間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準確性評價

袁水林，熊 鼎，陳紅兵，高金燕，李 欣,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準確性評價

袁水林1,2，熊 鼎1,2，陳紅兵1,3，高金燕2，李 欣1,2,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

研究建立了以β-乳球蛋白標準品為包被抗原、自制抗體為一抗、辣 根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG∶HRP為二抗、鄰苯二胺為底物的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法（ indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent，ELISA）。同時以反相高效液相色譜法定量檢測相同樣品中β-乳球蛋白含量，采用t檢驗方法來評價間接競爭ELISA的方法定量檢測β-乳球蛋白的準確性。t檢驗方法結(jié)果顯示：在顯著水平α=0.05下，該間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白的測量值較為準確。

牛乳過敏；β-乳球蛋白；間接競爭ELISA法；反相高效液相色譜

食物過敏是一種食物不良反應(yīng)，屬于機體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)[1]。目前，食物過敏的患病率呈增長趨勢[2]，估計有5%的兒童和3%～4%的成年人對食物過敏[3]。在堅果、雞蛋、牛奶、魚類、甲殼綱動物、大豆、小麥和花生這8大類主要食物過敏原中[4]，大約有0.4%的兒童和0.2%的成年人對小麥和大豆過敏，1.5%的兒童和0.2%的成年人對雞蛋過敏，2.5%的兒童和0.3%的成年人對牛乳過敏[2]。

牛乳及乳制品因其含有較高的營養(yǎng)價值而受到廣大消費者的青睞，但同時， 牛乳及牛乳制品又是常見的8大食物過敏原之一[4]。有研究報道[5]，嬰幼兒對牛乳過敏的發(fā)病率已經(jīng)高達7.5%。絕大部分牛乳過敏反應(yīng)屬于IgE介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，也有非IgE介導(dǎo)的，如胃腸道紊亂[6]。牛乳中有20多種蛋白可能會導(dǎo)致牛乳過敏[7]，其中酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為牛乳中的最主要過敏原。牛乳中的β-乳球蛋白作為反芻動物乳清中最主

要的蛋白質(zhì)，在IgE介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)中，60%的病人是對β-乳球蛋白過敏[8]。其含量占乳清蛋白的50%，牛乳總蛋白含量的10%。β-乳球蛋白單體的分子質(zhì)量大約為18.3 kD，含有162 個氨基酸殘基，等電點為5.3，分子內(nèi)含有5 個二硫鍵[9-10]，屬于Lipocalin蛋白家族[11]。

根據(jù)實驗室已建立的間接競爭ELISA，對實驗條件加以改進，建立了檢測鮮乳中牛乳β-乳球蛋白含量的方法。檢測方法的評價引入統(tǒng)計學(xué)中t檢驗方法來驗證間接競爭ELISA法檢測牛乳以及乳清中β-乳球蛋白含量的準確性。本實驗以反相高效液相色譜法定量牛乳以及乳清中的β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度作為對照，以確保實驗數(shù)據(jù)的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶 江西光明乳業(yè)有限責(zé)任公司。

β-乳球蛋白標準品（純度90%）、羊抗兔IgG∶HRP酶標二抗 德國Sigma公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker 中國Tiangen公司；抗血清（一抗） 實驗室自制[12]。

1.2 儀器與設(shè)備

ALLEGRA 64R Centrifuge冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；PB-10型pH計 德國Sartorius公司；Mode 1860酶標儀、PowerPac 3000電泳 儀、Quantity One凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；LC-20AT反相高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清樣品的制備

1.3.1.1 鮮牛乳脫脂

用四層消毒紗布過濾鮮牛乳，除去鮮牛乳中大部分雜質(zhì)，然后用高速冷凍離心機（8 000 r/min、4 ℃、10 min）脫脂，得到脫脂乳。

1.3.1.2 沉淀酪蛋白

分離脫脂乳中的酪蛋白，本實驗采用的是等電點沉淀的方法[13]：脫脂乳在40 ℃的水浴鍋內(nèi)保溫，用5 mol/L鹽酸調(diào)其pH值至4.6，30 min后用高速冷凍離心機離心分離（8 000 r/min、15 min），收集離心上清液，得到乳清。

1.3.1.3 SDS-PAGE檢測乳清蛋白

用不連續(xù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）電泳，根據(jù)分子質(zhì)量對分離蛋白進行檢測。所用濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%；分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%。樣品在濃縮膠中時，恒定電流6 mA，電泳時間30 min；進入分離膠后，恒定電流在12 mA，電泳時間65～75 min。用低分子質(zhì)量蛋白Marker作為參比。

