油橄欖酒的釀造及香氣成分分析

馬騰臻，李 潁，張 莉，張彥芳，盛文軍，祝 霞，韓舜愈*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

油橄欖酒的釀造及香氣成分分析

馬騰臻，李 潁，張 莉，張彥芳，盛文軍，祝 霞，韓舜愈*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

以制取橄欖油后的果汁為原料，通過調(diào)配、發(fā)酵等工藝制得油橄欖酒，進行理化指標及感官評價分析，并采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測其香氣成分，以期為油橄欖 的綜合開發(fā)利用，進一步提高其附加值提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：產(chǎn)品酒精體積分數(shù)（6.42%）、總糖含量（7.84 g/L）、揮發(fā)酸含量（1.04 g/L）、總二氧化硫含量（103.05 mg/L）及干浸出物含量（27.66 g/L）等理化指標與感官評價結(jié)果均符合GB 15037—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定；油橄欖酒中共鑒定出69 種香氣成分，總含量約23.44 mg/L，包括12 種醇類、25 種酯類、6 種有機酸、8 種羰基類（醛和酮）、14 種萜烯類和4 種酚類，通過香氣成分的氣味活性值初步確定主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

油橄欖酒；香氣成分；頂空固相微萃取；氣相色譜-質(zhì)譜法

油橄欖又稱洋橄欖、齊敦果，是世界著名的油用和餐用果樹，原產(chǎn)于地中海沿岸國家，目前已有4 000多年栽培歷史。我國從1956年開始陸續(xù)引種油橄欖，現(xiàn)種植面積約3萬公頃，主要集中在甘肅、四川等地，其中甘肅隴南地區(qū)被認為是中國最適合種植油橄欖的地區(qū)[1-2]。

油橄欖果實主要用于榨取橄欖油，榨油后產(chǎn)生的果渣及果汁中含有糖、脂肪酸、三萜、多酚、黃酮等諸多有效成分[3]，處理不當既導致環(huán)境污染又造成資源浪費。長期以來，國內(nèi)外學者研究了物理、化學、生物及多種方法相結(jié)合的廢料處理工藝，其中成本低、污染小的生物法應用前景最廣[4]，如Luis等[5]研究了黑曲霉在廢棄果汁中發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的工藝；國內(nèi)研究目前主要集中在果渣有效成分的提取上[2-3]，果汁多作為廢水排放，相關(guān)研究較少。

本實驗以甘肅隴南地區(qū)經(jīng)壓榨制取橄欖油后的果汁為原料，通過調(diào)配及酒精發(fā)酵等工藝制得油橄欖果酒，并進行了理化指標、感官評價及香氣成分分析，旨在為油橄欖果實的高效利用，進一步提高其附加值提供理論依據(jù)，促進我國油橄欖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖果汁 隴南天然居油橄欖科技開發(fā)有限公司；正辛醇、蘆丁（均為色譜純） 美國Sigma公司；磷鉬鎢酸顯色劑 北京華科盛精細化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；無水乙醇、氯化鈉、偏重亞硫酸鉀、一水合沒食子酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、無水葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純；費林溶液、次甲基藍指示液、酚酞指示液、碘標準滴定液、淀粉指示液等按照GB/T 603—2002《化學試劑：試驗方法中所用制劑及制品的制備》配制。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器制造有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計、265079氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-WAX色譜柱 美國Thermo Scientific公司；頂空固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS（50/30 μm）萃取器 美國Surpelco公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；18100摩爾超純水機 重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；MSC-400磁力加熱攪拌器 德國Wiggen Hauser公司；手持數(shù)顯糖度計日本Atago公司；WKM-2-3三聯(lián)微孔膜過濾器 煙臺一州科美機械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油橄欖酒的生產(chǎn)工藝

