RGD修飾的腺病毒介導的ING4對人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的影響

王奕鴻，劉濟生，盛偉華，楊吉成

RGD修飾的腺病毒介導的ING4對人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的影響

王奕鴻，劉濟生，盛偉華，楊吉成

目的研究RGD修飾的腺病毒介導的ING4對人鼻咽癌細胞(CNE)裸鼠移植瘤的影響并探討其可能調節機制。方法 用RGD修飾的ING4單基因腺病毒載體(Ad．RGD-ING4)及腺病毒空載體(Ad．RGD-GFP)感染CNE細胞，RT-PCR法及Western blot法檢測ING4基因的表達水平。采用CNE細胞株來建立15只人鼻咽癌裸鼠模型，分為PBS組、Ad．RGD-GFP及Ad．RGD-ING4組，每組5只。分別對瘤體內局部注射相應的干預用藥，動態測量腫瘤體積，免疫組化檢測Caspase-3基因的表達。結果 CNE細胞感染Ad．RGD-ING4 72 h后，ING4在CNE細胞中過表達，Ad．RGD-ING4組腫瘤體積明顯小于PBS組及Ad．RGD-GFP組(P＜0．01)，免疫組化結果顯示Ad．RGD-ING4組比其余兩組Caspase-3基因的表達明顯上調(P＜0．01)。結論 Ad．RGD-ING4抑制人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的生長，可能的機制是通過上調Caspase-3基因促進腫瘤細胞凋亡。

Ad．RGD-ING4;鼻咽腫瘤;基因，腫瘤;Caspase-3;裸鼠

鼻咽癌為我國發病率較高的腫瘤之一，大多為 低分化鱗癌，治療以放療或放化療結合為主，但因其位置隱蔽，早期癥狀不典型，所以早期診斷及治療比例低，遠處轉移率及復發率均較高。且因放療或放化療毒性作用及并發癥較多，患者的依從性、耐受性仍然較差。隨著科研水平的提高，我們對鼻咽癌的研究也越來越深入，生物基因治療鼻咽癌的作用也日漸引起普遍關注。基因治療是一種具有巨大潛力的新型腫瘤治療策略。尤以腺病毒基因重組表達載體的腫瘤基因治療研究應用較多。近年來發現和命名的 ING4是一種新型抑癌基因，于2003年被Shiseki等［1］鑒定，2004年在Nature雜志正式被認定為一種重要的腫瘤生長抑制因子［2］，其可以通過多種途徑發揮特異性抗腫瘤效應，靶向誘導腫瘤細胞凋亡。因此，本研究用RGD修飾的ING4單基因腺病毒載體(Ad．RGD-ING4)感染人鼻咽癌細胞(CNE)裸鼠移植瘤，觀察腫瘤的生長情況，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑 雌性BALB/c裸鼠15只，4周齡，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。Ad．RGD-ING4和RGD修飾的腺病毒空載體(Ad．RGD-GFP)由蘇州大學基礎醫學院細胞和分子生物學教研室提供。CNE購自南京凱基生物有限公司，小牛血清及RPMI-1640購自GIBGO公司;各上下游引物購自南京金斯瑞生物技術有限公司;小鼠抗人ING4抗體購自Santa Crutz公司;β-actin抗體購自上海碧云天生物技術有限公司，Dylight 800-Labeled Antibody熒光二抗購自美國KPL公司。Caspase-3抗體購自ABCAM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:含10%小牛血清的1640培養液培養CNE細胞，置37℃、5%CO2的細胞培養箱中，待細胞長滿培養瓶，用0．25%胰酶進行消化傳代。

