大菱鲆冷藏過程中新鮮度評價

李婷婷，劉劍俠，李學鵬，胡文忠，勵建榮,*

（1.大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連 116600；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼 寧 錦州 121013）

大菱鲆冷藏過程中新鮮度評價

李婷婷1，劉劍俠2，李學鵬2，胡文忠1，勵建榮2,*

（1.大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連 116600；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼 寧 錦州 121013）

為研究大菱鲆冷藏過程中的新鮮度變化規律，以菌落總數、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、腺苷三磷酸關聯物和K相關值（K、Ki、H、Fr、G和P值，魚肉新鮮度的參考指標）為指標，結合感官評定，探究大菱鲆在20 d貯藏期內的品質變化情況。結果表明：肌苷酸和Fr與貯藏時間呈顯著負相關（r=-0.870，r=-0.887）；K值隨貯藏時間延長顯著升高直至趨于穩定（r=0.895）。因此，菌落總數、TVB-N含量、K值、感官評定適宜作為冷藏大菱鲆的新鮮度評價指標，且K值的靈敏度要高于菌落總數和TVB-N含量；TBA值不適宜作為冷藏大菱鲆的新鮮度指標；4 ℃冷藏環境下的大菱鲆貨架期為12 d。

大菱鲆；冷藏；鮮度變化；ATP關聯物

水產品的腐敗變質主要是因為體內與自溶有關的酶和與腐敗有關的微生物的作用。魚類死后，在其體內進行著一系列物理、化學和生理上的變化。在微生物腐敗開始之前，魚肌肉中的自溶酶迅速釋放，隨之生成一系列的化合物，在這些化合物中，ATP及其相關降解物含量是評價魚體新鮮度的最有效指標[1-3]。此外揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值經常配合感官評價和微生物評價共同衡量魚體的新鮮度。

大菱鲆是冷水性的深海比目魚類，原產于英國，主要分布于大西洋東部沿岸的北海和黑海西部，地中海沿岸也有分布[4]。近年來，大菱鲆因其優良口感和豐富的營養價值在我國北方沿海地區形成不斷擴大的養殖規模，產品遠銷歐盟、美國和日本等地，大菱鲆的生產量、銷售量和出口量均居國內前列。這種長距離的運輸極易造成高水分、高蛋白的大菱鲆因滋長微生物而腐敗變質，因此研究冷藏大菱鲆的新鮮度指標變化無疑具有實際的商業價值。鑒于新鮮度對水產品品質及原料的加工適性

有著巨大影響，直接決定產品品質和消費者的消費嗜好，本實驗以4 ℃冷藏環境下的大菱鲆為研究對象，從腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）及其降解物、TVB-N含量和TBA值的變化角度，結合微生物檢測和感官評價來衡量大菱鲆冷藏過 程中的新鮮度變化，以期為大菱鲆保鮮和加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

養殖大菱鲆活魚，產地遼寧省大連市，購于錦州市林西路水產市場，每批次共24 條，每條魚的質量為（700±50）g。

高溫蒸煮袋，購于江蘇省連云港市偉希鋁塑包裝公司。

1.2 儀器與設備

AF-10制冰機 斯科茨曼制冰機系統（上海）有限公司；MLS-3030CH立式高壓滅菌鍋 三洋電機（廣州）有限公司；LRH系列生化培養箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇景集團蘇州安泰技術有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；Kjeltec-8400全自動定氮儀 丹麥Foss公司；1200高效液相色譜 美國安捷倫科技公司；Biofuge Stratos臺式高速離心機 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 貯藏實驗

將鮮活大菱鲆魚置于潔凈泡沫箱中，泡沫箱放于（2.0±0.5）℃冷庫中，采用層魚層冰的方式冷凍致死，然后用無菌蒸煮袋包裝，包裝方式為空氣包裝（非真空非氣調包裝），于（4.0±0.5）℃冰箱中貯藏。在第0、4、8、12、16、20天取樣測定微生物指標、化學指標、感官品質的變化。

