攜帶LMO3基因逆轉錄病毒載體的構建及其在NIH/3T3細胞中的表達

羅 蕓，張新宇，萬東君，劉曉花，付學鋒

攜帶LMO3基因逆轉錄病毒載體的構建及其在NIH/3T3細胞中的表達

羅 蕓，張新宇，萬東君，劉曉花，付學鋒

目的構建單純LIM蛋白3(LMO3)的逆轉錄表達載體，并觀察其在NIH/3T3細胞中的表達情況。方法 重組載體pLXSN-LMO3經酶切及測序鑒定后，脂質體法轉染到pA317包裝細胞，G418篩選穩定的病毒產生細胞株。重組逆轉錄病毒體外感染NIH/3T3，并對其進行病毒滴度檢測，NIH/3T3細胞分為3組:以pLXSN-LMO3轉染為實驗組，以pLXSN轉染為陰性對照組，正常細胞為空白對照組。采用免疫熒光組化染色和蛋白印跡(Western blot)法鑒定NIH/3T3細胞中LMO3的表達。結果 重組逆轉錄病毒載體pLXSN-LMO3經酶切及測序鑒定構建正確，其病毒滴度平均可達4.04×106cfu/ml，各組NIH/3T3細胞免疫熒光組化染色及Western blot檢測均有LMO3蛋白表達，其中實驗組高表達LMO3，與陰性對照組、空白對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論 成功構建了攜帶LMO3基因逆轉錄病毒載體，并能在NIH/3T3細胞中高表達LMO3蛋白，為下一步開展基因治療奠定了基礎。

單純LIM蛋白3;NIH/3T3細胞;逆轉錄病毒科感染;pLXSN

LIM蛋白是一類富含半胱氨酸且有一個或多個鋅指結構的蛋白家族，含有一段高度保守氨基酸序列 CX2CX17-19HX2CX2CX16-20CX2C/H/D，即 LIM結構域［1］。單純LIM蛋白(LIM domain only，LMO)有N末端兩個串聯的LIM結構域和C末端其他序列組成，因無DNA結合的同源結構域，必須與其他多種轉錄調控分子結合形成復合物，在機體的分化和發育過程中發揮重要作用［2］。本實驗構建了LMO3的逆轉錄表達載體，篩選出穩定的產毒細胞株，并且通過感染NIH/3T3細胞，用免疫組化染色及蛋白印跡(Western blot)法檢測其蛋白表達情況，為下一步開展基因治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 限制性內切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA連接酶及其他各種工具酶均購自TaKaRa公司;Taq Plus IDNA聚合酶、dNTPS購自上海生工生物公司;LipofectamineTM 2000轉染試劑購自Invitrogen公司;質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自安徽優晶生化工程有限公司;DMEM/F12培養基、G418購自Gibco公司;胎牛血清為杭州四季青公司產品;菌株E.coil DH5α、質粒pEGFP-cl-LMO3、逆轉錄病毒載體 pLXSN、兔抗人LMO3多克隆抗體、pA317細胞株和NIH/3T3細胞株均為筆者所在實驗室保存。兔抗β-Actin單克隆抗體、羊抗兔IgG/TRITC為上海中山生物公司產品。LMO3的引物合成及基因測序均由上海生工生物公司完成。上游引物5＇-TAGAATTCTATGCTCTCAGTTCAGCCAG-3＇(EcoR I);下游引物 5＇-TAGGATCCGATGTAGTGCTTTGCATTGTTGG-3＇(BamH I)。HF90型CO2恒溫培養箱為上海力申公司產品;IX71型熒光倒置生物顯微鏡為日本Olympus公司產品;D77型凝膠成像分析系統為英國UVITEC公司產品;ChemiDoc型化學發光成像系統為美國UVP公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 攜帶LMO3基因的逆轉錄病毒載體的構建:質粒pEGFP-cl-LMO3及逆轉錄病毒載體質粒pLXSN，經EcoR I及BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。將雙酶切后的LMO3片段和pLXSN載體按2∶1混合后，用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化E.coil DH5α感受態細菌，涂勻于氨芐西林抗性LB平板，37℃培養過夜。挑取克隆菌落，擴增并提取質粒，對質粒分別進行 EcoR I及BamH I雙酶切和PCR鑒定，LMO3酶切片段委托上海生工生物公司進行測序。

