響應面試驗優化番木瓜籽中硫代葡萄糖苷酶解工藝

李文釗，杜依登，朱華平*，史宗義，時瀛洲，阮美娟

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

響應面試驗優化番木瓜籽中硫代葡萄糖苷酶解工藝

李文釗，杜依登，朱華平*，史宗義，時瀛洲，阮美娟

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計響應面分析對番木瓜籽中硫代葡萄糖苷（硫苷）的酶解條件進行優化。通過氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀鑒定酶解產物中的異硫氰酸酯種類。結果表明：酶解緩沖液pH值、酶解時間對異硫氰酸酯得率有顯著影響，酶解溫度影響不顯著；得到的最優酶解條件為酶解緩沖液pH 4.8、酶解時間40 min、酶解溫度27 ℃，在此條件下異硫氰酸酯得率為13.5‰；GC-MS結果表明，番木瓜籽硫苷酶酶解產物中只含有異硫氰酸芐酯一種異硫氰酸酯。

番木瓜籽；硫代葡萄糖苷；酶解；異硫氰酸酯

番木瓜籽是番木瓜加工過程中的廢棄物，一直以來沒有得到合理的開發利用[1-2]，研究發現，番木瓜籽中含有一定量的硫代葡萄糖苷[3]（簡稱硫苷），硫苷是一種常見于十字花科的次生代謝產物，目前未見報道其有直接的生理功能[4]，但當植物受到損傷時，硫苷與內源硫苷酶接觸，在不同的條件下降解成一系列的具有生物活性的代 謝產物[5-6]，其中以異硫氰酸酯類最受關注。異硫氰酸酯類物質能賦予食物特殊的風味[7]，同時，研究表明異硫氰酸酯類物質具有較強的防腐抗菌[8-9]和降低某些癌癥發生[10]的作用。目前，已查到相關番木瓜成熟過程中籽中硫苷和異硫氰酸酯類含量的分析報道[11-12]，但暫未見有關硫苷轉化為異硫氰酸酯類條件優化的研究報告。本研究優化異硫氰酸酯類生成條件，選擇性的引導番木瓜籽中硫苷降解生成異硫氰酸酯類，為研究異硫氰酸酯類的生物功能活性提供原料來源，為番木瓜籽的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜籽 海南思坦德生物科技有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市化學試劑三廠；氨水、二氯甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、抗壞血酸（均為分析純） 天津市化學試劑一廠；正己烷、無水硫酸鈉（均為分析純） 天津市北方天醫化學試劑廠；異硫

氰酸芐酯（純度98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；752E紫外可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；AB204-N電子分析天平、DL22 F&D全自動電位滴定儀 梅特勒-托利多儀器有限公司；HS-4磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術有限公司；HHS11-2B電熱恒溫水浴鍋 上海醫療器械五廠；XW-80A漩渦混合器江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；SHZ-D循環水式真空泵 河南省予華儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；4000MS氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國瓦里安技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫苷酶解條件的單因素試驗

分別以原料粒徑、料液比、酶解緩沖液pH值、酶解溫度、酶解時間為自變量，以異硫氰酸酯得率為考察指標，研究各因素對異硫氰酸酯得率的影響。原料粒徑選取90～120、120～150、150～180、180～250、250～380 μm五個水平；料液比選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）五個水平；酶解液pH值選取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5七個水平；酶解溫度選取10、20、30、40、50 ℃五個水平；酶解時間選取0、20、40、60、80 min五個水平。

1.3.2 硫苷酶解條件的響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取影響內源硫苷酶活性的主要因素，以異硫氰酸酯得率為考察指標，進行Box-Behnken試驗設計優化酶解條件。

1.3.3 異硫氰酸酯含量的測定

在NY/T 1596—2008《油菜餅粕中異硫氰酸酯的測定：硫脲比色法》[13]的基礎上進行改進，利用內源酶進行酶解代替在樣品前處理中加芥子酶。

1.3.4 異硫氰酸酯提取物制備

木瓜籽粉碎、過篩，按照優化的條件酶解，加二氯甲烷混合均勻，在室溫條件下振蕩0.5 h，4 000 r/min轉速下離心5 min，取下層二氯甲烷相至圓底燒瓶中，接旋蒸儀蒸發去除二氯甲烷，收集殘留物，加過量的無水硫酸鈉，冷藏待GC-MS分析[14-15]。