1.2.2 測定RGD修飾的重組腺病毒對CNE的最佳感染復數(MOI):將對數生長期的CNE稀釋成濃度為105/ml的細胞懸液，按每孔100μl接種于96孔板，繼續培養。于24 h后將 Ad．RGD-GFP(1×109pfu/ml)分別以 MOI為 1、10、25、50、100、200 感染CNE，繼續培養。每組各設5個復孔，72 h后觀察細胞，細胞形態正常、以熒光強度達80%以上的最低感染劑量組為最佳MOI，實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR及Western blot鑒定ING4基因的轉錄及翻譯:將細胞分為CNE細胞對照組(PBS組):1 ×105/ml CNE+0．1 mol/L PBS;腺病毒空載體對照組(Ad．RGD-GFP組):1×105/ml CNE+最佳MOI Ad．RGD-GFP;ING4單基因治療實驗組(Ad．RGD-ING4組):1×105/ml CNE+最佳 MOI Ad．RGD-ING4。按上述分組用 PBS、Ad．RGD-GFP、Ad．RGD-ING4處理處于對數生長期的CNE細胞，感染72 h收集細胞用Trizol法分別抽提總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，用GAPDH-F:5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3'、GAPDH-R:5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3';ING4-F:5'-GCAAGCTTCTATTTCTTCTTCCGTTCTTGGGAG-3'、ING4-R:5'-ATTTGCGGCCGCATGGGGGTACTGCTCACACAGA-3'引物，參考PCR說明書并摸索退火溫度進行PCR，檢測腺病毒介導的外源性ING4基因在CNE細胞中的轉錄，實驗重復3次。同上收集上述細胞，提取總蛋白上清，以4∶1比例與5×SDS蛋白上樣緩沖液充分混勻，100℃煮沸5 min，然后進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠、分離膠濃度分別為5%、12%)，再把蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉將PVDF膜封閉后，分別用鼠抗人-actin抗體和鼠抗人ING4稀釋液作用，用TBST洗滌3次，再分別加Dylight-800標記的熒光二抗，37℃避光1 h，TBST避光洗滌3次/5 min;最后在熒光成像儀上進行拍照，以上實驗重復3次。

1.2.4 CNE裸鼠移植瘤模型的建立:用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基培養CNE細胞，放置在5%CO2、37℃的培養箱中。先用PBS洗滌處于對數生長期的CNE細胞，用0．25%胰酶消化，并離心5 min，收集細胞，并制備5．0×107/ml的細胞懸液。取4周齡SPF級BALB/c雌性裸鼠15只，裸鼠右前腋下用安爾碘常規消毒后，每只裸鼠皮下注射100μl的細胞懸液，并觀察CNE細胞在裸鼠右前腋下成瘤情況。

1.2.5 實驗的分組及處理方法:裸鼠皮下接種CNE 2周左右，待腫瘤長至200 mm3左右時，計為第0天，將裸鼠隨機分成3組，每組5只，瘤體內多點注射干預藥物，隔日1次，共注射6次。PBS組:每次注射100μl PBS;Ad．RGD-GFP組:每次注射1×109pfu/ml Ad．RGD-GFP 100 μl;Ad．RGD-ING4 組:每次注射1×109pfu/m l Ad．RGD-ING4 100 μl。

1.2.6 瘤體體積觀察:第1次治療前(記為0 d)及開始治療后每隔1 d用游標卡尺測量各組裸鼠瘤體的長徑(a)、短徑(b)，從而計算腫瘤體積V=(a×b2)/2，共測量8次，觀察不同時間移植瘤體積變化，并進一步分析Ad．RGD-ING4對裸鼠CNE移植瘤的抑瘤作用。

1.2.7 免疫組化檢測:治療15 d后，將裸鼠脫頸處死摘取瘤體，將各實驗組的瘤體組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋并行組織切片，進行HE染色和免疫組化檢測。HE染色用來觀察各瘤體組織中細胞形態的變化，初步判斷CNE細胞的凋亡情況。用免疫組化檢測Caspase-3在CNE移植瘤中表達，以細胞質或細胞核內出現棕褐色或棕黃色顆粒為陽性細胞。將每組的每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6．0軟件對每張照片進行分析，從而得出每張照片的累積光密度值即IOD值。IOD值越大，表示陽性表達越強。而每組所有照片的平均IOD值代表該實驗組的IOD值。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16．0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 RGD修飾的重組腺病毒的最佳MOI Ad．RGD-GFP 組中，MOI為 1、10、25、50、100 的 CNE 細胞熒光強度分別為5%、20%、55%、95%、98%，所感染的CNE細胞形態均正常，且生長良好，而MOI為200組中CNE細胞出現脫落、細胞形態發生變化，出現細胞毒性作用，并呈現強熒光100%;而MOI為50、100組均未見細胞毒性，并且有＞90%的CNE表達GFP熒光蛋白，提示腺病毒感染CNE細胞的最佳MOI為50劑量組。

2.2 ING4在CNE細胞中的表達 RT-PCR結果顯示，Ad．RGD-ING4組在750 bp位置可檢測到1條ING4特異性條帶;Western blot顯示Ad．RGD-ING4在相應位置可產生和抗ING4抗體結合的特異性條帶，而PBS組和Ad．RGD-GFP組均沒有出現相應的上述條帶，見圖1。RT-PCR及 Western blot鑒定Ad．RGD-ING4能介導外源性ING4基因在CNE細胞中成功轉錄及翻譯。

