄果實置于密封的氣調箱內，用濃度為99.9% NO氣體進行以下熏蒸處理：a.對照（CK）：在有氧條件下維持3h；b.NO處理：在有氧條件下，通入NO氣體，使NO濃度為20、40、60μL·L-1，熏蒸3h。處理時，根據密封的氣調箱內凈體積（箱內體積-樣品體積），樣品體積采用排水法計算，用微量氣相進樣針吸取NO氣體后注入密封的氣調箱內，且箱內安有風扇，能有效的將NO氣體混勻。處理完后裝入厚度為0.03mm的保鮮袋內并裝箱，置于16℃和相對濕度85%的條件下貯藏。每個處理重復三次，每次重復40個樣品。

1.2.1.2 取樣方法 處理好的番茄取第0d的樣品，在貯藏過程中根據表型觀察取樣，并進行生理指標測定。

1.3 生理指標測定

1.3.1 酶液的提取 準確稱取1.0g樣品，加4.0mL 0.05mol·L-1磷酸緩沖液（pH7.8，內含0.2mmol·L-1EDTA），浸提30min，12000r/min 4℃離心20min，上清液為待測液。

1.3.2 過氧化物酶（POD）活性的測定 參照文獻Kang等[7]的方法略有改進。取酶液0.2mL，依次加入0.2%愈創木酚1mL，0.1%H2O21.5mL，混勻后迅速比色，測OD470值在120s內的變化量，每分鐘變化0.01為一個酶活力單位（U），酶活性以U·g-1mf表示。

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 參照文獻Wang等[8]的方法。取酶液1.0mL，依次加入0.06mmol·L-1核黃素0.1mL，14.4mmol·L-1甲硫氨酸0.1mL，2.36mmol·L-1EDTA 0.1mL，2.25mmol·L-1NBT 0.1mL，以緩沖液代替酶液照光做最大光還原測定，日光燈下反應20min。反應結束后，用紫外可見分光光度計測定OD560吸光值，每分鐘變化0.01為一個酶活力單位（U），酶活性以U·g-1mf表示。

1.3.4 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 參照文獻Beers等[9]的方法略有改進。取酶液50μL，0.1mol·L-1H2O21.5mL，混勻后迅速比色，測OD240值在180s內的變化量，每分鐘變化0.01為一個酶活力單位（U），酶活性以U·g-1mf表示。

1.3.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定 參照Rahnama等[10]的方法。取酶液50μL，加入2.5mL 0.05mol·L-1磷酸緩沖液（內含0.1mmol·L-1EDTA，0.1mmol·L-1AsA和0.1mmol·L-1H2O2），混勻后迅速比色，測OD240值在180s內的變化量，每分鐘變化0.01為一個酶活力單位（U），酶活性以U·g-1mf表示。

1.3.6 丙二醛（MDA）含量測定 參照陳德碧等[11]的方法。取酶液1.0mL，轉入具塞試管中，再加入3mL 0.6%硫代巴比妥酸（溶于10%三氯乙酸），混勻后于100℃沸水中反應15min，冰浴冷卻后，測定450、532、600nm處的OD值，單位用μmol·g-1mf表示。

1.3.7 可溶性糖含量測定 采用蒽酮比色法，取提取液1mL置于試管中，加入蒽酮乙酸乙酯試劑0.5mL和5mL濃硫酸，搖勻，于沸水浴中保溫1min，冷卻后在630nm波長處比色。

1.4 數據統計與作圖

使用SPSS 13.0對數據進行分析，使用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NO處理對綠熟和粉紅期番茄果實POD活性的影響

POD是一類比較復雜的酶，它可與CAT共同清除衰老過程中產生的H2O2。由圖1可知，在綠熟期番茄貯藏過程中，POD活性總體呈下降趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理的綠熟期番茄果實POD活性均高于對照果（p＜0.05）。貯藏第11d后60μL·L-1NO處理果POD活性高于20、40μL·L-1NO處理樣品。結果表明：NO處理顯著提高了綠熟期番茄果實POD活性。

圖1 NO處理對綠熟期番茄POD活性的影響Fig.1 Effect of NO on the POD activity of tomato at mature green stage

由圖2可知，在貯藏過程中，粉紅期番茄果實中POD活性呈下降趨勢。貯藏前5d果實中POD活性急劇下降，后期呈緩慢下降趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理果POD活性變化趨勢與對照果一致，但均比對照果高，且第8d后60μL·L-1NO處理果POD活性高于20、40μL·L-1NO處理（p＜0.05），結果表明：在貯藏過程中NO處理顯著增加了粉紅期番茄果實POD的活性。

