高壓液相色譜-質譜法和高效液相色譜法分析籽瓜中環磷酸腺苷

席冬華，高 晶，彭新媛，王 倩，李 玲，吳 斌,*

（1.新疆大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農業科學院農產品貯藏加工研 究所，新疆 烏魯木齊 830091）

高壓液相色譜-質譜法和高效液相色譜法分析籽瓜中環磷酸腺苷

席冬華1，高 晶2，彭新媛1，王 倩3，李 玲1，吳 斌3,*

（1.新疆大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農業科學院農產品貯藏加工研 究所，新疆 烏魯木齊 830091）

采用高壓液相色譜-質譜法鑒定籽瓜中的環磷酸腺苷，并建立高效液相色譜法測定籽瓜 中環磷酸腺苷的含量，對樣品提取條件進行優化。結果表明：環磷酸腺苷在0.1～100 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 9；平均加標回收率為98.40%，相對標準偏差為3.22%。經單因素試驗和正交試驗，確定優化的提取條件為料液比1∶12（鮮樣）和1∶60（干樣）水提取，提取溫度90 ℃、提取時間40 min、提取次數3 次。樣品前處理和分析方法準確、簡便、可靠、重復性好，可用于籽瓜中環磷酸腺苷含量的分析測定。

籽瓜；環磷酸腺苷；高壓液相色譜-質譜法；高效液相色譜法

環磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monophosphate，cAMP）是核苷酸的衍生物，蛋白激酶致活劑，被稱為“生命第二信使”（激素為第一信使），廣泛存在有機體中的一種具有生理活性的重要物質。醫學研究證明有40多種疾病與cAMP的代謝有關，包括癌癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞和心源性休克[1]和帕金森綜合癥[2]等重大疾病。cAMP可以通過化學合成、微生物發酵、天然產物分離提取等方法獲得。化學合成cAMP的方法[3]存在化學試劑不能完全去除的隱患和環境危害；微生物發酵cAMP方法培養周期長，產物中可能含有菌體代謝產物[4]；而天然產物提取的cAMP具有綠色，無毒副作用等特點，具有較高的商業開發價值，從富含cAMP的植物源組織中分離檢 測cAMP是當今研究熱點之一[5]。

目前，分析cAMP的方法主要有紙色譜法、薄層色

譜法[6]、競爭結合蛋白分析法[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-9]、液相色譜-質譜（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[10-12]、親水色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧四極桿飛行時間質譜法[13]等。高效液相色譜法具有分析時間短、分離度好、靈敏度高、操作簡便的特點，近幾年來得到迅速發展[14]與廣泛應用。已有大量文獻報道用HPLC法測定不同地區[15-16]、不同品種棗果[17-20]中的cAMP含量，但對籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP的研究報道很少。

籽瓜（又稱打瓜）是葫蘆科西瓜屬普通西瓜的栽培變種，極具地域特色，中國籽瓜種植面積和產量均居世界之首，新疆是我國籽瓜主產區之一。目前，對籽瓜的利用只是做到了取籽加工，瓜籽只占鮮瓜質量的3%～5%，其余約占瓜質量95%以上的部分都作為廢物而被丟棄[21]，造成極大的資源浪費。本實驗通過建立檢測籽瓜中cAMP含量的HPLC法，為籽瓜資源的深加工提供技術支持，也為植物源cAMP的研究與應用提供新的原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜（品種：黑大片） 新疆昌吉墾區；cAMP標準品（純度≥99%） 北京百靈威化學技術有限公司；甲醇（色譜純） 霍尼韋爾貿易（上海）有限公司；磷酸二氫鉀、甲醇（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；實驗室用水均為高純水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