2.3 CNE細胞裸鼠模型的建立 在裸鼠右前腋下的皮下接種CNE細胞，3 d內可見接種處皮丘慢慢變小，5 d后變成實性結節并逐漸增大，8 d后瘤體直徑約1 cm，裸鼠成瘤率為100%(15/15)。

2.4 移植瘤體積的變化 治療2周后，Ad．RGDING4組腫瘤體積增長緩慢，出現明顯的抑瘤作用，從治療第8天開始，Ad-ING4組的腫瘤體積與PBS組、Ad．RGD-GFP組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，而PBS組和Ad．RGD-GFP組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2、表1。

圖1 RGD修飾的重組腺病毒介導的ING4在人鼻咽癌細胞中的表達

圖2 3組裸鼠移植瘤體積－時間變化曲線

表1 3組裸鼠移植瘤體積隨時間變化情況(±s，cm3)

表1 3組裸鼠移植瘤體積隨時間變化情況(±s，cm3)

注:PBS組為CNE細胞對照組，Ad．RGD-GFP組為空病毒載體對照組，Ad．RGD-ING4組為ING4單基因治療實驗組;與PBS組同時間比較，b P ＜0．01，與 Ad．RGD-GFP 組同時間比較，d P ＜0．01

0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d組別 鼠數PBS 組 5 0．200 ±0．015 0．226 ±0．020 0．346 ±0．021 0．482 ±0．039 0．661 ±0．041 0．833 ±0．056 0．938 ±0．061 1．012 ±0．068 Ad．RGD-GFP 組 5 0．203 ±0．018 0．228 ±0．019 0．345 ±0．023 0．463 ±0．036 0．653 ±0．039 0．832 ±0．051 0．931 ±0．065 0．991 ±0．063 Ad．RGD-ING4 組 5 0．200 ±0．012 0．228 ±0．015 0．284 ±0．019 0．371 ±0．033 0．482 ±0．039bd 0．544 ±0．042bd 0．592 ±0．052bd 0．624 ±0．057 bd

2.5 移植瘤組織細胞形態學 PBS組和Ad．RGDGFP組中腫瘤細胞基本上形態正常，包膜完整，而Ad．RGD-ING4組中有部分細胞出現細胞膜不完整，細胞質濃縮，細胞核固縮、裂解或溶解，組織間有空泡形成，見圖3。

2.6 移植瘤組織中Caspase-3的表達 Caspase-3的 IOD 值 PBS 組為 1801．30 ±167．36，Ad．RGDGFP組為 1829．73 ±165．23，Ad．RGD-ING4 組為6350．61 ±548．15。Ad．RGD-ING4 組 Caspase-3 的IOD值顯著高于 PBS組和 Ad．RGD-GFP組(P＜0.01)。RGD-ING4組 Caspase-3陽性細胞數多于PBS組和 Ad．RGD-GFP組，見圖4。

圖3 裸鼠人鼻咽癌細胞移植瘤組織細胞形態學觀察(HE×200)

圖4 裸鼠人鼻咽癌細胞移植瘤中Caspase-3的表達(EnVision×200)

3 討論

目前基因治療與放療、化療及細胞因子等聯合應用已成為研究熱點之一，而選擇合適的治療基因是鼻咽癌基因治療的關鍵。ING4基因在神經膠質瘤、頭頸癌細胞等多種腫瘤中表達水平明顯降低，而且與腫瘤發生、惡性程度、增殖和預后密切相關。在本實驗中可以看到，鼻咽癌CNE細胞中ING4基因已基本失去表達，故我們選擇重組腺病毒介導的ING4基因感染鼻咽癌細胞，使ING4基因在鼻咽癌細胞中出現過表達，從而發揮其抑癌功效。

前期已有文獻［3-5］顯示，ING4對肺癌、胰腺癌等腫瘤具有抑制生長、促進腫瘤細胞凋亡等作用。在本實驗中，我們選擇RGD修飾的腺病毒介導的ING4來研究ING4對鼻咽癌裸鼠移植瘤影響。RGD肽是一類含有精氨酸－甘氨酸－天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，在腫瘤細胞及腫瘤血管內皮細胞表面通常呈高表達［6］，而在很多正常細胞膜表面αvβ3表達缺失［7］。因此，通過對腺病毒載體進行改造，使其衣殼蛋白表面表達RGD，可以明顯提高載體的感染效率。

