赤紅球菌CGMCC3090生物轉化肉桂腈合成肉桂酰胺的工藝

翟 瑩，申雁冰，湯 睿，鄭 宇，王 敏

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

赤紅球菌CGMCC3090生物轉化肉桂腈合成肉桂酰胺的工藝

翟 瑩，申雁冰，湯 睿，鄭 宇，王 敏

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

針對目前肉桂酰胺工業生產采用的肉桂酸和二氯亞砜、濃氨水兩步化學反應工藝存在安全性較低、產物分離純化困難等問題，建立并優化了赤紅球菌CGMCC3090催化肉桂腈生成肉桂酰胺的轉化工藝．研究表明：底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，赤紅球菌菌體質量濃度為2.6g/L，在30℃、pH 7.5條件下，轉化5h后轉化率可達100%，具有產物純度高、無副產物肉桂酸生成的優勢，為赤紅球菌CGMCC3090生物轉化合成肉桂酰胺的工藝放大和生產性應用奠定了良好基礎．

赤紅球菌；生物轉化；肉桂酰胺；腈水合酶

腈水合酶是許多微生物催化腈化合物代謝的關鍵酶，具有化學、區域、立體選擇性，寬泛的底物特異性，能夠降解有毒腈類物質或者代替化學方法生產酰胺藥物，并且已成功引入到化學工業中生產丙烯酰胺、煙酰胺和5–氰基戊酰胺等[1–10]．肉桂酰胺是一種重要的有機合成中間體，廣泛應用于醫藥合成及精細化工等領域，可作為害蟲的趨避劑，且對線蟲也有一定的抑制作用，可抑制腫瘤的生長和轉移，是一種具有開發前景的抗腫瘤化合物．肉桂酰胺的衍生物可作為腦神經保護劑、受體拮抗劑等[11]．目前，工業上生產肉桂酰胺主要通過肉桂酸和二氯亞砜加熱生成肉桂酰氯，再通過濃氨水和肉桂酰氯反應的二步反應合成．該化學工藝存在安全性較低、對設備要求高、產物分離純化困難、環境污染嚴重等問題[12]．

用微生物法代替化學法生產肉桂酰胺具有重要意義，許多研究者致力于生物法生產肉桂酰胺的研究．1970年，Bezanson等[13]利用Streptomyces vorticillatus ATCC13495所產苯丙氨酸脫氨酶生產肉桂酰胺，并采用14C標記L–苯丙氨酸上的羧基碳進行其代謝途徑的研究，發現在鏈霉菌ATCC13495菌株的代謝途徑中，L–苯丙氨酸部分生成肉桂酸，然后得到肉桂酰胺；L–苯丙氨酸為0.5g/L時，脫氨酶酶活性為210mU/g(DCW)．1986年，Prevatt等[14]報道了9株紅球菌可以將肉桂腈轉化為肉桂酰胺，但是有副產物肉桂酸的生成，增加了產物后續分離純化的困難．2004年，Brunati等[15]研究發現22株不同的放線菌可以將肉桂酸轉化為肉桂酰胺，其中Streptomyces halstedii對肉桂酸的轉化能力最強，底物質量濃度為2g/L，轉化率達95%，其余菌株對0.3g/L肉桂酸的轉化率為20%～80%，產物得率較低，制約了生物途徑制備肉桂酰胺的產業化進程．因此，迫切需要找到一種反應條件溫和，生產條件及分離純化過程簡單的微生物方法代替化學生產方法．

本研究利用赤紅球菌(Rhodococcus ruber) CGMCC3090對肉桂腈進行生物轉化生成肉桂酰胺．該菌株對肉桂腈具有較高的轉化能力，產物純度高，后續產品分離純化簡單．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

赤紅球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC3090，本研究室自土壤中篩選獲得，現保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心．

1.1.2 培養基

斜面培養基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，pH 7.2．

種子培養基(g/L)：甘油10，蛋白胨5，麥芽浸粉3，酵母粉3，pH 7.0．

發酵培養基(g/L)：葡萄糖15，酵母粉5，尿素7，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，谷氨酸鈉 1，CoCl2·6H2O 2.38×10-2，pH 7.0．