圖2 NO處理對粉紅期番茄POD活性的影響Fig.2 Effect of NO on the POD activity of tomato at pink stage

2.2 NO處理對綠熟和粉紅期番茄果實SOD活性的影響

圖3 NO處理對綠熟期番茄SOD活性的影響Fig.3 Effect of NO on the SOD activity of tomato at mature green stage

SOD可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成H2O2和在維持機體自由基產生和清除的動態平衡中起重要作用。由圖3可知，在綠熟期番茄貯藏過程中SOD活性總體呈上升趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理果SOD活性與對照果的變化趨勢相似，且NO處理果SOD活性均高于對照果（p＜0.05）。結果表明：NO處理促進了綠熟番茄中SOD活性的增加，提高果實清除超氧陰離子自由基的能力。

圖4 NO處理對粉紅期番茄SOD活性的影響Fig.4 Effect of NO on the SOD activity of tomato at pink stage

由圖4可知，在粉紅期番茄果實貯藏過程中，SOD活性總體呈上升趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理果SOD活性與對照果的變化趨勢相似，且60μL·L-1NO處理果SOD活性高于20、40μL·L-1NO處理果和對照果（p＜0.05），結果表明：60μL·L-1NO處理顯著提高了SOD的活性。

2.3 NO處理對綠熟和粉紅期番茄果實CAT活性的影響

圖5 NO處理對綠熟期番茄CAT活性的影響Fig.5 Effect of NO on the CAT activity of tomato at mature green stage

果實代謝過程中所產生的H2O2，可導致細胞進行破壞性的氧化作用，而CAT可有效清除高濃度H2O2。綠熟期番茄果實CAT活性在整個貯藏過程中呈下降趨勢（圖5），這可能是由于果實中H2O2濃度較低影響的。而60μL·L-1NO處理果CAT活性高于20、40μL·L-1NO處理果和對照果（p＜0.05），表明：NO處理可誘導番茄CAT活性的顯著增加，提高番茄果實清除H2O2的能力。

由圖6可知，在貯藏過程中，粉紅期番茄果實中CAT活性呈下降趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理果CAT活性變化趨勢與對照一致，且60μL·L-1NO處理果CAT活性高于20、40μL·L-1NO處理果和對照果（p＜0.05）。結果表明：60μL·L-1NO處理能增加CAT的活性。

2.4 NO處理對綠熟和粉紅期番茄果實APX活性的影響

植物葉綠體和胞質中，直接負責清除H2O2的關鍵酶就是APX，它對H2O2的親和力遠大于CAT[12]。由圖7可知，綠熟期番茄果實中20、40、60μL·L-1NO處理和對照果APX活性在整個貯藏期間總體呈上升趨勢，60μL·L-1NO處理果APX活性高于對照果及20、40μL·L-1NO處理果（p＜0.05）。結果表明：NO處理顯著促進了APX活性的增加，60μL·L-1NO處理效果較好。

圖8 NO處理對粉紅期番茄APX活性的影響Fig.8 Effect of NO on the APX activity of tomato at pink stage

粉紅期番茄果實中APX含量在整個貯藏期間總體呈下降趨勢（圖8），20、40、60μL·L-1NO處理中APX活性的變化趨勢和對照果相似。結果表明：NO處理對粉紅期番茄果實中APX影響不大，不能明顯促進APX活性的增加。

2.5 NO處理對綠熟和粉紅期番茄果實MDA含量的影響

由圖9所知，在綠熟期番茄果實的貯藏過程中，MDA的含量總體呈上升趨勢。20、40、60μL·L-1NO處理果的MDA含量變化趨勢與對照果相似，但MDA含量均低于對照果。40μL·L-1NO處理果MDA含量低于20、60μL·L-1NO處理果（p＜0.05）。結果表明：NO處理可以有效的抑制番茄果實中MDA含量的增加，且40μL·L-1NO處理效果較好，能顯著延緩果實的衰老。

圖9 NO處理對綠熟期番茄MDA含量的影響Fig.9 Effect of NO on the MDA content of tomato at mature green stage

圖10 NO處理對粉紅期番茄MDA含量的影響Fig.10 Effect of NO on the MDA content of tomato at pink stage

在粉紅期番茄果實的貯藏過程中，MDA的含量總體呈上升趨勢與綠熟期相似。20、40、60μL·L-1NO處理果的MDA的含量均低于對照果（圖10），且20μL·L-1NO處理果MDA的含量低于60、40μL·L-1NO處理果。結果表明：NO處理雖能減少粉紅期番茄果實中MDA含量的累積，但與綠熟期番茄相比，粉紅期番茄果實中MDA含量明顯高于綠熟期，NO處理對粉紅期MDA含量影響不大。