1.3.2 樣品處理

大菱鲆背部沿脊椎分開左右兩邊，一邊有內臟，一邊無內臟。微生物指標、感官評定的采樣位置為背部無內臟一側。微生物取樣嚴格無菌操作，取樣工具使用前滅菌處理，取樣環境無菌；其他指標取背部剩余肌肉部分，避開內臟區域，以免內臟破裂影響肉質，絞碎去皮即可。

1.3.3 菌落總數測定

按GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》進行測定，采用平板傾注法計算菌落數測定。

1.3.4 TVB-N含量測定

參考FOSS應用子報[5]測定魚肉中的TVB-N含量。具體方法為：用無氮稱量紙精確稱取10 g左右（精確到0.1 mg）絞碎樣品到750 mL的蒸餾管中，加入1 g MgO和3 滴消泡劑，再加入50 mL蒸餾水到蒸餾管中，用手搖晃混合。

儀器設定的條件為：1%硼酸接收液30 mL，蒸餾時間為5 min，用0.1 mol/L鹽酸標準滴定液。每批樣品扣除試劑空白，TVB-N含量單位為mg N/100 g。

1.3.5 TBA值測定

參考Siu等[6]的TBA值測定方法，稱取10 g攪碎魚肉于燒杯中，加入25 mL蒸餾水和25 mL 10%三氯乙酸，均質，靜置30 min過濾。取5 mL上清液于比色管中，然后向比色管中加入5 mL的 TBA溶液（0.02 mol/L）。將上述混合液在（80±1）℃的恒溫水浴加熱40 min，然后冷卻至室溫，在532 nm波長處測定吸光度。TBA值用丙二醛的質量分數表示，單位為mg MDA/kg。

1.3.6 ATP相關降解產物測定

實驗參考John[7]的方法，經修改后的大菱鲆ATP關聯物的提取方法為：取5 g絞碎的魚肉于燒杯中，向燒杯中加入25 mL高氯酸（0.06 mol/L），充分勻漿后，于1 940×g離心10 min，取出上清液，將其pH值調節至6.5～6.8范圍內。然后于1 940×g再次離心10 min后，取上清液，定容至25 mL。使用前用0.45 μm的濾膜過濾。若長期不用，可于-80 ℃凍藏。

色譜條件：色譜柱BDS C18（250 mm×4.6 mm），以0.04 mol/L KH2PO4和0.06 mol/L K2HPO4混和溶液作為流動相。進樣量為20 μL，液相流速為1 mL/min，柱溫為37 ℃，紫外檢測器波長為254 nm。

ATP及其降解產物標準品HPLC圖譜的測定：ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、肌苷（hypoxanthine ribonucleoside，HxR）和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）單標樣品以及它們的混合標樣在上述色譜條件下進行測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.7 K、Ki、H、Fr、G值和P值

式中：K、Ki、H、Fr、G值和P值均為以ATP降解物為基礎，經過相關數學運算獲得的數值，是用以衡量魚體新鮮度的參考指標。ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分別代表三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤含量/（μmol/g）。

1.3.8 感官評價

大菱鲆冷藏過程中的品質優劣以4 個等級劃分，分別為高品質（E）、較好品質（A）、一般品質（B）和貨架期品質（C）。評價方法參考Minia等[8]并做細微修改，評價過程挑選6 位有經驗的感官評定員，分別從體表、氣味、鰓、眼睛、肌肉和肉味6 方面進行評價。

表1 冷藏大菱鲆感官評定參考表Table 1 Criteria for organoleptic evaluation of refrigerated turbot

1.4 數據處理

采用Origin 7.5繪圖，SPSS 17.0進行方差分析。P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆冷藏過程中菌落總數的變化

圖1 大菱鲆在冷藏過程中菌落總數的變化Fig.1 Changes in total viable counts (TVC) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