1.1.3 主要試劑和儀器

肉桂腈、肉桂酰胺、肉桂酸，天津希恩思生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉，美國BD公司；1260型高效液相色譜儀(HPLC)，Agilent Technologies公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 赤紅球菌CGMCC3090菌體培養

斜面培養：30℃恒溫培養4～5d．

種子培養：挑取經斜面活化的赤紅球菌CGMCC3090菌種1環，接種于裝有30mL種子培養基的250mL三角瓶中，180r/min、30℃培養28h．

發酵培養：按3%的接種量將種子培養液接種于裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，180r/min、28℃培養48h．

1.2.2 赤紅球菌靜息細胞制備與肉桂腈轉化反應

5,000r/min離心收集發酵培養的菌體，用KH2PO4–NaOH緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)洗滌3次，制備赤紅球菌靜息細胞，將其懸浮于一定體積的緩沖液中，使A600＝0.7±0.02(稀釋50倍)．將終濃度為0.5mol/L的底物肉桂腈和9mL KH2PO4–NaOH緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)加入100mL的三角瓶中，30,W超聲5min使底物分散均勻，30℃搖床保溫20min，加入終質量濃度為0.7g/L的赤紅球菌菌懸液，30℃轉化(轉化實驗設定3個平行樣，下同)．按轉化時間取適量轉化液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，取適量乙酸乙酯萃取液，揮發干后用甲醇重新溶解，經0.22μm微孔膜過濾后用于TLC、HPLC分析．

1.3 分析方法

1.3.1 轉化樣品TLC檢測

將乙酸乙酯萃取液點樣于薄層層析硅膠板，以肉桂腈、肉桂酰胺標準品作對照，展開體系為V(氯仿)∶V(甲醇)＝9∶1，在紫外燈(254nm)下觀察赤紅球菌CGMCC3090能否轉化肉桂腈，初步判斷其轉化情況.

1.3.2 轉化率測定

采用高效液相色譜(HPLC)檢測轉化率．色譜柱為Phenomenex Luna C18(5μm，250mm×4.6mm)，流動相V(甲醇)∶V(水)＝8∶2，流量0.6mL/min，進樣量10μL，柱溫30℃，檢測波長254nm．按式(1)計算摩爾轉化率．

式中：c0為轉化起始底物濃度，mol/L；c為轉化終止時底物濃度，mol/L．

1.4 肉桂腈轉化工藝的建立

1.4.1 轉化溫度的選擇

肉桂腈濃度為0.5mol/L，赤紅球菌菌體質量濃度為0.7g/L，以50mmol/L的KH2PO4–NaOH緩沖液(pH,7.0)為反應介質，分別考察20、25、30、35、40℃下反應4h的轉化率．

1.4.2 轉化pH的選擇

反應溫度為30℃，反應時間4h，分別考察pH在5～9區間變化時對反應的影響．

1.4.3 底物濃度對轉化反應的影響

赤紅球菌菌體質量濃度為2.6g/L，反應溫度為30℃，pH為7.5，考察肉桂腈濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mol/L對反應的影響．

1.4.4 菌體質量濃度對轉化反應的影響

底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，反應溫度為30℃，pH為7.5，分別加入1.3、2.0、2.3、2.6、3.0、3.3、4.0g/L的菌體，測定其對反應的影響．

2 結果與分析

2.1 肉桂腈轉化產物分析

轉化液樣品TLC檢測結果見圖1，底物肉桂腈Rfs和產物肉桂酰胺Rfp分別為0.8和0.3，說明底物和轉化產物的分離效果較好．轉化液在薄層板上出現目標產物肉桂酰胺斑點，表明赤紅球菌CGMCC3090可以轉化肉桂腈生成目標產物，而且轉化率較高(未見殘留的底物斑點)．

圖1 肉桂腈轉化液的TLC譜圖Fig. 1 TLC spectrum of cinnamonitrile biotransformation

進一步采用HPLC分析方法分析其轉化情況，圖2是轉化4h時的轉化反應液的HPLC譜圖．

圖2 肉桂腈轉化液的HPLC譜圖Fig. 2 HPLC spectrum of cinnamonitrile transformation

由圖2可以看出，轉化產物為肉桂酰胺(保留時間6.1min)，底物肉桂腈(保留時間8.4min)基本被轉化完全，轉化率94.9%，沒有副產物肉桂酸(保留時間3.6min)的生成．