1260型HPLC儀（配有可變波長紫外檢測器、示差折光檢測器和EZChrom Elite工作站） 美國安捷倫公司；Quattro Premier XE高壓液相色譜-質譜儀（配有電噴霧離子源及MassLynx4.1軟件操作系統） 美國Waters公司；DZG-303A“艾柯”實驗室專用超純水儀 成都唐氏康寧科技發展有限公司；Himac CR-20B2型高速冷凍離心機 日本日立公司；IKA A11基本型研磨機 廣州儀科實驗室技術有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；電熱恒溫水槽 上海精宏儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取0.020 0 g cAMP標準品，用高純水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，該儲備液質量濃度200 mg/L，再依次配制成0.1、1、10、50、100 mg/L一系列不同質量濃度的標準工作溶液，過0.22 μm濾膜后進樣。

1.3.2 水浴法提取cAMP

將籽瓜清洗、縱切、手動去籽、去表皮、分離瓜皮和瓜瓤、分別冷凍、粉碎、真空干燥、保存在-80 ℃冰箱。準確稱取一定質量籽瓜冷凍樣品，放入50 mL圓底燒瓶中；1）籽瓜冷凍鮮樣以料液比為1∶12 （g/mL）加入高純水搖勻后，在90 ℃條件下恒溫水浴40 min；2）籽瓜干樣以料液比1∶60 （g/mL）加入高純水搖勻后，在90 ℃條件下恒溫水浴40 min。分別提取2 次合并提取液10 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜后直接注入進樣品以供分析。

1.3.3 高壓液相色譜-質譜條件

色譜條件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（10∶90，V/V）溶液等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

質譜條件：毛細管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣流50 L/h；干燥氣為氮氣，氣流量為650 L/h；碰撞氣體氬氣；氣體流量0.18 mL/min；電噴霧離子源；正離子模式掃描；多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測。其他參數見表1。

表1 檢測cAMP的質譜條件Table 1 MS conditions for the detection of cAMP

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（15∶85，V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長259 nm；進樣量20 μL。

1.3.5 提取條件優化

在提取溫度90 ℃，提取時間30 min條件下，選取料液比（g/mL）：鮮樣：1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12；干樣：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取時間30 min條件下，選取提取溫度：60、70、80、90、95、100 ℃。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取溫度90 ℃條件下，選取提取時間：10、20、30、40、60 min。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取溫度90 ℃，提取時間30 min條件下，選取不同提取次數：鮮樣： 1、2、3 次；干樣：1、2、3、4 次。

2 結果與分析

2.1 籽瓜中cAMP的鑒定

對1 mg/L cAMP標準物質進行一級全掃描和子離子掃描，確定cAMP的前體離子和產物離子，選擇2 個豐度較高、干擾較少的子離子作為定性離子和定量離子，其MRM色譜圖如圖1A所示。將籽瓜瓤樣品按樣品處理方法處理稀釋后，進樣10 μL，得到MRM色譜圖如圖1B所示。

圖1 cAMP標準品和籽瓜樣品MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of cAMP standard solution and seeding watermelon sample

由圖1可以看出，籽瓜樣品中目標物質的峰與cAMP標準品的峰保留時間在誤差范圍內，選擇的特征離子的保留時間及豐度之比與標準品的一致，確定目標物質為cAMP，該方法鑒定了籽瓜樣品中含有cAMP。

2.2 cAMP提取條件優化

純水作提取溶劑時cAMP的提取量較高[13]，故本實驗用高純水作提取劑。影響cAMP提取量的主要因素有料液比、提取溫度、提取時間和提取次數。以cAMP的提取量為指標，采用單因素分析法對水浴提取參數進行優化。

圖2 籽瓜鮮樣提取條件優化圖Fig.2 Optimization of extraction conditions for flesh seeding watermelon

圖3 籽瓜干樣提取條件優化圖Fig.3 Optimization of extraction conditions for dry seeding watermelon