1.3.5 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析

色譜條件[16]：D B-5石英毛細管柱（3 0 m× 0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持2 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.4 mL/min；進樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，進樣量1 μL。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度200 ℃；離子源溫度200 ℃；質量掃描范圍m/z 40～600。

1.4 數據處理

單因素試驗中每個因素的各個水平和響應面試驗設計中的每個試驗組合都重復3 次，數據結果采用3 次重復試驗的平均值表示，數據使用Microsoft Office Excel 2007進行統計，采用Matlab進行方差分析及多重比較，使用OriginPro 9.0繪制圖表，響應面設計及數據分析使用Design-Expert 8.05b。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 原料粒徑對異硫氰酸酯得率的影響

經方差分析得不同原料粒徑對異硫氰酸酯得率的影響極顯著（P＜0.01）；從圖1可以看出，隨著原料粒徑的增大，異硫氰酸酯得率逐漸減小；從原理上講，粒徑越小，酶和底物的接觸越充分，得率越高，但是由于粒徑越小，所需要的粉碎時間越長，不僅耗費了大量能源，也會產生大量熱量，由于異硫氰酸酯易揮發，受熱后會有一定的損失，因此，綜合考慮本實驗選擇原料粒徑為小于150 μm。

圖1 原料粒徑對異硫氰酸酯得率的影響Fig.1 Effect of material particle size on the yield of isothiocyanates

2.1.2 料液比對異硫氰酸酯得率的影響

經方差分析得不同料液比對異硫氰酸酯得率的影響顯著（P＜0.05），經多重比較得料液比（g/mL）為1∶5和1∶20時得率有顯著差異；從圖2可以看出，在料液比為1∶20時異硫氰酸酯得率最高。

圖2 料液比對異硫氰酸酯得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of isothiocyanates

2.1.3 酶解緩沖液pH值對異硫氰酸酯得率的影響

經方差分析得不同酶解緩沖液pH值對異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；由圖3可見，在pH值小于3.5時，得率隨著pH值升高而增大；在pH值大于3.5時，得率隨著pH值升高而減?。辉趐H值在3.5～4.0時，異硫氰酸酯得率最高。據文獻[17-18]報道在pH值不同時，硫苷的降解產物也不相同，其主要的降解產物有異硫氰酸酯、腈類、硫氰酸酯、惡唑烷酮等，本試驗結果說明，在pH值在3.5～4.0時，番木瓜籽中的硫苷更偏向于轉化為異硫氰酸酯。

圖3 酶解緩沖液pH值對異硫氰酸酯得率的影響Fig.3 Effect of buffer pH on the yield of isothiocyanate

2.1.4 酶解溫度對異硫氰酸酯得率的影響

經方差分析得不同酶解溫度對異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；從圖4可知，番木瓜籽中硫苷酶在20～30 ℃時活性較高?，F有文獻對的不同來源硫苷酶的最適溫度在25～80 ℃均有報道[19-20]，說明硫苷酶對溫度比較敏感，針對不同來源的硫苷酶要針對性的研究。

圖4 酶解溫度對異硫氰酸酯得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the yield of isothiocyanate

2.1.5 酶解時間對異硫氰酸酯得率的影響

圖5 酶解時間對異硫氰酸酯得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of isothiocyanate

經方差分析得不同酶解時間對異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；由圖5可以看出，在酶解開始20 min內，隨著酶解時間延長，異硫氰酸酯得率迅速增加，說明酶解反應初期反應迅速；當酶解時間為20～40 min時，異硫氰酸酯得率達最高點；由于異硫氰酸酯易揮發，隨酶解進程到40 min以后，隨著酶解時間延長，異硫氰酸酯得率不但沒有增加反而呈下降趨勢。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

以單因素試驗結果為基礎，根據Box-Behnken模型的試驗設計原理，對酶解緩沖液pH值（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）3 個主要因素做響應面試驗設計。試驗設計方案及結果見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計方案與結果Table 1 Box-Behnken design scheme and corresponding results

2.2.2 模型方差分析

對表中的試驗數據進行響應面回歸分析可得到二階擬合模型：得率/‰=-20.500 89+13.110 83A+ 0.269 94B-0.040 75C-0.017 50AB+0.040 00AC-0.001 25BC-1.496 67A2-0.002 54B2-0.001 42C2。響應面二階回歸模型方差分析見表2。