2.2 肉桂腈轉化工藝的確定

2.2.1 轉化溫度的選擇

溫度影響菌體細胞所產腈水合酶的活性、穩定性及選擇性，進而影響轉化反應的速率．已發現的腈水合酶的適宜溫度在10～45℃．溫度對赤紅球菌CGMCC3090轉化肉桂腈的影響如圖3所示．由圖3可知：溫度為30℃時肉桂酰胺轉化率達到最大值，為94.9%；溫度為20℃和40℃時，轉化率仍保持在80%以上，說明赤紅球菌CGMCC3090所產腈水合酶的適宜溫度范圍較寬．這與來源于Rhodococcus rhodochrous IFO15564[16]的腈水合酶(最適反應溫度為30～40℃)特性一致．

圖3 溫度對轉化反應的影響Fig. 3 Effect of temperature on transformation

2.2.2 轉化pH的選擇

pH影響微生物細胞酶分子的構象，從而影響轉化反應的速率．Kashiwagi等[16]報道Rhodococcusrhodochrous IFO15564所產腈水合酶的最適pH在7.0～8.5范圍內．從圖4所示的pH對赤紅球菌CGMCC3090轉化肉桂腈的影響發現：其pH為7.5時肉桂酰胺的轉化率達到最大值，為97.2%；在酸性條件下，腈水合酶轉化能力較低，而偏弱堿性時，即pH 7～8時其轉化效率較高．

圖4 pH對轉化反應的影響Fig. 4 Effect of pH on transformation

2.2.3 底物濃度對轉化反應的影響

Prevatt等[14]利用Rhodococcus所產腈水合酶將肉桂腈水解生成肉桂酰胺，底物濃度為5mmol/L，轉化23h后，肉桂酰胺的產率僅為40%，副產物肉桂酸的產率為57%，帶來目標產物的分離純化困難．赤紅球菌CGMCC3090能夠較好地催化肉桂腈，肉桂腈底物濃度對轉化過程的影響如圖5所示．由圖5可以看出：底物濃度為3.5mol/L時轉化速率較慢；當初始肉桂腈濃度較低時(≤1.5mol/L)，轉化非常迅速，轉化5h，底物轉化率達100%．可見，赤紅球菌CGMCC3090靜息細胞對底物肉桂腈的耐受性較高，易于實現高濃度的產物合成．

圖5 底物濃度對轉化反應的影響Fig. 5 Effect of initial substrate concentration on trans formation

2.2.4 菌體質量濃度對轉化反應的影響

初始肉桂腈底物濃度為1.5mol/L，不同菌體質量濃度對肉桂酰胺轉化生產的影響見表1，轉化速率隨著菌體質量濃度的增加而提高．當菌體質量濃度為2.6g/L時，反應5h時，肉桂酰胺轉化率為100%，無副產物肉桂酸產生．

表1 菌體質量濃度對轉化反應的影響Tab. 1 Effect of cell concentrations on transformation

圖6為赤紅球菌CGMCC3090靜息細胞生物轉化肉桂腈生成肉桂酰胺的過程曲線．反應5h時，1.5mol/L肉桂腈轉化率達到100%，進一步延長時間至8h，轉化產物保持穩定，未發生進一步的轉化衍生反應，也未發現有腈水合酶轉化反應常伴隨出現的羧酸的生成．產物肉桂酰胺為白色固體，微溶于水，隨著反應的不斷進行，高濃度的轉化產物以固態形式從反應液中析出，底物肉桂腈為淺黃色液體，不溶于水，表現出多相反應特征．

圖6 赤紅球菌CGMCC3090轉化肉桂腈反應過程曲線Fig. 6Course of cinnamonitrile transformation by R. ruber CGMCC3090

3 結 論

赤紅球菌CGMCC3090可以轉化肉桂腈生成肉桂酰胺．肉桂酰胺的最適轉化生產條件：轉化溫度30℃、初始轉化pH 7.5、赤紅球菌菌體質量濃度為2.6g/L、底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，轉化5h后轉化率達100%且無副產物生成．

［1］ Prasad S，Bhalla T C. Nitrile hydratases(NHases)：at theinterface of academia and industry[J]. Biotechnology Advances，2010，28(6)：725–741.