2.6 NO處理對綠熟和粉紅期番茄可溶性糖含量的影響

圖11 NO處理對綠熟期番茄可溶性糖含量的影響Fig.11 Effects of NO on soluble sugar content of tomato at mature green stage

由圖11可知，綠熟期番茄在整個貯藏過程中可溶性糖的含量總體呈先上升后下降趨勢。貯藏第0d番茄中可溶性糖的含量為64.74μmol·g-1，在第5d可溶性糖含量達到最大值。20、40、60μL·L-1NO處理果的可溶性糖含量變化趨勢與對照果相一致，且60μL·L-1NO處理果可溶性糖含量高于20、40μL·L-1NO處理果和對照果（p＜0.05）。結果表明：NO處理可以顯著減緩番茄果實中可溶性糖的流失，且60μL·L-1NO處理效果較好。

圖12 NO處理對粉紅期番茄可溶性糖含量的影響Fig.12 Effect of NO on soluble sugar content of tomato at pink stage

粉紅期番茄在貯藏過程中，可溶性糖含量總體呈先上升后下降趨勢（圖12）。20、40、60μL·L-1NO處理果的可溶性糖含量變化趨勢與對照果相似，貯藏第5d后，60μL·L-1NO處理果可溶性糖含量高于20、40μL·L-1NO處理果和對照果（p＜0.05）。結果表明：60μL/L NO處理可明顯減緩番茄果實中可溶性糖含量的流失。

3 討論

本實驗結果表明：NO處理促進了綠熟期和粉紅期番茄中POD和SOD活性的增加，從而增強了果實清除ROS能力，提高了番茄果實的抗病性，與席鈺芳和弓德強等[14-15]在桃和番荔枝中研究一致。Beligni等[16]報道了NO可促進果實CAT活性的增加，與我們的研究一致。有研究表明，NO通過影響CAT、SOD和POD的活性調節內源H2O2和的含量[17-18]，也可能是SOD 、 POD、CAT和APX都是含金屬離子的蛋白，可能是NO的靶酶，NO可與其結合形成硝酰化復合物而調節酶活性，間接地調控生物體內的ROS水平。綠熟期番茄中APX活性與粉紅期番茄不一樣，這可能是不同成熟度的番茄，NO的作用方式不一樣。也有報道表明，NO處理對草莓和桃中SOD活性無顯著影響[5，19]。

MDA是脂質過氧化的主要產物之一，H2O2和O2-·的累積激發了MDA的產生，促進了細胞膜脂過氧化，加速了果實的衰老[20]。本實驗研究表明，NO處理有效延緩了綠熟期番茄中MDA含量的增加，這可能是未成熟果實中內源NO含量較高，與外源NO共同作用減少自由基對膜脂的傷害。推測是NO處理提高了SOD、POD活性，從而在一定程度上清除了降低了自由基對果實膜脂的傷害，這與張少穎[21]和徐福樂[22]的研究一致。這也可能與NO誘導了谷胱甘肽（glutathione，GSH）、還原性抗壞血酸酶（Ascorbic acid，AsA）、這類非酶類清除劑活性的增加，從而防止等活性氧自由基的累積引起的MDA的大量產生以及膜脂過氧化導致的果實衰老。NO處理的粉紅期番茄中MDA的含量隨著貯藏時間的延長不斷上升，雖然粉紅期NO處理果MDA含量比對照果低，但與綠熟期番茄相比MDA含量較高。這些研究表明NO處理對MDA含量的不同可能與果實本身品種和成熟度有關。

4 結論

用60μL·L-1NO處理能顯著提高綠熟期和粉紅期番茄CAT、POD、SOD活性和綠熟期番茄中APX的活性，減少綠熟期番茄中MDA含量，延緩果實可溶性糖的流失和衰老。但NO處理粉紅期番茄果實中APX活性含量較低，MDA含量較大，推測可能是NO對綠熟期和粉紅期這兩種不同成熟度番茄中作用方式不一樣。

[1]MILLA A H，DAY D A.Nitric oxide inhibits the cytochrome oxidase but not the alternative oxidase of plant mitochondria[J]. FEBS Letters，1996，398（3）：155-158.

[2]?írová J，Sedlárˇová M，Piterková J，et al.The role of nitric oxide in the germination of plant seeds and pollen[J].Plant Science，2011，181（5）：560-572.

[3]MANJUNATHA G，LOKESH V，NEELWAME B.Nitric oxide in fruitripening：trendsand opportunities[J].Biotechnology Advances，2010，28（4）：489-499.

[4]ZHENG Y，SHEN L，YU M，et al.Nitric oxide synthase as a postharvest response in pathogen resistance of tomato fruit[J]. Postharvest Biology and Technology，2011，60（1）：38-46.