1.3.2 間接競爭ELISA法檢測蛋白濃度

96 孔酶標板每孔加入2.5 μg/mL 100 μL的包被抗原（β-乳球蛋白標準品），放于4 ℃冰箱過夜。次日恢復(fù)至室溫，傾去包被液，每孔加磷酸鹽吐溫（tween phosp hate buffered saline，PBST）緩沖液300 μL洗滌3 次，每次5 min，扣干。每孔加250 μL 1%的明膠作為封阻液，37 ℃孵育1 h?；謴?fù)至室溫，傾去封阻液，PBST滿孔洗滌3 次，每次5 min，扣干。倍比稀釋的競爭抗原50 μL與50 μL稀釋的抗血清在板外反應(yīng)l h后，加入包被有抗原的孔，37 ℃孵育1h后，以PBST洗滌，扣干3 次。每孔加入100 μL 1∶5 000稀釋的羊抗兔 IgG:HRP， 37 ℃保溫保濕1 h后，以PBST洗滌扣干3 次。每孔加反應(yīng)底物100 μL，37 ℃保溫避光反應(yīng)15 min。每孔50 μL 2mol/L H2S O4終止反應(yīng)。設(shè)置陰性孔（磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替競爭抗原和抗血清），陽性孔（PBS代替競爭抗原）。用酶標儀于490 nm波長處測定。

1.3.3 反相高效液相色譜法測定β-乳球蛋白

1.3.3.1 標準品溶液的制備

精確稱取β-乳球蛋白標準品用超純水配制成30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的標準品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用，上樣前用孔徑為0.22 μm的針式濾頭過濾。

1.3.3.2 樣品溶液的制備

取鮮牛乳以及上述乳清，鮮牛乳用超純水稀釋50 倍，乳清用超純水稀釋10 倍，上樣前用孔徑為0.22 μm的針式濾頭過濾。

1.3.3.3 色譜條件

本實驗采用的色譜條件[14]為：色譜柱Inertsil WP300 C8（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相A為含0.05%三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.1%三氟乙酸的超純水；梯度洗脫程序為流動相A在15 min內(nèi)從30%上升到50%，然后用2 min從50%降到30%；流速1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長280 nm；進樣量50 μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

1.3.4.1 間接競爭ELISA法檢測蛋白濃度競爭抑制率：

1.3.4.2 t檢驗參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳乳清的分離電泳圖

圖1 牛乳乳清的 SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE pattern of whey proteins

由圖1可以看出，牛乳經(jīng)過脫脂以及等電點沉淀可除去水牛乳中的絕大部分酪蛋白后，得到的牛乳乳清主要含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，還含有少量乳鐵結(jié)合蛋白以及牛血清蛋白，而酪蛋白幾乎沒有。

2.2 間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白質(zhì)量濃度

圖2 β-乳球蛋白間接競爭ELISA競爭抑制曲線Fig.2 Indirect competitive ELISA curve of bovine β-lactoglobulin

根據(jù)本實驗室[12]建立的間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的最佳條件，確定實驗所用包被液、競爭抗原、一抗（抗血清）、酶標二抗質(zhì)量濃度。通過預(yù)實驗分析，競爭抗原質(zhì)量濃度在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)接競爭ELISA抑制曲線有較好的線性關(guān)系，作該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標準曲線。第1次檢測樣品所用的標準曲線見圖2，后9 次重復(fù)實驗樣品所需要的標準曲線制作方法一樣。得到的標準方程為：y=-0.045 3x+89.996，R2=0.984 1。

根據(jù)1.3.2節(jié)實驗步驟和1.3.4.1節(jié)競爭抑制率的計算公式，定量檢測不同牧場的鮮牛乳和乳清，重復(fù)10 次，得到牛乳中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度含量見表1，牛乳乳清中β-乳球蛋白含量見表2。

表1 間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度Tabllee 11 β-Lactoglobulin concentration in fresh milk assayed using indirect competitive ELISA mg/mL

表2 間接競爭ELISA法檢測牛乳乳清中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度Tabllee 22 β-Lactoglobulin concentration in whey assayed using indirect competitive ELLIISSAA mg/mL

表3 反相高效液相色譜定量檢測標準品中-乳球蛋白Table 3 Quantitation of -lg concentration in standard substance using RP-HPLC

表4 反相高效液相色譜法定量樣品中β-乳球蛋白Table 4 Analysis of -lg concentration in milk and whey using RP-HPLC mg/mL

2.3 反相高效液相色譜法定量β-乳球蛋白質(zhì)量濃度

根據(jù)1.3.3.3節(jié)反相高效液相色譜法測定β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的色譜條件，配制所需標準品溶液以及樣品溶液。由反相高效液相所得超純水、β-乳球蛋白標準品、鮮牛乳以及牛乳乳清的圖譜如圖3所示，β-乳球蛋白保

留時間16.847 min。根據(jù)各質(zhì)量濃度標準品的峰面積見表3，采用外標法建立定量β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的標準曲線見圖4，y=2 302.4x-19 339，R2=0.997 7。

圖3 反相高效液相色譜圖Fig.3 RP-HPLC chromatograms

圖4 反相高效液相測定牛乳β-乳球蛋白標準品的標準曲線Fig.4 Standard curve for β-lg concentrations of standard substance using RP-HPLC

根據(jù)圖4建立的牛乳β-乳球蛋白標準品質(zhì)量濃度與峰面積的標準曲線，由反相高效液相色潽法所測鮮牛奶以及乳清的峰面積，平行取3 次樣品，定量各牧場鮮牛奶以及乳清中所含的β-乳球蛋白含量見表4。