目前研究表明，細胞凋亡是一個受嚴格調控的能量依賴性的自殺程序，細胞凋亡的途徑主要有兩條:內源性途徑(線粒體)和外源性途徑(死亡受體途徑)。外源性途徑通過細胞表面的死亡受體配體結合而活化，主要管理免疫選擇和炎癥。內源性途徑通過一些細胞內的刺激如電離輻射、化療藥物激活，通過Bcl-2家族中促凋亡基因(如Bax)及抗凋亡基因(如Bcl-2)的調控，特別是有研究發現，Bcl-2/Bax比率的升高可以引起細胞線粒體膜的通透性增加，釋放出細胞色素C(Cyt-c)，介導凋亡體的生成，從而激活細胞質中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)［8-14］。最終，這兩種途徑所誘發的細胞凋亡都是通過起始 Caspase(如 Caspase-2，8，9，10)在外來蛋白信號的作用下被切割激活，起始Caspase激活執行者 Caspase(如 Caspase-3，6，7)，從而導致程序性細胞死亡［15-16］。其中，Caspase-3基因是Caspase大家族中重要的功能執行者，是細胞凋亡中的主要效應因子，也是細胞凋亡過程中的關鍵酶，大多數觸發細胞凋亡的因素，最終均需要通過Caspase-3活化成Cleaved-Caspase-3，從而介導信號傳導途徑導致細胞凋亡［17-20］。本實驗結果表明，Ad．RGD-ING4組裸鼠移植瘤較PBS組和Ad．RGDGFP組生長明顯受到抑制，HE染色提示細胞凋亡數增多，免疫組化示Caspase-3的表達明顯升高。

綜上所述，Ad．RGD-ING4可以明顯抑制人鼻咽癌細胞CNE裸鼠移植瘤的生長，其機制可能與明顯上調凋亡基因Caspase-3表達有關。本文為 Ad．RGD-ING4基因治療鼻咽癌提供了依據，為其臨床應用奠定了基礎。

［1］ Shiseki M，Nagashima M，Pedeux R M，et al．p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300，and enhance p53 activity［J］．Cancer Res，2003，63(10):2373-2378．

［2］ Garkavtsev I，Kozin SV，Chernova O，et al．The candidate tumor suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis［J］．Nature，2004，428(6980):328-332．

［3］ Xie Y，ShengW，Miao J，etal．Enhanced antitumor activity by combining an adenovirus harboring ING4 with cisplatin for hepatocarcinoma cells［J］．Cancer Gene T-her，2011，18(3):176-188．

［4］ Ling C，Xie Y，Zhao D，et al．Enhanced radiosensitivity of non-small-cell lung cancer(NSCLC)by adenovirusmediated ING4 gene therapy［J］．Cancer Gene Ther，2012，19(10):697-706．

［5］ Zhao Y，Su C，ZhaiH，etal．Synergistic antitumor effect of adenovirus-mediated hING4 gene therapy and(125)I radiation therapy on pancreatic cancer［J］．Cancer Lett，2012，316(2):211-218．

［6］ Schnell O，Krebs B，Wagner E，et al．Expression of integrin alphavbeta3 in gliomas correlates with tumor grade and is not restricted to tumor vasculature［J］．Brain Pathol，2008，18(3):378-386．

［7］ Schnell O，Krebs B，Carlsen J，etal．Imaging of integrin alpha(v)beta(3)expression in patients with malignant glioma by［18F］Galacto-RGD positron emission tomography［J］．Neuro Oncol，2009，11(6):861-870．

［8］ Korsmeyer SJ，Shutter JR，Veis D J，etal．Bcl-2/Bax:a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death［J］．Semin Cancer Biol，1993，4(6):327-332．

［9］ Katiyar S K，Roy A M，Baliga M S．Silymarin induces apoptosis primarily through a p53-dependent pathway involving Bcl-2/Bax，cytochrome crelease，and caspase activation［J］．Mol Cancer Ther，2005，4(2):207-216．

［10］ Zhou C，Li X，Du W，etal．Antitumor effects of ginkgolic acid in human cancer cell occur via cell cycle arrest and decrease the Bcl-2/Bax ratio to induce apoptosis［J］．Chemotherapy，2010，56(5):393-402．

［11］ Didonna A，Sussman J，Benetti F，et al．The role of Bax and caspase-3 in doppel-induced apoptosis of cerebellar granule cells［J］．Prion，2012，6(3):309-316．