1.2.2 逆轉錄病毒載體的包裝和穩定轉染:取pA317對數生長期細胞，按1×105個/孔接種于24孔培養板中，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書方法，NIH/3T3細胞為空白對照組，將重組逆轉錄病毒載體pLXSN-LMO3(實驗組)和陰性對照載體pLXSN(陰性對照組)轉染至pA317包裝細胞。無血清、無雙抗的DMEM培養基37℃、50 m l/L CO2培養4 h，更換含100 ml/L胎牛血清的完全培養基繼續培養。24 h后傳代并以0.9 g/L濃度的G418進行抗性篩選，每3 d換液1次。連續培養2周后，大量非轉染細胞死亡，更換為含0.4 g/L G418的培養基繼續抗性穩定篩選，直至克隆出現。采用有限稀釋法培養至單克隆出現后，進行擴增穩定傳代。當轉染的pA317細胞融合達80%左右時，更換無G418培養基繼續培養24 h后，回收培養上清，0.45μm低蛋白吸附，醋酸纖維濾膜過濾，獲得逆轉錄病毒上清，-70℃儲存備用。

1.2.3 逆轉錄病毒上清病毒滴度測定:在24孔培養板中，按照1×105個/孔接種NIH/3T3細胞(空白對照組)及以pLXSN-LMO3、pLXSN轉染的NIH/3T3細胞(實驗組、陰性對照組)，100 ml/L胎牛血清的DMEM中培養1 d。更換為無血清、無雙抗的DMEM 培養基，分別按照加入 10、102、103、104、105、106倍稀釋的病毒上清及陰性對照上清100μl，最后各加入終濃度為4 mg/L Polybrene。37℃、50 ml/L CO2培養24 h，胰酶消化細胞，按照1∶20稀釋傳代，繼續培養2 d后，加入200 mg/L G418繼續篩選2周。觀察克隆形成情況，最后40 g/L多聚甲醛固定，Giemsa染色，對抗性細胞克隆數計數，以計算病毒滴度，單位以cfu/ml表示。

1.2.4 免疫組化染色檢測NIH/3T3細胞中LMO3的表達:將 NIH/3T3細胞(空白對照組)及感染pLXSN-LMO3、pLXSN的 NIH/3T3細胞(實驗組、陰性對照組)胰酶消化后，在多聚賴氨酸預處理過的蓋玻片上爬片生長24 h。以預冷40 g/L多聚甲醛固定液固定 5 min，室溫晾干。PBS漂洗3次，5 min/次。封閉液(10 g/L BSA+4 ml/L Triton X-100)37℃封閉30 min。加入1∶400稀釋的兔抗人LMO3多克隆抗體37℃孵育2 h。PBS漂洗，加入1∶400稀釋的羊抗兔-TRITC抗體37℃孵育3 h。PBS漂洗，700 ml/L甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Western blot法檢測NIH/3T3細胞中LMO3的表達:以pLXSN-LMO3轉染的NIH/3T3細胞為實驗組，pLXSN轉染的細胞為陰性對照組，NIH/3T3細胞為空白對照組。細胞培養48 h后，胰酶消化收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解液，冰水浴中裂解30 min。用BCA法對樣品蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離。300 mA電轉1 h，將蛋白轉移至 NC膜，脫脂奶粉封閉過夜。TBST清洗3次，5 min/次。分別加入1∶400稀釋的兔抗人LMO3多克隆抗體和β-actin抗體，37℃孵育2 h。TBST清洗，加入1∶500稀釋的羊抗兔-HRP抗體，4℃過夜。TBST清洗后，滴加ECL化學發光試劑，ChemiDoc型化學發光成像系統成像并進行灰度值分析。

2 結果

2.1 逆轉錄表達載體構建及PCR鑒定 對重組逆轉錄病毒載體pLXSN-LMO3經EcoR I及BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，拍照后觀察，獲得了大小約為478 bp的目的條帶;以重組質粒為模板，進行PCR擴增，同樣獲得了大小約為478 bp的陽性目的片段，與引物設計的LMO3大小一致(圖1)。經進一步測序證實基因序列完全正確(GenBank登錄號:AF258348)，測序結果未顯示。