油橄欖壓榨汁→離心分離→果汁→糖酸調(diào)配→發(fā)酵→分離→澄清→膜過濾→裝瓶 ↓ ↑ ↑

橄欖油 SO2酵母活化

操作要點：1）調(diào)配：果汁含糖量為75.7 g/L，按照17 g/L糖→體積分數(shù)1%酒精加白砂糖進行調(diào)配[6]，使初始糖度為160 g/L，添加SO2抑制雜菌（120 mg/L偏重亞硫酸鉀），并用檸檬酸調(diào)整果汁pH值至4～4.5；2）酵母活化：取適量果汁水浴加熱至35 ℃后按推薦用量接入酵母，活化30 min，待果汁冷卻至室溫后加入發(fā)酵罐中；3）發(fā)酵：22 ℃發(fā)酵，每天測定發(fā)酵液溫度及糖含量（手持數(shù)顯糖度計測定），主發(fā)酵期結(jié)束后（糖度不再明顯降低）按40 mg/L添加偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵；4）分離澄清：在10～15 ℃的酒窖中貯存，通過定期倒罐去除酒泥，并用40 mg/L明膠對果酒進行澄清處理；5）過濾裝瓶：按40 mg/L添加偏重亞硫酸鉀，膜過濾機（濾膜孔徑分別為1、0.45 μm和0.22 μm）過濾后裝瓶貯存。

1.3.2 理化指標測定

1.3.2.1 常規(guī)指標

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定酒精體積分數(shù)（密度瓶法）、干浸出物含量、總糖含量、總酸含量（指示劑法）、揮發(fā)酸含量、總二氧化硫含量（直接碘量法）等指標。

1.3.2.2 色度、色調(diào)

油橄欖酒于0.45 μm孔徑的濾紙過濾后測定pH值，用相同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液以1∶10（V/V）稀釋酒樣。取稀釋后的酒樣于1 cm比色杯中，在分光光度計波長420、520 nm和620 nm條件下分別測定其吸光度[7]。三者吸光度之和即為該酒樣色度值，前兩者比值為色調(diào)值。

1.3.2.3 總酚含量的測定

福林酚比色法[7]：吸取2.0 mL酒樣，用水稀釋至100 mL，然后吸取1.0 mL樣品溶液分別加入水5.0 mL、福林酚顯色劑1 mL和質(zhì)量分數(shù)7.5%碳酸鈉溶液3 mL，顯色。放置2 h后在765 nm波長條件下測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線（方程）計算出樣品中總酚的含量。

1.3.2.4 單寧含量的測定

參照NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定：分光光度法》測定。

1.3.2.5 總黃酮含量的測定

AlCl3顯色法[8]：吸取2 mL酒樣用體積分數(shù)30%乙醇溶液稀釋至10 mL，取1 mL稀釋后的酒樣，加4 mL 體積分數(shù)30%乙醇溶液，搖勻，再加4 mL質(zhì)量分數(shù)1% AlCl3溶液，最后用體積分數(shù)30%乙醇溶液稀釋至10 mL，搖勻放置10 min后在415 nm波長條件下測定樣品吸光度，根據(jù)標準曲線（方程）計算出樣品中總黃酮的含量。

1.3.3 感官分析

在標準葡萄酒品嘗實驗室中，由5 位專家組成的感官分析品嘗小組參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對該產(chǎn)品進行感官分析。

1.3.4 香氣物質(zhì)分析[9]

1.3.4.1 香氣成分的富集

在裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入5 mL油橄欖酒、1.5 g NaCl、50 μL 1-辛醇乙醇溶液（使其在最終酒樣中的質(zhì)量濃度為8.3 mg/L），在45 ℃條件下恒溫攪拌30 min后，用活化好的固相微萃取器吸附30 min，氣相色譜進樣口解吸溫度250 ℃，解吸時間10 min，進行分析。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）條件

色譜柱：Thermo TG-WAX（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；升溫程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；不分流進樣；電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性：由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機在NIST、Wiley及香精香料標準譜庫的檢索比對進行定性，比對時要求匹配度大于800（最大值為1 000）；定量：采用內(nèi)標法進行半定量分析，內(nèi)標選用1-辛醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線圖

圖1 總酚/單寧含量測定標準曲線Fig.1 Calibration curve for total phenols or tannin assay

圖2 總黃酮含量測定標準曲線Fig.2 Calibration curve for total flavonoids assay

2.2 理化指標測定結(jié)果與分析

表1 油橄欖酒理化指標測定結(jié)果Table 1 Physical and chemical parameters of Olea europaea L. wine

