不同亞型人SMYD3啟動子轉錄活性比較

劉 磊，羅學剛，趙文文，穆 愛，辛中帥，張同存

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，

天津科技大學生物工程學院，天津300457；2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

不同亞型人SMYD3啟動子轉錄活性比較

劉 磊1，羅學剛1，趙文文1，穆 愛1，辛中帥2，張同存1

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，

天津科技大學生物工程學院，天津300457；2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

利用PCR方法克隆SMYD3兩個亞型的啟動子區域，并構建其熒光素酶報告質粒．轉染COS-7細胞后，利用熒光素酶報告分析技術，對二者啟動子的轉錄活性進行了檢測和比較．結果顯示：SMYD3亞型1啟動子的轉錄活性要顯著高于亞型2啟動子，生物信息學分析提示其原因可能與含有轉錄因子E2F-1結合位點的串聯重復序列有關．

SMYD3；啟動子；轉錄活性

SMYD3(SET and MYND domain containing 3)是近年來發現的一種具有組蛋白甲基化活性的組蛋白甲基轉移酶．研究[1–2]發現，SMYD3在肝癌、乳腺癌及直腸癌中呈現過表達狀態，提示其可能在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的作用．SMYD3可顯著增強腫瘤細胞增殖、粘附及遷移能力，并促使細胞發生惡性轉化，采用shRNA特異性干擾SMYD3基因后則可以明顯抑制乳腺癌、宮頸癌等癌細胞的增殖與遷移能力，并誘導其凋亡[3–7]．

SMYD3具有兩個亞型，分別由兩個不同的啟動子調控二者的轉錄過程．然而，對于SMYD3兩種不同亞型的轉錄調控機制及其不同啟動子轉錄活性間的差異，迄今尚未見報道．本文通過構建SMYD3兩個亞型啟動子熒光素酶報告質粒，通過報告分析方法檢測二者啟動子轉錄活性差異，并結合生物信息學分析，探討二者啟動子差異在SMYD3轉錄調節中的影響，為進一步研究SMYD3在腫瘤發生發展中的作用機制以及新型抗腫瘤藥物研發提供理論指導．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

pGL3-basic熒光素酶報告質粒、T4,DNA連接酶，美國Promega公司；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術有限公司；dNTP(濃度10mmol/L)、DM2000,plus DNA,Marker、DNA回收試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；氨芐青霉素、青鏈雙抗、胰酶、RNA酶、Tris飽和酚、高純度質粒小提試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，天津康源生物科技有限公司；D-MEM/F-12細胞培養基，美國Gibco公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國OXOID公司；三氯甲烷，天津市江天化工技術有限公司；SDS，美國Sigma公司；PCR引物，美國Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠，美國基因公司；熒光素酶報告基因檢測系統，美國應用生物系統公司；Turbofect脂質體轉染試劑盒，美國Thermo公司；限制性內切酶，美國Fermentas公司；多功能微孔板檢測儀，美國基因公司；PCR儀，德國Eppendorf公司．

1.2 菌株與細胞株

E.,coli DH5α菌株，本實驗室保藏；人乳腺癌細胞系MCF-7、非洲綠猴腎成纖維細胞系COS-7，購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)．

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

MCF-7及COS-7細胞用含有體積分數10%胎牛血清、體積分數1%青鏈雙抗的D-MEM/F-12培養基于37℃、CO2體積分數5%的恒溫培養箱中培養．

1.3.2 MCF-7細胞基因組的提取

用體積分數0.25%胰酶消化鋪滿10cm培養皿皿底的MCF-7細胞，并用冰冷的PBS緩沖液將細胞吹下，1,000r/min離心10min，收集細胞．用PBS緩沖液重懸并漂洗細胞沉淀．用5mL DNA抽提緩沖液重懸細胞，加入25μL蛋白酶K使其終質量濃度達到100,μg/mL并混勻，56℃水浴3h．加入與之等體積的Tris飽和酚抽提一次，12,000r/min離心10min收集水相，再用與水相等體積的氯仿抽提一次，12,000r/min離心10min收集水相于一個潔凈的EP管中，加入與水相等體積的異丙醇和適量的3mol/L NaCl溶液，使得NaCl終濃度為0.2mol/L，于－20℃靜置90min．室溫下12,000r/min離心5min，棄上清液．將基因組沉淀用體積分數75%乙醇溶液漂洗兩次，烘干后溶于適量TE緩沖液中．