［12］ Lee JS，JungW K，Jeong M H，et al．Sanguinarine induces apoptosis of HT-29 human colon cancer cells via the regulation of Bax/Bcl-2 ratio and caspase-9-dependent pathway［J］．Int JToxicol，2012，31(1):70-77．

［13］ Lei L，Wang J，Zhang Z，et al．Lipopolysaccharide-induced apoptosis in amurine intestinal endocrine cell line bymodulation of Bcl-2，Bax and caspase-3［J］．Mol Med Rep，2013，8(6):1649-1654．

［14］ Biswas R，Chung PS，Moon JH，et al．Carboplatin synergistically triggers the efficacy of photodynamic therapy via caspase 3-，8-，and 12-dependent pathways in human anaplastic thyroid cancer cells［J］．Lasers Med Sci，2013，10:232-234．

［15］ Riedl SJ，ShiY．Molecularmechanisms of caspase regulation during apoptosis［J］．NatRev Mol Cell Biol，2004，5(11):897-907．

［16］ You B R，Park W H．Zebularine inhibits the growth of HeLa cervical cancer cells via cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis［J］．Mol Biol Rep，2012，39(10):9723-9731．

［17］ Seshadri P，Rajaram A，Rajaram R．Plumbagin and juglone induce caspase-3-dependent apoptosis involving the mitochondria through ROSgeneration in human peripheral blood lymphocytes［J］．Free Radic Biol Med，2011，51(11):2090-2107．

［18］ Simon D J，Weimer R M，McLaughlin T，et al．A caspase cascade regulating developmental axon degeneration［J］．JNeurosci，2012，32(49):17540-17553．

［19］ Oskoueian E，Abdullah N，Ahmad S．Phorbolesters from jatropha meal triggered apoptosis，activated PKC-delta，caspase-3 proteins and down-regulated the proto-oncogenes in MCF-7 and HeLa cancer cell lines［J］．Molecules，2012，17(9):10816-10830．

［20］ Berger A K，Danthi P．Reovirus activates a caspase-independent cell death pathway［J］．MBio，2013，4(3):178-213．

Effect of Adenovirus-mediated RGD-ING4 on Transplantation Tumor Induced by Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell in Nude Mice

WANG Yi-hong1，LIU Ji-sheng1，SHENGWei-hua2，YANG Ji-cheng2(1 DepartmentofOtolaryngology，the First Hospital Affiliated to Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215006，China;2．Departmentof Cytology and Molecular Biology，College of Basic Medicine of Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215123，China)

ObjectiveTo study the effect of Ad．RGD-ING4(adenovirus-mediated，Ad．)on transplantation tumor induced by human nasopharyngeal carcinoma cell CNE in nudemice and to investigate its possiblemechanisms．MethodsThe expression of ING4 gene in CNE cells，which were infected by Ad．RGD-ING4 or Ad．RGD-GFP，was detected by RT-PCR and Western blotmethods respectively．The 15models of human nasopharyngeal carcinomawere established with CNE cell strain in nudemice，and were divided into phosphate buffered sodium(PBS)group(n=5)，Ad．RGD-GFP group(n=5)and Ad．RGD-ING4 group(n=5)．Allmice underwent correspondingmulti-points injection in tumor respectively，the volume of tumor was measured dynamically，and the expressions of Caspase-3 gene in tumor sampleswere detected by immunohistochemistrymethod．ResultsThe ING4 protein was excessively expressed in the CNE cells after 72 h of being transfected by Ad．RGD-ING4．The tumor volume of Ad．RGD-ING4 group was significantly smaller than those of PBSand Ad．RGD-GFP groups(P ＜0．01)，and immunohistochemistry result showed that the expression of Caspase-3 gene was increased significantly in Ad．RGD-ING4 group compared with those in the other two groups(P ＜0．01)．ConclusionAd．RGD-ING4may inhibit the growth of transplantation tumor induced by human nasopharyngeal carcinoma cells in node mice，and up-regulation of Caspase-3 gene expression may accelerate tumor apoptosis．

Ad．RGD-ING4;Nasopharyngeal neoplasm;Gene，neoplasm;Caspase-3;Nudemouse

R739．6;R-332

A

2095-140X(2014)04-0050-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．04．015

蘇州市科技計劃項目(SYS201014)

215006江蘇蘇州，蘇州大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科(王奕鴻、劉濟生);215006江蘇 蘇州，蘇州大學基礎醫學院細胞與分子生物學教研室(盛偉華、楊吉成)

劉濟生，E-mail:ljswwq@sina．com

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2013-11-18 修回時間:2014-01-18)

·論著·