由表1可知，總二氧化硫含量、總糖含量（半干酒）、酒精體積分數(shù)、揮發(fā)酸含量及干浸出物含量等指標均符合國家標準規(guī)定；總酚、單寧含量及色度值與蛇龍珠干紅葡萄酒相當[7]。色度值可用于衡量果酒的色澤品質(zhì)，一般而言，總酚、單寧、總花色苷含量較高的果酒顏色深，色度值高，反之色度值則較低，但也受果酒SO2含量及pH值的影響。油橄欖酒中的黃酮類化合物主要有木犀草苷、蘆丁等[3,8]，總含量約為31.65 mg/L。

2.3 油橄欖酒感官分析結(jié)果

感官分析是果酒品質(zhì)檢驗的經(jīng)典方法，具有儀器分析無法替代的作用。感官分析結(jié)果表明，該果酒呈棕紅色，澄清透明，無沉淀及懸浮物，具有純正、優(yōu)雅的果香與酒香，口感較舒順、完整，有特殊的橄欖香。

2.4 油橄欖酒香氣GC-MS定性結(jié)果

圖3 油橄欖酒香氣成分GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile compounds detected in Olea europaea L. wine

根據(jù)總離子流圖（圖3），油橄欖酒中初步鑒定出69 種香氣化合物，總含量為23.44 mg/L，其中醇類12 種、酯類25 種、有機酸6 種、羰基化合物（醛和酮）8 種、萜烯類14 種、酚類4 種，分別占總組分的27.78%、45.97%、5.80%、3.39%、8.86%和8.20%，各香氣物質(zhì)及其含量見表2。

香氣成分是衡量果酒風味品質(zhì)的主要指標，果酒的香氣來自果實本身、酵母發(fā)酵及陳釀等過程，其主要成分有酯、醇、萜烯、酚、縮醛、內(nèi)酯、脂肪酸等[16]。各組分對香氣的貢獻取決于它們的濃度和閾值，根據(jù)OAV值并參考文獻報道，油橄欖酒中OAV值大于1的化合物有23 種，初步確定主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

2.4.1 醇類化合物

發(fā)酵階段可產(chǎn)生高級醇、酯和有機酸等主要香氣物質(zhì)，根據(jù)定性定量結(jié)果，該階段形成的香氣物質(zhì)是酒最主要的香氣成分。高級醇是酵母酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物，其含量受發(fā)酵條件、醪液理化指標及原料等因素的影響[13]。油橄欖酒中含量最高的醇類物質(zhì)是異戊醇，其次是苯乙醇，它們都是果酒發(fā)酵中酵母的代謝產(chǎn)物，當其質(zhì)量濃度分別高于300 mg/L和140 mg/L時會有腐臭味，低于此值則會給酒體帶來宜人的果香和花香[17]。具有青草味和果香的1-己醇和順-3-己烯-1-醇是C6醛、醇類化合物，主要由橄欖油制取過程中多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）在脂氧合酶作用下產(chǎn)生[18]。

2.4.2 酯類化合物

酯類的形成也受醪液理化組成及發(fā)酵條件的影響。酒精發(fā)酵階段，在酯酶催化作用下酰基CoA與乙醇合成脂肪酸乙酯，乙酰CoA和高級醇合成乙酸酯[19]。在該果

酒所檢出的69 種化合物中，酯類占25 種，是種類最多的化合物。

表2 油橄欖酒香氣成分及含量Table 2 Aroma composition of Olea europaea L. wiinnee

酯類化合物中乙酸乙酯含量最高，在較低濃度水平下，可增加酒體香氣的復雜性。具有氣味活性值的乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等低分子質(zhì)量酯類物質(zhì)由于具有水果的芳香味而常被稱為“水果”酯類[20]。

2.4.3 萜烯類化合物

萜烯類化合物屬于植物體中由乙酰CoA合成的次級代謝產(chǎn)物，以游離態(tài)和無味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于植物果實中，該類化合物具有濃郁的香味，且感官閾值較低[19]，通常具有花香、果香、種子、木頭及根莖的氣味[20]。