表2 響應面設計二階回歸模型方差分析表Table 2 Analysis of variance for the second-order regression model

表2顯示，該回歸模型P＜0.000 1，方程模型極顯著，失擬項P＞0.05，失擬不顯著，可以利用該模型預測異硫氰酸酯的最高得率；結果顯示，酶解緩沖液pH值對異硫氰酸酯得率影響極顯著，酶解時間對得率影響顯著，酶解溫度對得率影響不顯著；pH值和溫度、pH值和時間的交互相應對得率有顯著影響，說明，試驗因素對得率的影響不是簡單的線性關系，交互項、二次項也有顯著影響。

根據方差分析結果，pH值-時間、pH值-溫度之間具有一定的交互效應，因此通過單因素試驗不能確定最優酶解條件，需要考慮3 個因素之間的交互作用。通過Design-Expert軟件對試驗模型進行優化，以異硫氰酸酯得率最高為優化目標，得到在pH值為4.8、酶解時間為40 min、酶解溫度27 ℃時異硫氰酸酯得率最高，為13.5‰。

2.3 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析

圖6 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析譜圖Fig.6 GC-MS profile of isothiocyanates extracted from the hydrolysate

提取物的GC-MS結果見圖6，結合標準圖譜庫初步判定出一種異硫氰酸酯類物質，即異硫氰酸芐酯（保留時間14.10 min），這與文獻[21-25]報道稱木瓜籽硫苷酶酶解產物中只含異硫氰酸芐酯這一種異硫氰酸酯的結果一致。同時，通過分析發現，提取物中含有異氰酸芐酯（保留時間8.6 min）、芐基腈（保留時間9.00 min）和硫氰酸芐酯（保留時間13.68 min）3 種可能的酶解產物，這說明硫苷并沒有完全按照異硫氰酸酯途徑酶解，酶解過程中還可能產生了少量以上幾種產物，因此，還有必要對硫苷酶解途徑進行研究，探討通過不同酶解條件來控制酶解產物的可能性。

3 結 論

本研究以異硫氰酸酯得率為指標，通過單因素試驗，考察了原料粒徑、料液比、酶解溫度、時間及pH值等因素對番木瓜籽中硫苷酶解反應的影響；并經Box-Behnken試驗設計及響應面分析，獲得了硫苷酶的最優酶解條件為酶解緩沖液pH 4.8、酶解時間40 min、酶解溫度27 ℃，在此條件下異硫氰酸酯得率為13.5‰。GC-MS結果表明，番木瓜籽硫苷酶酶解產物中只含有異硫氰酸芐酯一種異硫氰酸酯，但是酶解產物中同時還鑒定出芐基腈、硫氰酸芐酯和異氰酸芐酯，說明即使在最優反應條件下，硫苷并非完全按照異硫氰酸芐酯途徑轉化，有必要通過進一步研究考察硫苷在不同酶解條件下酶解途徑。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Glucosinolates from Carica papaya Seeds by Response Surface Methodology

LI Wen-zhao, DU Yi-deng, ZHU Hua-ping*, SHI Zong-yi, CHI Ying-zhou, RUAN Mei-juan
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The enzymatic hydrolysis of glucosinolates (GS) from Carica papaya seeds was optimized by response surface methodology with Box-Behnken design (BBD). The resulting isothiocyanates were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that enzyme buffer solution pH and hydrolysis time had significant effects on the yield of isothiocyanates, whereas enzymatic hydrolysis temperature had no significant effect. The optimal hydrolysis conditions were found to be hydrolysis at 27 ℃ for 40 min in a buffer solution at pH 4.8. Under the optimized conditions, the yield of isothiocyanates was 13.5‰. GC-MS analysis showed that only one isothiocyanate—benzyl isothiocyanate was detected in the hydrolysate.

Carica papaya seed; glucosinolates; enzymatic hydrolysis; isothiocyanates

TS209

A

1002-6630（2014）18-0028-04

10.7506/spkx1002-6630-201418006

2013-12-17

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B09；2012BAD31B06）

李文釗（1970—），女，副教授，博士，研究方向為食品加工與保鮮。E-mail：liwenzhao5518@sina.com

*通信作者：朱華平（1980—），男，副研究員，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：zhuhuaping@126.com