2.4 評價間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準確性

根據(jù)反相高效液相色譜法定量每個牧場中牛乳以及乳清中的β-乳球蛋白質(zhì)量濃度（表3），本實驗用t檢驗方法來驗證間接競爭ELISA法檢測牛乳以及乳清中β-乳球蛋白含量（表1與表2）的準確性。根據(jù)1.3.4.2節(jié)的計算公式， 計算出各t檢驗參數(shù)見表5。

表5 鮮牛乳及乳清檢驗參數(shù)Table 5 The -test parameters for milk and whey

在顯著水平α=0.05下，查自由度n-1=9的t-分布表，得臨界值t0.025（9）=2.262，由表5的各組數(shù)據(jù)的觀測值|T0|＜t0.025（9），即在顯著水平為α=0.05下，使用間接競爭ELISA法檢測的測量值較為準確。

3 討 論

檢測食物過敏原的方法有多種，其中ELISA是最為常用的方法之一。ELISA最早由Engvall課題組[15]與Schuurs課題組[16]同時建立。它利用酶標記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，即保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性，因而極大地提高了靈敏度[17]。目前常用的ELISA有以下幾類，間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA和間接競爭ELISA。本研究采用間接競爭ELISA檢測牛乳中的主要過敏原-β-乳球蛋白，兼有間接ELISA以及競爭ELISA方法的優(yōu)點。本研究在實驗室建立的對間接競爭ELISA的方法檢測β-乳球蛋白[12]的基礎(chǔ)上，對實驗條件適當(dāng)改進，最終使用實驗條件為包被液質(zhì)量濃度2.5 μg/mL、一抗?jié)舛认♂?∶300 000、二抗?jié)舛认♂?∶5 000，發(fā)現(xiàn)在此條件下測定的β-乳球蛋白標準品線性關(guān)系最佳，吸光強度最強。

間接競爭ELISA檢測方法因其具有高特異性、高靈敏度、快速等優(yōu)點，目前間接競爭ELISA的方法檢測牛乳中的β-乳球蛋白含量有許多研究[18-20]。布冠好等[21]以檢

測的批內(nèi)誤差和批間誤差來說明該方法的靈敏度和重復(fù)性，但未對該檢測方法的準確性進行評估。張海英等[22]從回收率、精密度、特異性等方面比較了兩個品牌的ELISA試劑盒，對方法的準確性并未采用其他有效方法來驗證而只是用加標回收率來說明，不能排除方法本身帶來的的系統(tǒng)誤差。趙金龍[23]和張忠華[24]等也未使用其他方法來驗證間接競爭ELISA檢測方法的準確性。本研究應(yīng)用間接競爭ELISA方法與RP-HPLC方法相結(jié)合來檢測β-乳球蛋白含量，通過統(tǒng)計學(xué)t檢驗方法來評價間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準確性。通過本研究對該方法準確性的評價，為鮮牛奶中β-乳球蛋白含量的檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)，有助于解決我國食品安全中的過敏原牛乳β-乳球蛋白的檢測問題，為開發(fā)低敏性牛乳制品提供了一定的實驗依據(jù)和技術(shù)手段。

應(yīng)用RP-HPLC分析牛乳蛋白國內(nèi)外已有大量研究[25-27]，因該方法雖成本較高，但準確靈敏，所以本實驗以該測量值為標準值來評價使用間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準確性。然后使用t檢驗方法評價間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準確性。t檢驗是應(yīng)用最多的統(tǒng)計分析方法之一，它具有計算簡單以及檢驗功效較高等優(yōu)點。從本實驗結(jié)果來看，在使用間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白10 個樣品的10 組實驗中，在顯著水平α=0.05下，各組樣品實驗數(shù)據(jù)的觀測值|T0|＜t0.025（9），即在顯著水平為α=0.05下，使用該實驗條件的間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白的測量值較為準確。

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Evaluation of the Accuracy of Indirect Competitive ELISA Used to Detect Milk β-Lactoglobulin

YUAN Shui-lin1,2, XIONG Ding1,2, CHEN Hong-bing1,3, GAO Jin-yan2, LI Xin1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established with the standard β-lactoglobulin as the coated antigen, specif i c rabbit antibody against β-lactoglobulin as the primary antibody, horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG:HRP as the secondary antibody and o-phenylenediamine as the substrate solution. Reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used as the reference method. The t-test method proved that the indirect competiti ve ELISA for detection of β-lactoglobulin was feasible and accurate. The results of t-test at a signif i cance level α = 0.5 showed that the indirect competitive ELISA was more accurate to detect the concentration of β-lactoglobulin.

milk allergy; β-lactoglobulin; indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay; reversed-phase highperformance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-6630（2014）18-0100-05

10.7506/spkx1002-6630-201418020

2014-04-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B02）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31260204；31301522）；江西省自然科學(xué)基金項目（2012BAB204002）；江西省教育廳課題（GJJ12143）

袁水林（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：yslin1989@163.com

*通信作者：李欣（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhizilixin@hotmail.com