大菱鲆在冷藏過程中的菌落總數變化情況如圖1所示。其初始值為2.6（lg（CFU/g）），在貯藏至第12天時菌落總數值達到5.49（lg（CFU/g）），在貯藏至20 d時達到7.59（lg（CFU/g））。本實驗所測得的初始值較崔正翠[9]、Zwietering[10]等的初始值偏低，這可能與魚類生存及捕獲環境、捕獲季節以及捕獲方法有關。按照GB 18406.4—2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》相關規定，菌落總數應不大于6（lg（CFU/g）），以此判斷水產品貨架期終點。由圖1可知，在貯藏的最初12 d內，通過菌落總數表明大菱鲆保持著較好的品質。在整個貯藏期內，大菱鲆的菌落總數值與貯藏時間呈顯著正相關（r=0.984）。

2.2 大菱鲆冷藏過程中TVB-N含量的變化

圖2 大菱鲆 在冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig.2 Changes in total volatile basic nitrogen (TVB-N) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

研究[11-12]表明，新鮮屠宰的魚肉中TVB-N含量一般維持在5～20 mg N/100 g，當肌肉中TVB-N含量達到30～35 mg N/100 g時樣品已到達冷藏魚類的感官拒絕極限。由圖2可知，TVB-N含量在貯藏期內由最初的10.23 mg N/100 g上升到最終的59.64 mg N/100 g，一直表現出持續升高的趨勢。在貯藏至12 d時TVB-N含量達到26.15 mg N/100 g，貯藏至16 d時達到40.45 mg N/100 g，達到感官拒絕期。一般認為，TVB-N類化合物主要是由于細菌的分解代謝產生的，所以貯藏至16 d時較高的菌落總數值（6.88（lg（CFU/g）））與較高的TVB-N含量有很好的相關性（r=0.953）。相似的結論也在眾多的國外研究中有所體現[13-14]。

2.3 大菱鲆冷藏過程中TBA值的變化

圖3 大菱鲆在冷藏過程中TBA值的變化Fig.3 Changes in thiobarbituric acid (TBA) of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

TBA值被廣泛應用于衡量脂肪氧化的程度。但魚體的脂肪氧化與魚的種類、貯藏溫度、脂肪含量等眾多因素有關[15]。對冷藏大菱鲆而言，該值表現出先升高后降低的趨勢。與此類似，較低的TBA含量也在其他多種魚

中觀察到，例如海鱸魚[14]中。早在1993年，Auburg[16]就指出TBA值并不能很好地表征脂肪的氧化情況，原因在于丙二醛可以和魚體的其他成分發生反應，這些成分可能是胺類、核苷和核苷酸、蛋白質、磷脂類氨基酸以及醛類化合物，這些物質的產生終止了脂肪氧化的進程，其相互作用也因魚的種類不同而表現出很大差別，故從圖3的數據顯示了在初始4 d的貯藏期過后冷藏大菱鲆TBA值不斷下降的現象。根據研究結果表明TBA值不能夠反映冷藏大菱鲆的新鮮度變化。

2.4 ATP相關降解產物

魚類死亡后其肌肉核苷酸會發生一系列的變化，肌肉內ATP依次降解為ADP、AMP、IMP、HxR和Hx，隨著ATP向Hx轉化，HxR和Hx所占比例越來越多，而魚的新鮮度則越來越差。圖4為大菱鲆20 d冷藏過程中ATP關聯物的變化情況。由圖4可知，IMP的初始含量為2.04 μmol/g，其在魚肉中的含量在0～8 d的貯藏期內急劇下降，隨后下降趨勢較為平緩，至貯藏末期趨于穩定；在此過程中，HxR值呈現上升趨勢，且一直保持在較高水平；AMP值有小幅度的下降，但其在魚肉中的含量一直保持在0.5～1.0 μmol/g之間。ATP、ADP和Hx值較小，基本保持在0.0～0.25 μmol/g之間。有研究發現水產品死后ATP向IMP的降解與其體內的肌肉內源酶有關，而其快速降解則有賴于其體內ATP酶的高活性[17]。Watabe等[18]認為這種現象是由于水產動物在死后最初階段，肌細胞中肌漿網的Ca2+吸附能力下降，使Ca2+大量釋放到胞液中，促使肌原纖維內Ca2+的濃度增加，進而激活了肌原纖維ATP酶的活性，使ATP迅速降解。此外，有研究認為，ATP降解為ADP、AMP和IMP最快可在數小時內完成，從而使IMP達到峰值，而IMP進一步降解為HxR和Hx的過程卻相對緩慢，視魚種和貯藏條件的不同可以持續幾天至十幾天乃至更長時間[19]。如圖4所示，本實驗未觀測到ATP、ADP的快速降解過程，而IMP不斷下降，HxR不斷積累，在貯藏末期略有下降，Hx也呈現不斷累積增長的趨勢。