油橄欖酒中初步鑒定出14 種萜烯類化合物，與油橄欖果實及橄欖油[18,21]中的報道相似，其中里那醇、香葉醇、異香茅醇和α-萜品醇有氣味活性值，賦予酒濃郁的花香和果香。

2.4.4 其他化合物

油橄欖酒中還檢測到了有機酸、羰基化合物和揮發(fā)性酚類物質(zhì)等。盡管產(chǎn)品中鑒定出的有機酸含量都低于閾值，但這些酸仍可為酒帶來新鮮感并同時平衡果香[13]。油橄欖酒中醛酮類化合物的種類少于果實和橄欖油[18,21]，這可能是釀造過程中的損失及轉(zhuǎn)化所致，其機理還有待進一步研究。α-紫羅酮和β-紫羅酮為紫羅蘭香，在酒的香氣構(gòu)成中具有重要作用；β-大馬酮表現(xiàn)為花香和果香且閾值極低（6 μg/L），對酒感官影響較大，但也有一些學者認為其主要作用是增強果實中其他化合物的香氣，而非單獨呈味[13]。果酒中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)來源于果實本身或酒精發(fā)酵過程，由酚酸降解或酒香酵母產(chǎn)生[13]。該果酒初步鑒定出的4 種揮發(fā)性酚類物質(zhì)中，愈創(chuàng)木酚氣味活性值較高。

續(xù)表2

3 結(jié) 論

3.1 本實驗以壓榨制取橄欖油后廢棄的果汁為原料，經(jīng)調(diào)配發(fā)酵制得油橄欖酒。所得產(chǎn)品酒精體積分數(shù)（6.42%）、總糖含量（7.84 g/L）、揮發(fā)酸含量（1.04 g/L）、總二氧化硫含量（103.05 mg/L）及干浸出物含量（27.66 g/L）等理化指標均符合國家標準規(guī)定；感官分析結(jié)果表明該果酒呈棕紅色，口感較舒順、完整，具有純正、優(yōu)雅的果香、酒香及特殊的橄欖香；OAV值分析結(jié)果表明油橄欖酒主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

3.2 利用廢棄油橄欖果汁釀造果酒方法可行，該方法在繼油橄欖枝葉和果渣中有效成分的提取后進一步完善了油橄欖綜合開發(fā)利用體系，對拓寬油橄欖精深加工渠道提供了理論依據(jù)。但工藝條件對酒品質(zhì)的影響仍需進一步研究。

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Volatile Compound Analysis of Olea europaea L. Wine

MA Teng-zhen, LI Ying, ZHANG Li, ZHANG Yan-fang, SHENG Wen-jun, ZHU Xia, HAN Shun-yu*
(Key Laboratory of Viticulture and Enology in Gansu Province, Research and Development Center of Wine Industry in Gansu Province, College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Olea europaea L. wine, fermented by Olea europaea L. juice (which arises from the production of olive oil and) with sugar/acid ratio, were evaluated for physicochemical parameters and sensory characteristics, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with headspace solid-phase microextraction was used to profile the volatile compounds. The results showed that the alcohol degree (6.42%), total sugar (7.84 g/L), violate acid (1.04 g/L), total sulfur dioxide (103.05 mg/L), and dry extract (27.66 g/L) of Olea europaea L. wine measured up to the Chinese national standard GB 15037-2006 Analytical Methods of Wine and Fruit Wine. A total of 69 volatile compounds were identified and quantified to account for 23.44 mg/L, which included 12 alcohols, 25 esters, 6 acids, 8 aldehydes and ketones, 14 terpenes, and 4 phenols compounds. On the basis of odor activity values, geraniol, benzoic acid ethyl ester, octanoic acid ethyl ester, and 4-vinylguaiacol were identified as the major aroma components in Olea europaea L. wine.

Olea europaea L. wine; volatile compounds; headspace solid-phase micro-extraction; gas chromatographymass spectrometry

TS262.7

A

1002-6630（2014）18-0161-06

10.7506/spkx1002-6630-201418032

2014-01-03

馬騰臻（1989—），男，碩士研究生，研究方向為葡萄酒風味化學及風味酶。E-mail：matengzhen@hotmail.com

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向為果蔬加工及葡萄酒風味化學。E-mail：gsndhsy@163.com