由圖2、3可知，提取液使用量越大，提取量越高，但提取液使用量過高，cAMP的質量濃度越低，質量濃度太低會增加cAMP分離提取工作的負擔[22]，料液比選擇1∶12（鮮樣）、1∶60（干樣）。提取溫度達到90 ℃時提取量較高，提取溫度選擇90 ℃。cAMP的含量隨提取時間延長有較明顯提高，當提取時間為40 min時，cAMP含量達到最大，隨著提取時間的延長，提取量開始降低，可能由于提取時間過長，雜質溶出，影響了cAMP的提取[23]，故選擇提取時間為40 min。不同提取次數對鮮樣中cAMP含量影響較小，干樣在提取3 次后提取量變化不明顯，鮮樣可提取2 次，干樣提取3 次。

2.3 cAMP提取因素的正交優化

從以上單因素試驗可以看出，提取量受料液比、提取溫度、提取時間和提取次數4 個因素影響。為全面考察這4 個因素的作用大小和優化組合，設計了L9（34）正交試驗。結果及數據處理見表2和表3。

由表2可知，影響籽瓜鮮樣中cAMP提取率的主次因

素為A＞D＞C＞B，即料液比為最主要因素，提取溫度、提取時間和提取次數均為次要因素。從各因素極差分析結果得出最佳提取條件為A3B2C2D3，由正交試驗可知，最優組合為A3B2C1D3，通過驗證實驗確定提取工藝組合為A3B2C2D3，由于提取次數對鮮樣中cAMP提取量影響較小，最終確定提取工藝為料液比1∶12、提取溫度90 ℃、提取時間40 min、提取次數3 次。

由表3可知，影響籽瓜干樣中cAMP提取率的主次因素為D＞A＞C＞B，即提取次數是最主要因素，料液比、提取溫度和提取時間均為次要因素。從各因素極差分析結果得出最佳提取條件為A3B2C2D3，由正交試驗可知，最優組合為A3B2C1D3，通過驗證實驗最終確定提取工藝組合為A3B2C2D3，即料液比1∶60、提取溫度90 ℃、提取時間40 min、提取次數3 次。

表 2 L9（34）正交試驗設計和結果（鮮樣）Table 2 Results of L9 (34) orthogonal array design (flesh sample)

表 3 L9（34）正交試驗設計和結果（干樣）Table 3 Results of L9((334) orthogonal array design (dry sample)

2.4 標準品及籽瓜cAMP的色譜圖

cAMP標準物質色譜圖如圖4所示。樣品進行前處理后用HPLC進行分析，得籽瓜瓜瓤、瓜皮鮮樣的色譜圖如圖5和圖6所示，可見cAMP信號峰能與其他雜質峰分離且有較好峰形。

圖4 標準品HPLC色譜圖Fig.4 Chromatogram of cAMP standard

圖5 籽瓜瓜瓤樣品HPLC色譜圖Fig.5 Chromatogram of cAMP from seeding watermelon flesh

圖6 籽瓜瓜皮樣品HPLC色譜圖Fig.6 Chromatogram of seeding watermelon rind

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線的繪制

選取不同質量濃度的cAMP標準工作溶液，每個質量濃度進樣20 μL。以每個標準工作溶液對應的峰面積Y和其質量濃度X進行線性回歸分析，得到回歸方程Y=860 341.567 13X-91 953.292 8，R=0.999 9，cAMP標準曲線見圖7。結果顯示在0.1～100 mg/L范圍內線性關系良好。

圖7 cAMP標準曲線Fig.7 Standard curve of cAMP

2.5.2 精密度

取質量濃度10 mg/L的cAMP標準液自動進樣20 μL，平行測定5 次，測定cAMP峰面積積分值，計算平均值和相對標準偏差（rel ative standard deviation，RSD），結果見表4。RSD為0.34%，說明精密度良好，滿足實驗要求。

表4 精密度實驗結果（n=5）Table 4 Results of precise test (n =5)