圖4 大菱鲆冷藏過程中ATP關聯物的變化Fig.4 Changes in ATP-related compounds of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

IMP是ATP降解的中間產物，也是魚蝦等水產品的重要鮮味物質，新鮮魚類的鮮味口感與高含量的IMP緊密相關。但HxR和Hx的累積卻會使魚肉產生苦味和異味，因此近年來有學者提出采用Hx作為魚肉鮮度評價的指標[20]。但本研究中，Hx的累積量在整個貯藏期內還不足0.25 μmol/g，顯然不足以衡量魚體的新鮮與否。這可能與魚種和貯藏溫度有關[21]，不同魚種分解產生HxR和Hx的含量有所差異，不同貯藏溫度也會影響兩者的累積方式。

2.5 K、Ki、H、Fr、G值和P值

K值是以分析肌肉中ATP及其降解產物的含量為基礎，通過進一步計算得到的一個指標，它能夠反映水產品在低溫貯藏前期的新鮮度變化。圖5反映了冷藏過程中K、Ki、H、Fr、G值和P值的變化情況。K、Ki、H、Fr、G和P的初始值分別是22.66%、30.24%、0.34%、69.76%、23.68%和23.62%；貯藏至20 d時這系列值分別達到69.90%、99.15%、8.73%、0.85%、79.72%和74.49%。在整個貯藏過程中，K、Ki、G值和P值在貯藏初期迅速增加，之后趨于穩定；Fr值迅速下降，之后趨于穩定；H值有小幅度的上升，但其漲幅遠小于K、Ki、G值和P值。K值的變化趨勢與?zogul等[22]的研究結果極為相似。Alasalvar等[23]研究發 現K、Ki、G值與冰藏歐洲海鯛新鮮度變化具有高度相關性（r =0.99）。?zogul等[22]認為4 ℃貯藏的野生白鯰魚的K、Ki、G值和H值快速上升是由于IMP迅速消耗導致。一般認為，K值在20%以下時為一級新鮮度，20%～40%為二級新鮮度，60%～80%為初期腐敗[24]。本研究中新鮮屠宰后的大菱鲆其K值達到22.66%，偏離了一級新鮮度的標準（＞20%），這可能與魚種和屠宰方式有關。K值的大幅度升高在0～8 d的貯藏期內表現明顯，第8天的K值達到62.63%，因此推測大菱鲆在4 ℃冷藏至第8天時已出現初期腐敗，但這種腐敗作用于魚體內部肌肉中，可能還未被其他檢測手段檢測到。本研究認為K值及其相關值可作為評價大菱鲆新鮮度的指標，且具有高度靈敏性。但是?zyurt等[25]則研究認為K值和Ki值不適宜作為冰藏土耳其梭鱸的新鮮度指標，這說明K值能否作為評價魚體新鮮度的指標與魚種有關。

圖5 大菱鲆冷藏過程中K、Ki、H、Fr、G值和P值的變化Fig.5 Changes in K, Ki, H, Fr, G and P values of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

2.6 感官評定

由表2可知，大菱鲆在4 ℃冷藏過程中，其各個測定指標在前8 d保持較好品質，但在第12天時，鰓和眼睛已

達到貨架期品質。這說明，在外觀的直觀評價中，鰓和眼睛是指示大菱鲆品質的首要指標；而大菱鲆的肌肉品質之所以在第4天時仍保持著和第0天時的高品質可能與魚類死后，貯藏初期的僵直情況有關。崔正翠等[9]研究認為，養殖大菱鲆在3 ℃貯藏時其較好品質期在197 h，這與本實驗的8～12 d基本吻合。