1.3.3 人SMYD3兩個亞型啟動子區域熒光素酶報告質粒的構建

利用Mat Inspector對美國國立生物技術中心(NCBI)已經公布的人類SMYD3基因序列及UCSC數據庫公布的SMYD3基因CDS區5′-上游序列進行序列分析，選擇無轉錄因子結合位點區段設計兩端分別帶有MluⅠ和XhoⅠ的引物，SMYD3亞型1上游引物為5′-AGGACGCGTTGAGCCAATATCGTAC CAC-3′，下游引物為5′-CGACTCGAGGGTTGCGAA CTTTTCCAC-3′；SMYD3亞型2上游引物為5′-CGAA CGCGTGTTGCTTTTTGGTCTTAG-3′，下游引物為5′-CTACTCGAGCCCATCTCCCTGACTGCTAG-3′．將合成的引物稀釋至工作濃度，以人乳腺癌細胞系MCF-7基因組為模板，利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)在94℃變性45,s，58℃退火45,s和72℃延伸1.5min，循環30次的反應條件下分別擴增兩個SMYD3亞型啟動子片段，得到SMYD3亞型1轉錄起始位點上游839,bp至下游128,bp的啟動子片段及SMYD3亞型2轉錄起始位點上游808,bp至下游201,bp的啟動子片段．分別利用MluⅠ和XhoⅠ特異性切割PCR產物兩端及pGL3-basic載體多克隆位點，切割產物經瓊脂糖凝膠切膠回收后連接．連接產物轉化至E.,coli DH5α菌株感受態細胞中，挑取陽性克隆經菌落PCR驗證及雙酶切驗證將陽性克隆分別以GLP2(-)和RVP(+)為引物測序，測序結果經過與數據庫公布序列進行比對驗證是否將正確的目的啟動子片段連接至pGL3-basic載體上．

1.3.4 細胞轉染及熒光素酶報告分析

對數生長期的細胞，用體積分數0.25%胰酶消化并用適量D-MEM/F-12培養基吹懸至單細胞懸液并調整細胞濃度至5×105mL-1，每孔接種1mL細胞懸液．于37℃、CO2體積分數5%的恒溫培養箱培養12～16h．利用Turbofect Transfection Regent脂質體轉染試劑進行細胞轉染，1,μg質粒使用2μL脂質體，37℃孵育20min，加入孔板中．加好的孔板置于37℃、CO2體積分數5%的恒溫培養箱孵育6h，更換D-MEM/F-12完全培養基繼續培養24h后加入Luciferase Assay裂解液，利用熒光素酶報告基因檢測試劑盒及多功能微孔板檢測儀測定總蛋白質量濃度及熒光強度．根據式(1)核算各實驗組啟動子轉錄活性與對照組的倍數值，其水平高低與啟動子轉錄活性在一定范圍內呈線性關系．

式中：F為相對熒光活性(RLU)倍數；Is為樣品熒光強度平均值；ρs為樣品蛋白質量濃度平均值；Ic為Control組熒光強度平均值；ρc為Control組蛋白質量濃度平均值．

2 結果與分析

2.1 人SMYD3兩個亞型啟動子區域熒光素酶報告質粒的構建

為了獲得分析得到的SMYD3不同亞型啟動子片段，實驗中通過PCR反應，從MCF-7細胞基因組中擴增目的片段，其中亞型1啟動子由于GC含量較高(54.8%)，經優化后采用GC buffer可實現有效的擴增，結果如圖1、圖2所示．

圖1 人SMYD3轉錄亞型1啟動子熒光素酶報告質粒的構建Fig. 1 Construction of the luciferase reporter plasmid of human SMYD3 isoform promoter 1

圖2 人SMYD3轉錄亞型2啟動子熒光素酶報告質粒的構建Fig. 2 Construction of the luciferase reporter plasmid of human SMYD3 isoform promoter 2

圖(a)中除M泳道外，其余泳道位于1,000,bp附近的明亮條帶均為目的PCR產物．圖(b)中除M泳道外，其余泳道5,000,bp附近明亮條帶均為線性pGL3-basic質粒條帶，1,000,bp附近的DNA條帶均為目的片段條帶．所有陽性克隆均經測序及序列比對，證明與已公布序列完全匹配，表明SMYD3熒光素酶報告質粒構建成功．