[5]朱樹華.一氧化氮對草莓和肥城桃果實成熟衰老的調控機理[D].泰安：山東農業大學，2006.

[6]韓澤群，姜波.加工番茄產量組合預測模型研究[J].中國農學通報，2013，29（3）：161-165.

[7]TIAN S P，LI B Q，XU Y.Effect of O2and CO2concentration on physiology and quality of litchi fruit in storage[J].Food Chemistry，2005，91（4）：659-663.

[8]WANG Y，TIAN S，XU Y.Effects of high oxygen concentration on pro-and anti-oxidant enzymes in peach fruits during postharvest periods[J].Food Chemistry，2005，91（1）：99-104.

[9]BEERS R F，SIZER I W.A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J]. Journal of Biological Chemistry，1952，195（1）：133-140.

[10]RAHNAMA H，EBRAHIMZADEH H.The effect of NaCl on antioxidant enzyme activities in potato seedlings[J].Biologia Plantarum，2005，49（1）：93-97.

[11]陳德碧.水楊酸對枇杷采后品質和衰老的影響[D].重慶：西南大學，2008.

[12]張維靜，陸海，杜希華.抗壞血酸過氧化物酶在植物抵抗氧化脅迫中的作用[J].山東師范大學學報，2008，23（4）：113-115.

[13]孫存普，張建中，段紹瑾.自由基生物學導論[M].北京：中國科學技術出版社，1999.

[14]席鈺芳，應鐵進，鄭永華.振動脅迫對桃果實衰老的影響[J].園藝學報，1997，26（4）：263-264.

[15]弓德強，馬蔚紅，王松標，等.低溫冷藏對芒果品質及膜脂過氧化的影響[J].中國農學通報，2008，24（3）：401-404.

[16]BELIGNI M V，FATH A，PAUL C B，et al.Nitric oxide acts as an antioxidant and delays programmed cell death in barley aleurone layers[J].Plant Physiology，2002，129（4）：1642-1650.

[17]CLARK D，DUMER J，NAVARRE D A，et al.Nitric oxide inhibition of tobacco catalase and ascorbate peroxidase[J]. Molecular Plant-microbe Interactions，2000，13（12）：1380-1384.

[18]劉建新，胡浩斌，王鑫.外源一氧化氮供體對鋪脅迫下黑麥草幼苗活性氧代謝、光合作用和葉黃索循環的影響[J].環境科學學報，2009，29（3）：626-633.

[19]張闊，秦文，李正國，等.草酸對桃貯藏期抗性相關酶活性的誘導[J].食品科學，2010，31（22）：492-495.

[20]曹麗軍，趙彩平，劉航空，等.不同耐貯性桃果實膜脂過氧化相關酶活性變化[J].西北農業學報，2013（1）：18.

[21]張少穎，任小林，饒景萍.NO處理對采后番茄活性氧代謝影響[J].園藝學報，2005，32（5）：818-822.

[22]徐福樂.外源一氧化氮處理對番茄采后生理的影響及保鮮效果研究[D].北京：中國農業科學院，2008.

Effect of nitric oxide on the antioxidant enzymes of tomato fruit at mature green and pink stage during storage

LI Jie1，WEN Xin-ye1，ZHANG Hui1，GAO Jing3，GUO Qin3，ZHANG Yu-li2，WU Zhong-hong2，WU Bin2，*
（1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Agro-products Storage and Processing，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；3.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

Effects of nitric oxide（NO）on the antioxidant enzymes of postharvest tomato fruit were investigated in this study.Tomato fruits harvested at mature green and pink stage were fumigated with 20，40，60μL·L-1NO，then stored at 16℃with 85%relative humidity（RH）for 20d.Changes in these levels of superoxide dismutase（SOD），peroxidases（POD），catalase（CAT）and ascorbate peroxidase（APX），respectively，were measured during storage.Results indicated that NO treatment induced the increase in the activities of SOD，POD，CAT activities of tomato fruit at mature green and pink stage.NO treatment induced the APX activity，reduced MDA content，and delayed the losing of soluble sugar of tomato fruits at mature green stage.The concentration of 60μL·L-1NO had the better effect on tomato fruits.However，there was no significant influence on the APX activity and MDA content of tomato fruits at pink stage.

nitric oxide；tomato；postharvest；antioxidant enzymes

TS255.3

A

1002-0306（2014）06-0329-06

2013－07－08 *通訊聯系人

李潔（1990-），女，碩士研究生，研究方向：果蔬貯藏與加工。

國家自然基金（31260407）；自治區科學基金項目（2013211A038）。