表2 大菱鲆冷藏過程的感官評價Table 2 Organoleptic evaluation of Scophthalmus maximus during refrigerated storage

表3 大菱鲆冷藏條件下各指標的相關性分析Table 3 Correlation of freshness indicators forScophthalmus maximus during refrigerated storage

2.7 大菱 鲆各指標的相關性分析

由表3可知，大菱鲆在低溫貯藏過程中菌落總數、TVB-N值、Hx、H值和G值與貯藏時間呈極顯著正相關（P＜0.01）；IMP、ATP、HxR、K值、Ki值、Fr值和P值與貯藏時間顯著相關（P＜0.05）。其中菌落總數與貯藏時間的相關性最大（r=0.984）；其次為H值（r=0.972）和TVB-N含量（r=0.957）；ATP相關降解物中，除ADP和ATP與貯藏時間相關性不明顯外，均與貯藏時間表現出較強的相關性；K值等相關值除Fr與貯藏時間呈顯著負相關之外（r=-0.887），其他均呈正相關。此外，K值和Ki值，P值和G值，Fr值與IMP值，P值與Ki值，P值與K值均表現極顯著正相關，相關性高達0.999。由此推測，在大菱鲆的冷藏過程中，對K值及其相關值而言，K值或Ki值在衡量魚體新鮮度上可以互相取代，G值和H值隨貯藏時間的延長增長趨勢較其他值更為明顯，宜選擇K值（Ki值）、G值和H值共同衡量大菱鲆新鮮度。

3 結 論

大菱鲆在4 ℃冷藏過程中，其菌落總數、TVB-N含量隨著貯藏時間延長而不斷升高，與貯藏時間呈極顯著相關；TBA變化情況與貯藏時間無相關性，但其與菌落總數和TVB-N含量均呈顯著負相關，這說明脂肪氧化與細菌的大量繁殖以及蛋白質分解有關；ATP關聯物（ADP、AMP除外）在魚肉中的含量隨貯藏時間變化明顯，且HxR的累積速度遠高于Hx的累積速度。ATP關聯物和K值等相關值（包括Ki、G和H值）能夠在一定程度上反映魚體新鮮程度，且其靈敏性要高于菌落總數和TVB-N含量；根據菌落總數值、TVB-N含量、K值等相關值和感官評定的結果，表明大菱鲆在8～12 d出現初期腐敗，貯藏至12 d已完全達到貨架期水平。

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Freshness Evaluation of Turbot (Scophthalmus maximus) during Refrigerated Storage

LI Ting-ting1, LIU Jian-xia2, LI Xue-peng2, HU Wen-zhong1, LI Jian-rong2,*
(1. College of Life Science, Dalian Nationality of University, Dalian 116600, China; 2. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, Institute of Food Science Research, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

In order to evaluate the freshness of turbot (Scophthalmus maximus) during refrigerated storage, the changes in total viable counts (TVC), total volatile basic nitrogen (TVB-N), thiobarbituric acid (TBA), ATP-related compounds and K value were investigated by periodical determination. The results showed that IMP and Fr exhibited a significantly negative correlation (r = -0.870, r = -0.887). K value increased significantly with the extension of storage time until reaching a stable level (r = 0.895). TVC, TVB-N and K values and sensory evaluation could be applied as indexes for freshness evaluation. Furthermore, the sensitivity of K value was higher when compared with the values of TVC and TVB-N; TBA value was not appropriate for the freshness evaluation of refrigerated turbot. Based on the microbiological, physical and chemical changes observed throughout the storage period 4 ℃, the shelf life of turbot was 12 days.

turbot; refrigerated storage; freshness change; ATP-related compounds

S983

A

1002-6630（2014）18-0190-06

10.7506/spkx1002-6630-201418037

2013-11-30

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301572）；中國博士后科學基金項目（2014M552302）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；遼寧省自然科學基金博士啟動項目（20131003）

李婷婷（1978—），女，副教授，博士，研究方向為水產品貯藏加工及質量安全控制。E-mail：tingting780612@163.com

*通信作者：勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產品和果蔬貯藏加工及質量安全控制。E-mail：lijr6491@163.com