2.5.3 重復性

精確稱取相同質量的樣品5 份，制備籽瓜提取液，分別進樣20 μL，用HPLC儀測定峰面積，計算峰面積的RSD為2.28%，結果見表5。說明實驗重復性良好。

表5 重復性實驗結果（n=5）Table 5 Results of repeatability test (n=5)

2.5.4 回收率

精確稱取相同質量的籽瓜瓜瓤樣品5 份，分別加入一定量的cAMP標準物質，進行加標回收率實驗，結果如表6所示。cAMP的回收率為92.93%～104.96%，RSD為3.22%，表明該方法能準確測定籽瓜中cAMP的含量。

表6 加標回收實驗結果(n=5）Table 6 Results of recovery test (n =5)

2.6 籽瓜樣品的測定

表7 籽瓜中cAMP的含量（n=3）Table 7 cAMP contents of the flesh and rind of seeding watermelon (n =3)

籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP含量有較大區別，由表7可以看出，籽瓜瓜瓤中的cAMP含量高于瓜皮，大約是瓜皮的2～3 倍。

3 討論與結論

本實驗采用高壓液相色譜-質譜法鑒定出籽瓜中含有cAMP，并建立HPLC法測定籽瓜中cAMP的含量，精密度和準確度均符合分析要求，方法回收率高、重復性好，cAMP的平均加標回收率為98.40%，重復測定的RSD為2.28%。通過單因素試驗和正交試驗對樣品提取條件進行優化，最終選擇提取條件：提取液為水、料液比1∶12（鮮樣）和1∶60（干樣）、提取溫度90 ℃、提取時間40 min和提取次數3 次。該研究方法能夠滿足籽瓜中cAMP定性定量分析的要求。通過對新疆黑大片籽瓜樣品中cAMP的檢測，可知籽瓜瓜瓤中的cAMP含量較高，含量達到256.86 mg/kg（md）。下一步將研究新疆不同品種籽中cAMP含量的差異，為籽瓜資源的充分利用提供依據。

[1] 崔志強, 孟憲軍, 王傳杰. HPLC法測定冬棗環磷酸腺苷含量[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(3): 158-160.

[2] OECKL P, HENGERER B, FERGER B. G-Protein coupled receptor 6 deficiency alters striatal dopamine and cAMP concentrations and reduces dyskinesia in a mouse model of Parkinson’s disease[J]. Experimental Neurology, 2014, 257: 1-9.

[3] 申艷紅, 張文生, 謝楠, 等. 環磷酸腺苷的合成[J]. 有機化學, 2003, 23(增刊1): 113.

[4] 夏泉鳴, 周洋, 趙黎明, 等. 離子交換法提取大棗中環磷酸腺苷(cAMP)的工藝研究[J]. 生物技術進展, 2012, 2(4): 288-292.

[5] 姚文華, 尹卓容. 大棗的研究[J]. 農產品加工: 學刊, 2006(2): 28-33.

[6] HANABUSA K, CYONG J, TAKAHASHI M. High level of cyclic AMP in the jujube plum[J]. Planta Medica, 1981, 42(4): 380-384.

[7] 劉孟軍, 王永惠. 棗和酸棗等14 種園藝植物cAMP含量的研究[J]. 河北農業大學學報, 1991, 14(4): 20-23.

[8] 徐濤, 潘見, 袁傳勛, 等. 大孔樹脂SPE-RP-HPLC檢測大棗中的cAMP[J]. 食品科學, 2005, 26(12): 179-181.

[9] 郜文, 丁兆毅, 徐菲, 等. HPLC法測定大棗環磷酸腺苷(c-AMP)的含量[J]. 首都醫科大學學報, 2011, 32(3): 375-378.

[10] OECKL P, FERGER B. Simultaneous LC-MS/MS analysis of the biomarkers cAMP and cGMP in plasma, CSF and brain tissue[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2012, 203(2): 338-343.

[11] LORENZETTI R, LILLA S, JUIS DONATO L, et al. Simultaneous quantification of GMP, AMP, cyclic GMP and cyclic AMP by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 859(1): 37-41.