圖2 穩定轉染pA317細胞系建立

2.2 穩定轉染逆轉錄病毒pA317細胞的建立 脂質體轉染pA317包裝細胞后，加入0.9 g/L G418進行抗性篩選，1周后3組細胞均開始出現死亡。2周后，空白對照組細胞基本全部死亡，陰性對照組、實驗組均有少量細胞存活，并形成小克隆，更換G418濃度為0.4 g/L進行穩定篩選，繼續培養3周后形成多個明顯的克隆，見圖2。挑取細胞克隆，有限稀釋于96孔板，繼續加入0.4 g/L的G418培養，待形成單克隆后，進行擴增培養并穩定傳代。

圖1 重組質粒pLXSN-LMO3鑒定

2.3 逆轉錄病毒滴度的測定 轉染后的pA317細胞經G418穩定篩選后陰性對照組、實驗組分別獲得了11個和23個較大的單克隆。有7株pLXSNLMO3和3株pLXSN為高產毒株。實驗組病毒滴度為(4.04±1.87)×106cfu/ml，陰性對照組病毒滴度為(6.81±2.11)×106cfu/ml。

2.4 免疫組化染色檢測 NIH/3T3細胞中LMO3的表達，鏡下觀察發現:實驗組可見明顯的強紅色熒光，主要集中在細胞核內，在核周亦見少量的分泌表達;而陰性對照組及空白對照組僅有極個別細胞可見到極弱熒光，且熒光分布在整個細胞內，應為熒光染料非特異性染色所致。見圖3。

圖3 感染后NIH/3T3細胞免疫熒光組化染色(TRITC×200)空白對照組、陰性對照組、實驗組為NIH/3T3細胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3轉染的NIH/3T3細胞

2.5 Western blot法檢測NIH/3T3細胞中LMO3的表達情況 3組均可見大小約為18 kD的單一蛋白免疫反應條帶，與文獻報道的LMO3蛋白分子大小一致，見圖4。以β-actin為內參照，通過成像分析軟件分析3組LMO3的相對于β-actin的表達量，實驗組(1.100±0.082)相對于陰性對照組(0.093±0.005)和空白對照組(0.104±0.008)高表達LMO3蛋白，差異均有統計學意義(P＜0.05)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖4 Westernblot法檢測感染pLXSN-LMO3病毒NIH/3T3細胞LMO3的表達空白對照組、陰性對照組、實驗組為NIH/3T3細胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3轉染的NIH/3T3細胞

3 討論

LMO為LIM蛋白家族成員，該類蛋白是一種蛋白相互作用的適配器，其LIM結構域在不同組織、器官及生物的不同發育時期可與核內廣泛分布的LIM結構域結合蛋白(Ldb)及其他的轉錄調節因子結合形成轉錄復合體，進而調控特定的下游靶基因的表達［3-5］。LMO蛋白家族成員包括 LMO1～4，在胚胎的神經系統形成、腦發育和紅細胞的生成等過程中擔當重要角色，并且與成神經細胞瘤等腫瘤的發生和發展密切相關［6］。LMO1和LMO2最早發現于急性T細胞白血病(T-ALL)時，被轉位至染色體上T細胞受體位點，是T細胞癌蛋白［7-8］。LMO4特異性分布在乳腺中，主要作用是抑制乳腺表皮細胞的分化，與乳腺癌的發生、增殖以及預后都有密切的關系［9-11］。LMO3主要廣泛存在于腦、脊髓腹側、三叉神經元、視網膜等組織中，主要調控中樞神經系統細胞的發育和分化，同時參與成神經細胞瘤等腫瘤的形成和轉錄調控［12-17］，但是關于LMO3更多的生物學功能有待進一步的研究。

逆轉錄病毒載體系統是目前應用最廣泛的基因轉移系統，逆轉錄病毒具有相當高的感染效率，分裂期的靶細胞幾乎可以100%地被轉染，且外源性基因可以整合到靶細胞染色體中，在靶細胞內穩定表達。該系統具有寄主廣泛、導入基因拷貝數多、免疫原性較低、轉染效率高、外源基因表達穩定等優點［18］。