2.2 細胞轉染

為了確保細胞轉染效率，本文用可表達綠色熒光蛋白的pEGFP-C3質粒轉染細胞并在藍色激發光下觀察正常表達綠色熒光蛋白的細胞數與總細胞數比對，結果如圖3所示．

圖3 細胞轉染效率檢測Fig. 3 Detection of the transfection efficiency

2.3 啟動子轉錄活性分析

分別將構建成功的SMYD3亞型1、亞型2啟動子熒光素酶報告基因質粒轉染至COS-7和MCF-7細胞中，24h后裂解細胞測定熒光素酶活性，結果如圖4所示．結果表明：SMYD3亞型1與亞型2的啟動子在腫瘤細胞中的轉錄活性均顯著高于各自在正常細胞中的轉錄活性，而且不論是正常細胞還是腫瘤細胞，SMYD3亞型1的轉錄活性均明顯強于亞型2的啟動子．表明SMYD3亞型1是細胞中的優勢轉錄形式，其異常表達很可能與乳腺癌的發生發展密切相關．

圖4 人SMYD3兩個亞型啟動子轉錄活性比較Fig. 4 Comparison of the transcriptional activities of human SMYD3 promoters

2.4 人SMYD3啟動子區域序列分析

根據對測序結果的分析可發現：從MCF-7乳腺癌細胞中克隆獲得的人SMYD3亞型1啟動子中含有2個拷貝的轉錄因子E2F-1結合位點(5′-CCGCC-3′)，如圖5(a)所示．進一步對不同物種SMYD3啟動子區域進行比對，發現該位點在人、野駱駝、長尾龍貓、獼猴等不同物種中普遍存在，且序列高度保守，如圖5(b)所示．表明該元件在物種進化的過程中具有較高的保守性．而對人SMYD3亞型2啟動子的分析，則沒有發現該結合位點，結合前人關于E2F-1結合位點串聯重復多態性與腫瘤發生風險關系的報道[8]，認為該結合位點的存在可能是造成SMYD3亞型1啟動子轉錄活性強于亞型2的重要原因之一．

圖5 SMYD3啟動子區域分析及比對Fig. 5 Analysis and comparison of SMYD3 promotor regions

3 討 論

謝景航等[9]也曾對SMYD3亞型2轉錄起始位點上游－1,527～+123,bp序列進行過分析，但他們的結果顯示，各截短片段轉錄活性與空載質粒并無顯著差異．表明該亞型SMYD3可能不是其最主要的轉錄形式．本研究也發現SMYD3亞型2啟動子的轉錄活性要顯著低于亞型1啟動子．通過對SMYD3兩個轉錄亞型啟動子區域進行分析，發現亞型1啟動子中含有2個拷貝的轉錄因子E2F-1結合位點(5′-CCGCC-3′)，而在亞型2啟動子中則沒有，推測這可能是亞型1轉錄活性顯著增高的重要原因之一．研究已顯示：SMYD3 5′-調控區域的E2F-1結合位點可變數目串連重復多態性(variable number of tandem repeats polymorphism，VNTR)與腫瘤的發生過程有著密切的關系，很可能是造成癌變幾率個體差異的重要原因之一．日本東京大學Tsuge等[8]發現：在SMYD3基因5′-調控區域存在E2F結合位點的串連重復序列，其拷貝數與結腸癌、肝癌以及乳腺癌的高風險性間有著緊密的聯系．E2F-1屬于E2F核轉錄因子家族成員，而E2F核轉錄因子家族與視網膜母細胞瘤抑癌基因RB構成的RB/E2F信號通路在細胞周期的調控及癌癥發生過程中有著重要的作用[10]．因此，Tsuge等認為，SMYD3很可能是RB-E2F信號轉導通路中的一個下游靶點，5′-CCGCC-3′序列拷貝數增多將可能增強SMYD3與E2F-1的親和力，從而導致結腸癌、肝細胞癌和乳腺癌風險性增加．此外，德國癌癥研究中心的Frank等[11]、以及香港大學Wang等[12]的研究則與Tsuge等的有所不同，其原因很可能與患者人群的差異有關．

此外，Hamamoto等[1]通過基因芯片分析發現：SMYD3可上調細胞周期依賴激酶CDK2的表達．CDK2對于細胞周期G1/S期轉換以及S期的進程具有十分重要的作用，在G1期末，CDK2將與細胞周期蛋白E結合，磷酸化RB蛋白，使其釋放E2F家族轉錄因子，從而促使DNA合成得以進行，這一過程對細胞周期G1/S轉換起著至關重要的作用．在進入S期后，CDK2又將與細胞周期蛋白A結合，調控S期的進程[13–14]．結合本文的研究，認為SMYD3亞型1可能是細胞中的主要表達形式，其啟動子區域E2F-1結合位點的串聯重復拷貝會增強E2F-1與其結合，從而增強SMYD3亞型1的轉錄和表達．而SMYD3高表達后又會造成CDK2表達上調，CDK2進而促發RB的高度磷酸化，使E2F-1得以釋放，E2F-1又可以再次與SMYD3 5′-調控區域結合引發后者的轉錄和表達．如此的正反饋循環將造成細胞周期過度活躍，細胞始終處于旺盛的增殖狀態中，從而促發及推動了癌癥的發展．我們將在今后的研究中進一步證實這一推論．