[12] van DAMME T, ZHANG Y, LYNEN F, et al. Determination of cyclic guanosineand cyclic adenosine monophosphate (cGMP and cAMP) in human plasma and animal tissues by solid phase extraction on silica and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 909: 14-21.

[13] 趙恒強, 耿巖玲, 苑金鵬, 等. UAE-HILIC-DAD-ESI-Q-TOF/MS法測定大棗中的環磷酸腺苷[J]. 食品研究與開發, 2013, 34(18): 46-50.

[14] 謝越, 俞浩, 汪建飛, 等. 高效液相色譜法同時測定滁菊樣品中的9種酚酸[J]. 分析化學, 2013, 41(3): 383-388.

[15] 張倩, 樊君, 羅云書. HPLC測定陜北大棗和新疆大棗中環磷酸腺苷含量的研究[J]. 藥物分析雜志, 2008, 28(6): 895-897.

[16] 蘇豫梅, 許玲, 孫振榮, 等. 用HPLC法測定紅棗中cAMP含量的研究[J].農產品加工, 2011(7): 76-78.

[17] 史紅梅, 尹卓容, 蔣文強. 高壓液相色譜法測定金絲小棗環磷酸腺苷的含量[J]. 食品科學, 2006, 27(5): 216-218.

[18] 趙堂, 郝鳳霞, 楊敏麗. 幾種紅棗中生物活性物質環磷酸腺苷的含量分析[J]. 湖北農業科學, 2011, 50(23): 4955-4957.

[19] 蒲云峰, 萬英, 侯旭杰. HPLC法測定不同品種紅棗中cAMP含量[J].食品研究與開發, 2011, 32(7): 109-112.

[20] 許牡丹, 鄒繼偉, 史芳. 超聲波輔助酶法提取木棗環磷酸腺苷的工藝條件優化[J]. 食品科技, 2013, 38(7): 220-224.

[21] 武冬梅, 李冀新, 趙志永, 等. 新疆籽瓜主栽品種營養成分分析比較[J].食品研究與開發, 2010, 31(8): 177-179.

[22] 史紅梅, 尹卓容, 蔣文強. HPLC法測定金絲小棗中環磷酸腺苷的含量[J]. 天然產物分離, 2007, 4(1): 9-11.

[23] 尤妍, 陳愷, 李煥榮, 等. 響應面法優化哈密大棗環磷酸腺苷提取工藝的研究[J]. 保鮮與加工, 2011, 11(2): 21-26.

Identification and Quantitation of Cyclic Adenosine 3’,5’-monophosphate in Seeding Watermelon by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and High Performance Liquid Chromatography

XI Dong-hua1, GAO Jing2, PENG Xin-yuan1, WANG Qian3, LI Ling1, WU Bin3,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Center for Physics and Chemistry Analysis, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 3. Institute of Agro-products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, ürümqi 830091, China)

A method to identify cAMP using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MSMS) and to quantify the content of cAMP in seeding watermelon using high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The quantitative method showed a good linear relationship in the cAMP concentration range from 0.1 to 100 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery for spiked samples was 98.40% with relative standard deviation (RSD) of 3.22% (n = 5). By using one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, the optimum conditions for cAMP extraction were determined as follows: solid-to-water ratio; 1:12 (fresh sample) or 1:60 (dry sample); temperature, 90 ℃; extraction time, 40 min. This method is simple, accurate, reliable and reproducible, and can be used for the determination of cAMP in seeding watermelon.

seeding watermelon; cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP); liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630（2014）18-0141-05

10.7506/spkx1002-6630-201418028

2013-11-27

新疆維吾爾自治區級公益性科研院所基本科研業務費專項（KY2013045；KY2014038）

席冬華（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物分析。E-mail：553764469@qq.com

*通信作者：吳斌（1973—），男，副研究員，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：xjuwubin0320@sina.com