［2］ Wang M X. Enantioselective biotransformations of nitriles in organic synthesis[J]. Topics in Catalysis，2005，35(1/2)：117–130.

［3］ Velankar H，Clarke K G，du Preez R，et al. Developments in nitrile and amide biotransformation processes[J]. Trends in Biotechnology，2010，28(11)：561–569.

［4］ Mauger J，Nagasawa T，Yamada H. Synthesis of various aromatic amide derivatives using nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous J1[J]. Tetrahedron，1989，45(5)：1347–1354.

［5］ Black G W，Gregson T，Mcpake C B，et al. Biotransformation of nitriles using the solvent-tolerant nitrile hydratase from Rhodopseudomonas palustris CGA009 [J]. Tetrahedron Letters，2010，51(13)：1639–1641.

［6］ Kinfe H H，Chhiba V，Frederick J，et al. Enantioselective hydrolysis of β-hydroxy nitriles using the whole cell biocatalyst Rhodococcus rhodochrous ATCC BAA-870 [J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，59(4)：231–236.

［7］ Feng Y S，Chen P C，Wen F S，et al. Nitrile hydratase from Mesorhizobium sp. F28 and its potential for nitrile biotransformation[J]. Process Biochemistry，2008，43(12)：1391–1397.

［8］ Watanabe I，Satoh Y，Enomoto K. Screening，isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrile-hydrating activity[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1987，51(12)：3193–3199.

［9］ Nagasawa T，Mathew C D，Mauger J，et al. Nitrile hydratase-catalyzed production of nicotinamide from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1988，54(7)：1766–1769.

［10］ Hann E C，Eisenberg A，Fager S K，et al. 5-Cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，1999，7(10)：2239–2245.

［11］ 徐長亮，王菊仙，白曉光，等. 肉桂酰胺類化合物抗癌活性研究進展[J]. 中國醫藥生物技術，2013，8(1)：46–52.

［12］ 徐曉勇，錢旭紅，滕青衫，等. 生物途徑制備肉桂酰胺的方法：中國，201110041278. X[P]. 2011–02–18.

［13］ Bezanson G S，Desaty D，Emes A V，et al. Biosynthesis of cinnamamide and detection of phenylalanine ammonialyase in Streptomyces verticillatus[J]. Canadian Journal of Microbiology，1970，16(3)：147–151.

［14］ Prevatt W D，Akin C，Evans A J. Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids：US，4629700[P]. 1986–12–16.

［15］ Brunati M，Marinelli F，Bertolini C，et al. Biotransformations of cinnamic and ferulic acid with Actinomycetes[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，34(1)：3–9.

［16］ Kashiwagi M，Fuhshuku K I，Sugai T. Control of the nitrile-hydrolyzing enzyme activity in Rhodococcus rhodochrous IFO 15564：Preferential action of nitrile hydratase and amidase depending on the reaction condition factors and its application to the one-pot preparation of amides from aldehydes[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2004，29(1)：249–258.

責任編輯：常濤

Biotransformation of Cinnamonitrile into Cinnamamide with Rhodococcus ruber CGMCC3090

ZHAI Ying，SHEN Yanbing，TANG Rui，ZHENG Yu，WANG Min

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

At present，the method of cinnamamide production consists of two steps by using cinnamic acid，thionyl chloride and strong ammonia water. This chemical process has less security，product separation and purification are difficult and there are some other problems. To solve these problems，the process of biotransformation of cinnamonitrile into cinnamamide using Rhodococcus ruber CGMCC3090,was established. It was found that the conversion after 5h can reach 100% when the cinnamonitrile was 1.5mol/L，the cell concentration was 2.6g/L，the temperature 30℃ and pH 7.5. This process has the advantage of high product purity without formation of cinnamic acid. It has laid a good foundation for the scale-up process and practical production of cinnamamide biosynthesis with R. ruber CGMCC3090.

Rhodococcus；biotransformation；cinnamamide；nitrile hydratase

TQ920.1

A

1672-6510(2014)04-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.003

2014–01–09；

2014–02–27

國家自然科學基金資助項目(21276196)

翟 瑩（1986—），女，山東菏澤人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.