本研究中選取的逆轉錄病毒載體pLXSN是由Miller等在逆轉錄病毒載體N2基礎上構建的新一代載體，獲美國FDA臨床試驗許可證［19-20］。采用直接連接方式構建重組病毒，不需進行空斑化，避免了陰性重組病毒，提高了重組效率。含有多個克隆位點，降低了同源重組的概率，使基因轉移隱患降低，具有較高的安全性。在構建過程中，其導入的外源基因上游含有啟動子，下游連接終止密碼子，可形成完整而穩定的表達框，既可經過包裝后瞬時表達，產生較高滴度的重組病毒顆粒，同時又因帶有Neo基因，在G418穩定篩選的作用下，感染細胞可以持久存活并且持續表達外源目的基因蛋白，而且因其不表達任何具有免疫原性的病毒蛋白，所以引起機體的免疫反應低［21］。

本實驗成功構建了重組逆轉錄表達載體pLXSN-LMO3，PCR和雙酶切鑒定其目的基因LMO3導入正確，經測序檢測基因序列未見有插入、重排、缺失等突變。通過脂質體轉染成功導入了包裝細胞系pA317，經G418長時間穩定篩選獲得了多株穩定表達的單克隆高產毒細胞株，其病毒平均滴度為4.04×106cfu/ml，最高滴度為 1.24 ×107cfu/ml。重組逆轉錄表達載體pLXSN-LMO3構建正確，且成功感染NIH/3T3細胞，免疫熒光組化染色觀察，可在靶細胞核內合成、表達及分泌LMO3蛋白。Western blot實驗進一步證實了感染的靶細胞高表達LMO3蛋白，與陰性對照組和空白對照組比較差異顯著。

綜上所述，本實驗得到了穩定感染逆轉錄病毒載體介導的LMO3的NIH/3T3細胞，并且對表達產物LMO3進行了檢測，為下一步研究LMO3的生物學功能、腫瘤細胞體外實驗及其基因治療等方面奠定了基礎。

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Construction of Recombinant Retroviral Vector Carrying LMO3 Gene and Its Expression in NIH/3T3 Cells

LUO Yun，ZHANG Xin-yu，WAN Dong-jun，LIU Xiao-hua，FU Xue-feng(Departmentof CadreWards，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo construct recombinant retroviral vector carrying LIM domain only 3(LMO3)gene and study its expression in NIH/3T3 cells.MethodsThe retroviral vector pLXSN-LMO3 was identified by restriction enzyme analysis and DNA sequencing analysis，and then was transfected into retrovirus packaging cell line pA317，and G418 was used to select stable virus-producing cell lines.The recombinant retroviruswas used to infect NIH/3T3 cells in vitro，and the value of viral titerwas determined.The NIH/3T3 cellswere divided into three groups:experimental group(infected with the pLXSN-LMO3)，negative control group(infected with the pLXSN)and control group.The expression of LMO3 in NIH/3T3 cells was identified by the immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods.ResultsThe pLXSN-LMO3 recombinant retroviral vector had been constructed correctly by restriction enzyme analysis and sequencing analysis，and the value of titer assayed on NIH3T3 cellswas up to an average of 4.04×106cfu/ml.LMO3 albumen expression was detected in NIH/3T3 cells using immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods，and LMO3 was highly expressed in experimental group，and the differences in LMO3 expression were statistically significantwhen compared with those in negative control group and control group(P＜0.05).ConclusionThe recombinant retroviral vector carrying LMO3 gene has been constructed successfully，which can highly express LMO3 in NIH/3T3 cells and has potential utility in further gene therapy.

LIM domain only 3;NIH/3T3 cell;Retroviridae infection;pLXSN

R512.99

A

2095-140X(2014)05-0022-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.05.006

甘肅省自然科學基金資助項目(1107RJZA106)

730050蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院干部病房

付學鋒，E-mail:lkyyfxf@126.com

2013-12-16 修回時間:2014-01-28)

藥物分析
·論著·