［1］ Hamamoto R，Furukawa Y，Morita M，et al. SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cells[J]. Nature Cell Biology，2004，6：731–740.

［2］ Hamamoto R，Silva F P，Tsuge M，et al. Enhanced SMYD3 expression is essential for the growth of breast cancer cells [J]. Cancer Science，2006，97(2)：113–118.

［3］ Wang S Z，Luo X G，Shen J，et al. Knockdown of SMYD3 by RNA interference inhibits cervical carcinoma cell growth and invasion in vitro[J]. BMB Reports， 2008，41(4)：294–299.

［4］ Luo X G，Ding Y，Zhou Q F，et al. SET and MYND domain-containing protein 3 decreases sensitivity to dexamethasone and stimulates cell adhesion and migration in NIH3T3 cells[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2007，103(5)：444–450.

［5］ 羅學剛，林超，陸云華，等. SMYD3與細胞增殖相關性及其對細胞周期的影響[J]. 中國藥科大學學報，2007，38(3)：277–282.

［6］ Luo X G，Xi T，Guo S，et al. Effects of SMYD3 overexpression on transformation，serum dependence，and apoptosis sensitivity in NIH3T3 cells[J]. IUBMB Life，2009，61(6)：679–684.

［7］ 王淑珍，羅學剛，丁艷，等. 可誘導的shRNAs表達系統對HeLa細胞SMYD3基因表達的抑制[J]. 中國藥科大學學報，2007，38(4)：369–374.

［8］ Tsuge M，Hamamoto R，Silva F P，et al. A variable number of tandem repeats polymorphism in an E2F-1 binding element in the 5′ flanking region of SMYD3 is a risk factor for human cancers[J]. Nature Genetics，37(10)：1104–1107.

［9］ 謝景航，鄒佳寧，唐聰，等. 人SMYD3基因啟動子熒光素酶報告載體的構建與分析[J]. 中國藥科大學學報，2009，40(2)：173–177.

［10］ Harbour J W，Dean D C. The Rb/E2F pathway：Expanding roles and emerging paradigms[J]. Genes & Development，2000，14(19)：2393–2409.

［11］ Frank B，Hemminki K，Wappenschmidt B，et al. Variable number of tandem repeats polymorphism in the SMYD3 promoter region and the risk of familial breast cancer[J]. International Journal of Cancer，2006，118(11)：2917–2918.

［12］ Wang X Q，Miao X，Cai Q，et al. SMYD3 tandem repeats polymorphism is not associated with the occurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma in a Chinese population[J]. Experimental Oncology，2007，29(1)：71–73.

［13］ Israels E D，Israels LG. The cell cycle[J]. Stem Cells，2001，19(1)：88–91.

［14］ Lundberg A S，Weinberg R A. Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes[J]. Molecular and Cellular Biology，1998，18(2)：753–761.

責任編輯：周建軍

Comparison of Transcriptional Activities of Different Human SMYD3 Isoforms

LIU Lei1，LUO Xuegang1，ZHAO Wenwen1，MU Ai1，XIN Zhongshuai2，ZHANG Tongcun1

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China)

In this study，promoters of two isoforms were cloned with PCR method and then their luciferase reporter plasmids were constructed. Using the method of Luciferase Assay，the transcriptional activities of these two promotors of SMYD3 were detected in COS-7 cells. Results showed that the transcriptional activity of the promoter of isoform 1 is higher that that of the promoter of isoform 2. Bioinformatics analyses indicated that the significant difference in the transcriptional activity between these two promoters might be due to the tandem repeats of E2F-1 binding sites located in the promoter of isoform 1.

SMYD3；promotor；transcriptional activity

Q786

A

1672-6510(2014)04-0006-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.002

2013–12–05；

2014–03–11

國家自然科學基金資助項目(31000343，31300642，31071126)

劉 磊（1988—），男，天津人，碩士研究生；通信作者：羅學剛，副教授，luoxuegang@tust.edu.cn.